Η συμβολή του Βιοχημικού Εργαστηρίου. «Νεότεροι δείκτες καρκίνου: ΗΕ4 και ProGRP.» Λ.Κυρίου-Μάλλη, PhD, EurClinChem, Χημικός Βιοχημικού Εργαστηρίου, ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»

Δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων με τις παρακάτω χορηγούς εταιρείες: MSD, ROCHE HELLAS, PFIZER, SANOFI, AMGEN, ASTELLAS PHARMACEUTICALS, ΒΙΑΝΕΞ, MEDRONIC, TEVA, ELPEN, ABBOTT, BAXTER, BOEHRINGER INGELHEIM, COLOPLAST, GENESIS PHARMA, GLAXOSMITHKLINE, NOVARTIS, ROCHE DIAGNOSTICS, DEMO 19 ο Ετήσιο Σεμινάριο Σ. Ι. Ε. Γ.Ν. Α. «Ο ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ» Φεβρουαρίου 2014

Επιθηλιακός Καρκίνος Ωοθηκών (ΕΚΩ) Η πενταετής επιβίωση ασθενών με ΕΚΩ παραμένει 38%, παρά την πρόοδο των χειρουργικών και χημειοθεραπευτικών παρεμβάσεων. CA Περιορισμοί  Χαμηλή ευαισθησία σε πρώιμο στάδιο  Πιθανή αύξηση και σε άλλους τύπους καρκίνου (μαστού, παγκρέατος, παχέος εντέρου, πνεύμονα και ενδομητρίου)  προ εμμηνόπαυσης αύξηση σε  ενδομητρίωση, αιμορραγική κύστη, φλεγμονώδη νόσο της πυέλου,  ωορρηξία, εγκυμοσύνη. Ο οργανισμός ΑCOG συστήνει την παραπομπή ασθενών σε γυναικολόγο-ογκολόγο εάν το CA125  > 200 U/mL (προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες)  > 35 U/mL (μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες) Ζητούμενο: -Ανίχνευση του ΕΚΩ σε πρώιμο στάδιο -Διάκριση προεγχειρητικά μεταξύ καλοήθους και κακοήθους εξαρτηματικής νόσου Στόχος : Η ταυτοποίηση νέων δεικτών καρκίνου για τον ΕΚΩ, πέραν του CA 125.

ΔείκτηςΠροτεινόμενη χρήσηΦάση ανάπτυξηςLOE (5) CA125Διαφορική διάγνωση πυελικών μαζώνΑποδεκτός για κλινική χρήσηIII Παρακολούθηση αποτελεσματικότητας χημειοθεραπείας Αποδεκτός για κλινική χρήσηI, II InhibinΑνίχνευσηΑξιολόγησηIV HLA-GΔιαφορική διάγνωσηΈρευνα/ανακάλυψηV TATIΠαρακολούθηση όγκουΈρευνα/ανακάλυψηIV, V CASAΠαρακολούθηση όγκου, Πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηIV TPAΠαρακολούθηση όγκουΈρευνα/ανακάλυψηIV CEAΠαρακολούθηση όγκουΈρευνα/ανακάλυψηIV LPAΑνίχνευσηΑξιολόγησηIV, V PAI-1Πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηV Interleukin-6Πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηIV Kallikreins 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15 Διαφορική διάγνωση, Παρακολούθηση όγκου, Πρόγνωση πρόβλεψη Έρευνα/ανακάλυψηIV, V hCGβcfΠρόγνωση πρόβλεψηΑξιολόγησηIII, IV ProstasinΔιαφορική διάγνωσηΈρευνα/ανακάλυψηIV OsteopontinΠαρακολούθηση όγκουΈρευνα/ανακάλυψηIII, IV HE4 Διαφορική διάγνωση πυελικών μαζών, παρακολούθηση θεραπείας Κλνική χρήση σε ωρισμένα κέντρα III, IV Mitogen-activated protein kinase Ιστικός δείκτης για πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηV IGFBP-2Πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηIV RSF-1Πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηV NAC-1Πρόγνωση πρόβλεψηΈρευνα/ανακάλυψηV Δείκτες καρκίνου των ωοθηκών

