Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR Η μέθοδος PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη γιατί επιτρέπει την γρήγορη ανάλυση ειδικών περιοχών DNA που περιέχονται σε ένα μικρό δείγμα. Ήδη χρησιμοποιείται ως διαγνωστική μέθοδος στη γενετική του ανθρώπου για ανίχνευση γενετικών ασθενειών και πρώτων σταδίων ιϊκών μολύνσεων (π.χ. έγκαιρη διάγνωση ΑΙDS) και στην εγκληματολογία με το γενετικό αποτύπωμα. Στη βασική έρευνα χρησιμοποιείται για την απομόνωση και κλωνοποίηση σπάνιων γονιδίων από ελάχιστες ποσότητες DNA (ακόμη και από ένα κύτταρο). Χρησιμοποιείται στην ανάλυση ποικιλομορφίας νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και στην in vitro μεταλλαξιγένεση.

PCR H PCR βασίζεται σε συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της αντιγραφής του DNA. H DNA πολυμεράση είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας καινούργιας συμπληρωματικής ως προς αυτό αλυσίδας κατά την κατεύθυνση 5’-3’ (από το καρβόξυ- προς το αμινοτελικό άκρο), ξεκινώντας όμως από ένα τμήμα του μορίου που είναι δίκλωνο. Το DNA αποδιατάσσεται κοντά στο σημείο βρασμού. Το σημείο έναρξης της σύνθεσης του DNA μπορεί να καθοριστεί με την παροχή ενός ολιγονουκλεοτιδίου (εκκινητής, primer) συμπληρωματικό ως προς μια δεδομένη αλληλουχία του αντιγραφόμενου κλώνου, το οποίο υπό κατάλληλες συνθήκες υβριδίζεται στο σημείο έναρξης της αντιγραφής. Πρέπει να επιλεγούν κατάλληλοι εκκινητές έτσι ώστε να υβριδίζονται ένθεν και ένθεν της περιοχής του DNA.

Εκτέλεση της αντίδρασης PCR Για να γίνει μια αντίδραση PCR απαιτούνται δύο εκκινητές τα οποία κατευθύνουν τα σημεία έναρξης αντιγραφής, το ένζυμο (μια DNA πολυμεράση) και ένα μίγμα 4 δεόξυ-νουκλεοτιδίων (dNTPs = dATP + dTTP + dCTP +dGTP). To μίγμα θερμαίνεται στους 94 ο για 5 περίπου λεπτά. Σε αυτή τη φάση το DNA αποδιατάσσεται και οι μονόκλωνες αλυσίδες που σχηματίζονται θα αποτελέσουν τα καλούπια αντιγραφής για την πολυμεράση. Στη συνέχεια η θερμοκρασία του μίγματος ελαττώνεται ώστε τα ολιγονουκλεοτίδια να υβριδιστούν με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες στα μονόκλωνα μόρια του DNA. Σε αυτό το στάδιο η θερμοκρασία και ο χρόνος παίζει ρόλο στο καθορισμό της εξειδίκευσης της αντίδρασης.

Εκτέλεση της αντίδρασης PCR Το άριστο σημείο δράσης του ενζύμου που έχει απομονωθεί η DNA πολυμεράση και ονομάζεται Taq πολυμεράση είναι 72 ο. Η θερμοκρασία διατηρείται σταθερή για 5 λεπτά περίπου ώστε να υπάρχει χρόνος για την αντιγραφή (elongation). Ξαναγίνεται επαναθέρμανση στους 94 ο για λίγα δευτερόλεπτα αυτή τη φορά έτσι ώστε τα μικρά δίκλωνα μόρια που παρήχθησαν να αποδιαταχτούν και να αποτελέσουν μόρια έναρξης για ένα ακόμα κύκλο αντιγραφής. Ο αριθμός των κύκλων αντιγραφής κυμαίνεται από 30 έως 45. Σε κάθε κύκλο διπλασιάζεται ο αριθμός των αντιγράφων που αντιστοιχούν στην αλληλουχία που βρίσκεται ανάμεσα στις θέσεις που υβριδοποιούνται τα δύο ολιγονουκλεοτίδια. Έτσι το τελικό προϊόν προκύπτει από την εκθετική αύξηση του DNA και δίνεται από τον τύπο P=2 n.

