ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Η ΕΠΙΡΡΟΗ ΤΟΥ pH ΣΤΗ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΗ ΚΑΙ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΤΟΥ ΦΩΣΦΟΓΛΥΚΕΡΙΝΙΚΟΥ Μπατάλα Μαγδαληνή - Παυλίνα Ντελλάκη Ειρήνη - Αικατερίνη Σκιάνη Σωτηρία

ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΚΙΝΑΣΗ ΤΟΥ ΦΩΣΦΟΓΛΥΚΕΡΙΝΙΚΟΥ (hPGK1-hPGK2) Τι είναι η hPGK1; Γλυκολυτικό ένζυμο – Παραγωγή ΑΤΡ Γιατί μας ενδιαφέρει η μελέτη του; Συσχέτιση με παθολογικές καταστάσεις - Πειραματικές δοκιμασίες για επαλήθευση Πιο συγκεκριμένα, στο εν λόγω πείραμα η μελέτη έγινε σε επίπεδο θερμοδυναμικής και κινητικής σταθερότητας καθώς και ως προς τους μετουσιωτικούς μηχανισμούς.

ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ Μείωση θερμοδυναμικής σταθερότητας σε pH κάτω του 6 (διάγραμμα C). Θερμοδυναμική αποσταθεροποίηση 6 kcal/mol (pΗ 5 σε σύγκριση με pH 7) οφείλεται στη μείωση της συγκέντρωσης ουρίας στο μισό (διάγραμμα D).

Μηχανισμός τριών καταστάσεων: N ↔ U F ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΗΣ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΤΗΝ ΚΙΝΗΤΙΚΗ Μηχανισμός τριών καταστάσεων: N ↔ U F Η μείωση της κινητικής σταθερότητας μπορεί να εξηγηθεί από μια μεγάλη μείωση στην θερμοδυναμική σταθερότητα προς το ολικό ξεδίπλωμα. Η ισορροπία / κινητικό ξεδίπλωμα υποστηρίζει πειραματικά ότι: Η θερμοδυναμική σταθερότητα καθορίζει σε μεγάλο βαθμό την κινητική σταθερότητα σε μία περιοχή pΗ 5-8 και σε χαμηλότερο pΗ το ένζυμο υποβάλλεται σε μερική μετουσίωση.

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ Μελέτες με DSC για την θερμική σταθερότητα της hPGK1 : Tm και Ea σχετικά σταθερές σε pH 5,5-8,0 - Μείωση σε χαμηλότερες τιμές pH. Η ταυτόχρονη μείωση της Tm και της Ea σε όξινο pH  μεγάλη κινητική αποσταθεροποίηση του ενζύμου εξ αιτίας θερμικής μετουσίωσης.

ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ DSC Επιπλέον αναλύσεις με DSC παρουσία ουρίας  γραμμική εξάρτηση της κινητικής σταθερότητας από την συγκέντρωση της ουρίας. Συνεπώς: Η επιφάνεια του ενζύμου που εκτίθεται κατά το μεταβατικό στάδιο της μετουσίωσης δεν επηρεάζεται από το pH. Οι αλλαγές των ενθαλπιών ενεργοποίησης μένουν ανεπηρέαστες.

ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Θερμότητα – Χημικές ουσίες – Ακτινοβολία Επαγωγή θερμότητας και μελέτη των συσχετιζόμενων τιμών Ea, ΔG και ΔH – Επώαση σε διάλυμα ουρίας και μελέτη μέσω φασματοσκοπίας φθορισμού εκπομπής τρυπτοφάνης. Η φυσιολογική κατάσταση της hPGK1 βρίσκεται σε ισορροπία με την εκτυλιγμένη (Ku). Η εκτυλιγμένη μορφή μπορεί να μετουσιωθεί σε μια τελική μορφή (final state), μια μονόδρομη μεταβολή της δομής που εκφράζεται με τη σταθερά Kirr. http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/c8.5x23.denaturation.jpg

ΘΕΡΜΟΤΗΤΑ Βασίζεται στο «σπάσιμο» δεσμών υδρογόνου και μη πολικών υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων. Αιτία: αύξηση της θερμότητας προκαλεί αύξηση της κινητικής ενέργειας και συνεπώς της μοριακής δόνησης σε σημείο ρήξης του δεσμού. Συσχέτιση με μεταβολή του pH. Παρατηρήθηκε πως pH μεταξύ των τιμών 5-8 αποτελεί περιβάλλον μέγιστης κινητικής και θερμοδυναμικής σταθερότητας – δύσκολη μεταβολή της δομικής κατάστασης. Εκτός των τιμών; Η θερμική σταθερότητα της hPGK1 σε διαφορετικές τιμές pH. Ανάλυση σε ρυθμό 4°C/min.

ΕΠΩΑΣΗ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ ΟΥΡΙΑΣ Σε πειράματα: η hPGK1 αναμείχθηκε με διάλυμα ουρίας αυξανόμενης συγκέντρωσης σε σταθερή θερμοκρασία 25°C. Απότομη μεταβολή συγκέντρωσης ουρίας  σύντομη εκτύλιξη της φυσιολογικής μορφής  προσδιορισμός της σταθεράς εκτύλιξης σε μηδενική συγκέντρωση αποδιατακτικού παράγοντα 𝑘 𝑈(0𝑀) . Τα μόρια της ουρίας δρουν ως αποδιατακτικές ουσίες επεμβαίνοντας στην τριτοταγή δομή και ενυδατώνοντάς τη. Η ουρία αποδυναμώνει τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και ενισχύει την αποδιάταξη και μέσω των δυνάμεων Van der Waals. Αύξηση διαλυτότητας πλευρικών ομάδων. Η μικρή μεταβολή της ισορροπίας υποδεικνύει ότι το μοντέλο των δύο μορφών αποτελεί μια καλή περιγραφή της αντιστρεψιμότητας της αποδιάταξης της hPGK1 σε διαφορετικά pH.

ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ hPGK1 - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Προφίλ «ενεργειακής συμπεριφοράς» φυσιολογικής μορφής  συμπέρασματα για την παθολογική Κληρονομίσιμες ασθένεις (π.χ. ασθένεια αποθήκευσης γλυκογόνου) Σχεδιασμός κατάλληλης θεραπείας αντιμετώπισης

ΣΑΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΟΥΜΕ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ!

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ “Virtual Chembook”, El mhurst College, Charles E. Ophard, c.2003 http://chemistry.elmhurst.edu/vchembook/568denaturation.html The molecular basis for the chemical denaturation of proteins by urea. Bennion BJ, Daggett V Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 29; 100(9):5142-7 Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.Hua L, Zhou R, Thirumalai D, Berne BJ Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Nov 4; 105(44):16928-33. pH-dependent relationship between thermodynamic and kinetic stability in the denaturation of human phosphoglycerate kinase 1 Angel L. Pey