ΗΕ4 (Human epididymis protein 4)/WFDC2 Το γονίδιο WFDC2, ταυτοποιήθηκε με τεχνικές cDNA microarrays (2000) να υπερεκφράζεται σε καρκινώματα ωοθήκης, αλλά όχι στον φυσιολογικό ιστό. Το γονίδιο WFDC2 βρέθηκε ταυτόσημο με το γονίδιο ΗΕ4 ανθρώπινης επιδιδυμίδας (1991) ΗΕ4 (WFDC2) γονίδιο: Ανήκει σε οικογένεια 14 ομόλογων γονιδίων εντοπιζόμενων στο χρωμόσωμα 20q που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με «πυρήνα 4 δισουλφιδικών δεσμών» WFDC: WAP-type Four Disulphide Core Domain, WAP= Whey Acidic Protein

Σύγκριση επιπέδων έκφρασης 30 επιλεγμένων γονιδίων σε φυσιολογικούς (μπλε-4 δείγματα) και κακοήθεις (κόκκινο-24 δείγματα) ιστούς ωοθηκών. Welsh et al. PNAS 2001

Πρωτεΐνες WFDC - με WAP περιοχές Δραστικότητα  μικρά, εκκριτικά μόρια,  δραστικότητα αναστολέων πρωτεασών σερίνης και  εκκρίνονται από προφλεγμονώδη κύτταρα, πχ. o ελαφίνη (Peptidase Inhibitor 3-PI3) o SLPI (Secretory Leucocyte Protease Inhibitor) o πρωτεΐνες του σπέρματος semenogelin 1και 2 (SEMG1, SEMG2) o ΗΕ4 (δεν διαθέτει ενεργότητα αναστολέα πρωτεασών ? ) Έκφραση: στο επιθήλιο του ανώτερου αναπνευστικού, του αναπαραγωγικού και του ουροποιητικού συστήματος. Ρόλος Τα γονίδια του γενετικού τόπου WFDC συντηρούνται μεταβαλλόμενα δια μέσου των ειδών. Πιθανός ρόλος : στην φυσική ανοσία (αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδης δράση), στην ιστική ομοιόσταση και την αναπαραγωγή.

Πρωτεΐνη HE4 μέγεθος 13 Kd μονή πεπτιδική άλυσος, περιέχουσα δύο περιοχές (domains) WFDC, η ώριμη γλυκιωμένη μορφή της φθάνει τα Kd. η γλυκιωμένη ΗΕ4 είναι το μόριο που εκκρίνεται στον εξωκυττάριο χώρο στα καρκινώματα ωοθηκών- όχι όμως στον φυσιολογικό ιστό Η πρωτεΐνη ΗΕ4 υπερεκφράζεται κύρια στους ιστολογικούς τύπους ορώδους (30-70% ΕΚΩ) και ενδομητροειδούς (10-20% ΕΚΩ) επιθηλιακού καρκίνου ωοθηκών. Στο Βιοχημικό Εργαστήριο η ΗΕ4 προσδιορίζεται με ανοσοανάλυση χημειοφωταύγειας με παραμαγνητικά μικροσωματίδια (CMIA, Chemiluminescent Microparticle Immunoassay) στον ανοσοχημικό αναλυτή Architect i2000SR, Abbott, σε μονάδες pmol/L. 95% υγιών προεμμηνοπαυσιακών γυναικών : ΗΕ4 < 70 pmol/L, 95% υγιών εμμηνοπαυσιακών γυναικών : ΗΕ4 < 140 pmol/L. Η εξέταση ΗΕ4 ορού έχει λάβει έγκριση του FDA προς χρήση για παρακολούθηση υποτροπής ή εξέλιξης της νόσου σε ασθενείς με ΕΚΩ.