Taq πολυμεράση Αρχικά η DNA πολυμεράση της E. coli χρησιμοποιήθηκε για την PCR αλλά το ένζυμο είναι θερμοευαίσθητο και καταστρέφεται σε υψηλές θερμοκρασίες. Με την ανακάλυψη όμως βακτηρίων που αναπτύσσονται σε θερμές πηγές απομονώθηκαν ένζυμα που δρουν αποτελεσματικά σε υψηλές θερμοκρασίες. Το βακτήριο Τhermus aquaticus ζει στο νερό σε θερμοκρασία 75 ο. Η DNA πολυμεράση που απομονώνεται από αυτό έχει άριστη θερμοκρασία δράσης 72 ο και παραμένει σταθερή ακόμα και στους 94 ο. Η ανακάλυψη αυτή επέτρεψε την αυτοματοποίηση της PCR, με χρήση κυκλικών εναλλακτών θερμότητας, οι οποίοι προγραμματίζονται κατάλληλα για τις θερμοκρασίες και τους χρόνους αντίδρασης. Η ακολουθία στόχος που παράγεται μπορεί να αναλυθεί σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης ύστερα από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο.

Πειραματική διαδικασία Χρησιμοποιούμε πλασμιδιακό φορέα (pAN7) στον οποίο έχει εισαχθεί το γονίδιο της κιτρικής συνθάσης. Στόχος είναι να ενισχυθεί η περιοχή του γονιδίου με PCR. Κατόπιν θα αναλυθεί το δείγμα με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Αντιδραστήρια PCR: 1.DNA (πλασμιδιακό pAN7) 2.DNA εκκινητές F: και R: 1.Δεοξυνουκλεοτίδια 2.ΜgCl2 3.Ρυθμιστικό διάλυμα 4.Taq DNA polymerase 5.H20

Επιλογή εκκινητών Πρέπει να έχουν μήκος νουκλεοτίδια Η περιεκτικότητα σε GC να είναι %. Το 3’ άκρο να τελειώνει σε G ή C ή GC. H θερμοκρασία υβριδοποίησης να είναι Τm= 50-60o Τα 3’ άκρα δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικά για να μην δημιουργούνται διμερή τα οποία θα υπερισχύσουν έναντι οποιουδήποτε άλλου προϊόντος. Να αποφεύγεται η συμπληρωματικότητα του ίδιου του εκκινητή, καθώς μπορεί να σχηματιστούν δευτερογενείς δομές όπως βρόχοι (hairpins). Περισσότερα από 3C ή 3G στο 3’ άκρο μπορεί να προκαλέσει λάθος υβριδοποίηση σε περιοχές πλούσιες με G ή C καθώς οι δεσμοί είναι πολύ ισχυροί και η υβριδοποίηση πολύ πιο σταθερή. 5’- GGGAAAATTCCAGGATCTAT-3’, 5’- GGGAAATTCTAGGGTCTAT- 3’

Real –Time PCR Η real- time pcr οφείλει το ονομά της στη δυνατότητα να παρακολουθεί κανείς την αύξηση του DNA καθώς αυτό πολλαπλασιάζεται. Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση φλουροχρωμάτων και τα δεδομένα μπορούν να αναλυθούν από πρόγραμμα υπολογιστή που υπολογίζει τη σχετική έκφραση των γονιδίων σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Μια χρωστική που προσδένεται στα δίκλωνα μόρια του DNA στην PCR, προκαλεί φθορισμό. Η αύξηση της ποσότητας του DNA- προϊόντος έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης φθορισμού η οποία καταγράφεται σε κάθε κύκλο, επιτρέποντας τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του DNA.

Αντίδραση real-time pcr