Κλινική χρήση του δείκτη ΗΕ4 Περιορισμοί  Νεφρική ανεπάρκεια → αύξηση επιπέδων ΗΕ4 Οξεία νεφρική ανεπάρκεια είναι δυνατόν να παρατηρηθεί σε ορισμένους ασθενείς κατά την χημειοθεραπεία.  Προσυμπτωματικός πληθυσμιακός έλεγχος (screening) για ΕΚΩ, σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου.  Αύξηση και σε άλλους τύπους καρκίνου (ενδομητρίου, ΜΜΚ-ΚΠ, πρωτοπαθής καρκίνος ήπατος) Πλεονεκτήματα  Η ΗΕ4 ΔΕΝ επηρεάζεται, όσο το CA 125, από την εμμηνόπαυση ή τις φάσεις του κύκλου της εμμήνου ρύσεως → ΗΕ4 πλεονεκτεί στη διαφορική διάγνωση γυναικολογικών νοσημάτων στις προεμμηνοπαυσιακές ασθενείς

Διάγραμμα ROC (Receiver Operating Characteristic) και Eμβαδόν AUC (Area Under Curve) Σύγκριση CA 125 και HE4 ορού στη διάκριση ασθενών με ΕΚΩ και καλοήθη γυναικολογικά νοσήματα. Hamed et al. Diagnostic Pathology 2013, 8:11.

Ευαισθησία δεικτών στο Στάδιο Ι ΕΚΩ Ευαισθησία (%) σε Δείκτες ROC-AUC (%)95% Ειδικότητα98% Ειδικότητα CA HE SMRP CA CA125+HE CA125+SMRP CA125+CA CA125+HE4+CA Ο δείκτης HE4 μόνος του διαθέτει την υψηλότερη ευαισθησία στην ανίχνευση του Επιθηλιακού Καρκίνου Ωοθηκών Σταδίου Ι σε πληθυσμό γυναικών με εξαρτηματική μάζα. Moore RG et al. Gynecol Oncol 2008;108: SMRP=Soluble mesothelin-related peptide

Μαθηματικοί τύποι υπολογισμού του αλγορίθμου ROMA ασθενών πρό και μετα εμμηνόπαυση ROMA = exp(PI) / [1 + exp(PI)] *10 Πρό εμμηνόπαυσης: Predictive Index (PI) = *LN[HE4] *LN[CA 125] Μετα εμμηνόπαυση: Predictive Index (PI) = *LN[HE4] *LN[CA 125] Moore RG et al. Gynecol. Oncol ROMA: Risk of Ovarian Malignancy Algorithm -Έγκριση του FDA Προσμετρά το CA 125, την ΗΕ4 και την εμμηνοπαυσιακή κατάσταση. Διαστρωμάτωση ασθενών με εξαρτηματική μάζα σε ομάδες χαμηλού και υψηλού κινδύνου για ΕΚΩ

Σύγκριση αποτελεσματικότητας ROMA, ΗΕ4 και CA125 στην διαφορική διάγνωση ΕΚΩ και καλοήθους γυναικολογικής νόσου Molina R. Tumor Biology 2011

Καρκίνος του Πνεύμονα (ΚΠ) Η πενταετής επιβίωση ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (ΚΠ) παραμένει στο 13% δύο κύριοι ιστολογικοί τύποι: μικροκυτταρικός (ΜΚ-ΚΠ) και μη-μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα (ΜΜΚ-ΚΠ) Η πλειονότης των ΚΠ είναι μικτής ιστολογίας ΜΜΚ-ΚΠ 3 μείζονες ιστολογικοί υπότυποι (αδενοκαρκίνωμα, επιθηλιακό καρκίνωμα εκ πλακωδών κυττάρων, μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα) χειρουργική αντιμετώπιση Συνηθέστεροι ΔΚ ΜΜΚ-ΚΠ είναι το CEA, το SCC και οι κυτταροκερατίνες (TPA CYFRA 21.1). ΜΚ-ΚΠ επιθετικό νεόπλασμα, νευροενδοκρινούς διαφοροποίησης, ταχείας ανάπτυξης υψηλή ευαισθησία στην χημειο- και την ακτινοθεραπεία NSE : δείκτης 1 ης επιλογής για τον ΜΚ-ΚΠ, συσχετίζεται με στάδιο νόσου, Σημαντικό μειονέκτημα: η ψευδώς θετική αύξησή της στον ορό, ακόμη και παρουσία ελαφρώτατης αιμόλυσης.

GRP (gastrin- releasing peptide)-Εκλυτικό πεπτίδιο γαστρίνης  αρχικά απομονώθηκε από στόμαχο χοίρου και ονομάσθηκε με βάση την συγκεκριμένη βιοδραστικότητα, που πρώτη ταυτοποιήθηκε.  Το GRP των θηλαστικών είναι σε μεγάλο βαθμό ομόλογο με το νευροπεπτίδιο βομβεσίνη των αμφιβίων. Εκφραση Ευρεία κατανομή του GRP. Σημαντική παρουσία στο κεντρικό νευρικό, στο γαστρεντερικό, στο αναπνευστικό σύστημα.

Ρόλος GRP Στο πεπτικό  η ενεργοποίηση της έκκρισης ποικίλων γαστρεντερικών ορμονών και παγκρεατικών ενζύμων και η ρύθμιση της διέλευσης, του μεταβολισμού και συμπεριφοράς του εντέρου. Στον πνεύμονα  αγγειοδιαστολή παράγεται από τα πνευμονικά νευροενδοκρινή κύτταρα (ΠΝΕΚ). Η μεγαλύτερη συγκέντρωση των ΠΝΕΚ (θετικών σε GRP) απαντάται στον εμβρυΪκό πνεύμονα. Φυσιολογικά, τα ΠΝΕΚ (θετικά σε GRP) είναι σχετικά σπάνια μετά την γέννηση, όμως η υπερπλασία ΠΝΕΚ έχει συσχετισθεί με χρόνιες πνευμονικές νόσους Πρόσφατα δεδομένα εμπλέκουν το GRP στην φλεγμονή και την επούλωση τραυμάτων και γενικά σε δράσεις σχετικές με την καρκινογένεση (μορφογένεση, αγγειογένεση, κυτταρική μετανάστευση και κυτταρική προσκόλληση).

Το GRP αποτελεί  ισχυρό μιτογόνο παράγοντα για κυτταρικές σειρές προερχόμενες από κακοήθη νεοπλάσματα παγκρέατος, προστάτου, νεφρού, μαστού, κόλου και ΜΚ-ΚΠ.  Ήδη το 1991 επιβεβαιώθηκε ότι το GRP εκφράζεται στα κύτταρα του ΜΚ-ΚΠ.  Υπερέκφραση του GRP και των υποδοχέων του έχει βρεθεί τόσο σε επίπεδο mRNA, όσο και πρωτε Ϊ νης σε καρκινικούς ιστούς προστάτου, μαστού, παγκρέατος, κόλου, πνεύμονα.

Πρόδρομο μόριο pre-proGRP ↓ προορμόνη proGRP ↓ Πεπτίδιο GRP σειρά πρωτεολυτικών διασπάσεων pre-proGRP  φυσικό (native) GRP(1-27),  θέση αμιδίωσης και διάσπασης με θρυψίνη(28-30),  κοινή σταθερή περιοχή πεπτιδικής προέκτασης(31-98) και  μεταβλητή περιοχή καρβοξυτελικού άκρου (αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος του mRNA). Patel O et al. Endocrinology 2007

 Σταθερότητα του proGRP και ο μεγάλος χρόνος ημιζωής του (t 1/ ημέρες),  Μεγάλη αστάθεια του GRP (t 1/2 ~2 λεπτά), ↓ ανάπτυξη ανοσοχημικών αναλύσεων προσδιορισμού του proGRP που βασίσθηκαν στο ανασυνδυασμένο πεπτίδιο proGRP(31-98) (η περιοχή αυτή δεν εμφανίζει ομολογία με άλλες πρωτεΐνες) ως δείκτη καρκίνου σε  ΜΚ-ΚΠ,  καρκίνο του προστάτη και  μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδή. p Στο Βιοχημικό Εργαστήριο το proGRP προσδιορίζεται με ανοσοανάλυση χημειοφωταύγειας με παραμαγνητικά μικροσωματίδια (CMIA Chemiluminescent Microparticle Immunoassay) στον ανοσοχημικό αναλυτή Architect i2000SR, Abbott, σε μονάδες pg/ml. Το proGRP βρίσκεται στην διαδικασία λήψης έγκρισης από το FDA. το 95% των υγιών ευρίσκεται με επίπεδα <63 pg/ml στον ορό και <65 pg/ml στο πλάσμα.

Κλινική χρήση του δείκτη ProGRP Περιορισμοί:  Προϋπόθεση καταλληλότητας του ορού αποτελεί η φύλαξη στην ψύξη για ολιγοήμερο διάστημα ή η κατάψυξη του δείγματος. Σταθερώτερο στο πλάσμα σε σχέση με τον ορό.  Τα επίπεδα του proGRP συσχετίζονται σημαντικά με: την ηλικία, το φύλο, τον δείκτη μάζας σώματος, το κάπνισμα, τη συγκέντρωση κρεατινίνης Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, συστήνεται το κάθε εργαστήριο να υπολογίζει τις δικές του τιμές αναφοράς. Πλεονεκτήματα: Η μέτρηση ΔΕΝ επηρεάζεται από αιμόλυση.

Επίπεδα ProGRP ορού. Σύγκριση ασθενών με ΜΚ-ΚΠ και άλλα κακοήθη νεοπλάσματα Molina R, et al. Tumor Biol 2004, 25:56-61 Διάμεσες συγκεντρώσεις

Επίπεδα ProGRP  σε υγιή πληθυσμό,  σε καλοήθεις πνευμονικές νόσους (χρόνια φλεγμονή, σαρκοείδωση, ίνωση)  σε ΜΚ-ΚΠ και  σε ΜΜΚ-ΚΠ Oremek GM et al.Anticancer Res

ProGRP – δείκτης με υψηλή ειδικότητα για ΜΚΚΠ Molina R et al. Cancer Biomarkers 2008 Για αφοριστικό όριο pg/ml, η ειδικότητα του ProGRP είναι >95% για ΜΚ-ΚΠ

Ως δείκτης καρκίνου για τον ΜΚ-ΚΠ, το proGRP: (1). Δεν συσχετίζεται με το στάδιο νόσου, υψηλά επίπεδα στον ορό σε εντοπισμένη, και σε προχωρημένη νόσο. → διαγνωστικό πλεονέκτημα έναντι NSE. Θεωρείται ότι είναι μεταξύ τους συμπληρωματικοί δείκτες. Ανεξάρτητα από την ιστολογική διάγνωση του όγκου, υψηλά επίπεδα proGRP στον ορό υποδηλώνουν τουλάχιστον μερική παρουσία νευροενδοκρινικής συνιστώσας. (2). Σε πρόσφατη μετα-ανάλυση 22 αρθρων, που συνολικά αφορούσαν 6759 ασθενείς με ΚΠ, εμφανίζει ως προς τον ΜΚ-ΚΠ συγκεντρωτική (pooled) διαγνωστική ευαισθησία 72% και συγκεντρωτική διαγνωστική ειδικότητα 93%. Δηλ. το proGRP αδυνατεί να διαγνώσει το 28% των ΜΚ-ΚΠ, το ποσοστό των εσφαλμένων διαγνώσεων είναι μόνο 7%.

Ευχαριστώ πολύ!