ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΓΠΑ  Σωτηρία Φούσια  Α17310  ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ  Επιβλέπων καθηγητής: Τσιτσιγιάννης Δημήτριος

Πειραματική άσκηση 1 «Επίδραση των αιθερίων ελαίων στην ανάπτυξη του μύκητα Aspergilus flavus και στην παραγωγή αφλατοξίνων»

Ασχοληθήκαμε με τα εξής στελέχη του Aspergilus flavus που παράγουν αφλατοξίνες  Alf 3 a  Γ A - 1 Τα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: 1) ODI (6ml) 2) CRS (4.5 ml) 3) SOF (5ml) 4) MOF (2ml) 5) IVI (5ml) 6) HOF (2ml) 7) OVU (5-6ml)

 Οι αφλατοξίνες αποτελούν τοξικούς μεταβολίτες των μυκήτων Aspergillus flavus και Aspergillus parasiticus και είναι από τις πρώτες μυκοτοξίνες που ταυτοποιήθηκαν και απασχόλησαν την επιστημονική κοινότητα. Η κατανάλωση των αφλατοξινών από τον άνθρωπο ή τα ζώα, μέσω της τροφής, οδηγεί σε διαταραχή της φυσιολογικής λειτουργίας του οργανισμού. Οι διαταραχές που προκαλούν οι αφλατοξίνες, όπως και άλλες μυκοτοξίνες, έχουν επιπτώσεις στις αποδόσεις των ζώων και στην ποιότητα των προϊόντων που παράγονται. Είναι ιδιαίτερα τοξικές και καρκινογόνες ουσίες.

 Παρασκεύη θρεπτικού υποστρώματος coconut count agar (CCA) το οποίο ευνοεί την ανάπτυξη της αφλατοξίνης.  Για την παρασκευή ενός λίτρου CCA χρησιμοποιήσαμε:  500 gr Ινδική καρύδα  1000 ml απιονισμένο νερό

Διαδικασία πειράματος Τα αιθέρια έλαια φιλτράρονται και τοποθετούνται σε σωληνάκια τύπου Falcon. Με βοήθεια πιπέτας συλλέγεται σε σωληνάκια τύπου Falcon :  1 ml από κάθε αιθέριο έλαιο  18 ml CCA  1ml H 2 O Εκτελούνται δύο επαναλήψεις ώστε σε κάθε έλαιο να αντιστοιχούν 2 falcon, ένα για κάθε στέλεχος του μύκητα.

Συνοψίζοντας: 14 σωληνάκια στα οποία έχουν προστεθεί τα αιθέρια έλαια και ακόμα 2 σωληνάκια τα οποία χρησιμοποιούνται σαν μάρτυρες (στερούνται αιθερίου ελαίου). Σύνολο 16 falcon. Τοποθετούνται σε τρυβλία και διατηρούνται στο ψυγείο.

Στόχος είναι η τοποθέτηση όμοιου αριθμού κονιδίων και από τα δύο στελέχη του μύκητα στα αντίστοιχα τρυβλία. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω αραίωσης και μέτρησης τους στο αιματοκυτταρόμετρο ώστε να ρυθμιστεί η συγκέντρωση κονιδίων σε 10 6 κον/ml.

Στη συνέχεια 100 μl αιωρήματος από κάθε στέλεχος απλώνεται με το spreader στα τρυβλία. Τα τρυβλία τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο 28 C και αναπτύσσεται ο μύκητας.

Μετά από 7 ημέρες επώσης από κάθε τρυβλίο αφαιρέθηκαν με φελλοτρυπητήρα 15 δισκάκια διαμέτρου 0.6 εκ. και τοποθετούνται σε σωληνάκια Falcon. Έπειτα σε κάθε falcon προστίθεται 7.5ml χλωροφόρμιο και γίνεται vortex για ένα λεπτό. Τα falcon τοποθετούνται στην επαγωγό για ένα βράδυ. Την επόμενη μέρα έγινε φυγοκέντρηση και συλλογή του υπερκειμένου από κάθε σωληνάκι σε καινούργια falcon τα οποία αφέθηκαν ανοιχτά στην απαγωγό εστία να εξατμιστεί το χλωροφόρμιο. Εξαγωγή αφλατοξινών

Προετοιμασία TLC plate. Με χάρακα και μολύβι ορίσαμε τις αποστάσεις του TLC plate που χρησιμοποιήσαμε, καθώς και τα σημεία που εγχύθηκαν οι ποσότητες από το κάθε βαζάκι. Σε κάθε βαζάκι προσθέσαμε 100 μl χλωροφόρμιο και στην συνέχεια το ανακινήσαμε με το vortex. Ύστερα μεταφέραμε 10μl διαλυματος από τα βαζάκια στις αντίστοιχες θέσεις στο TLC plate προσεκτικά. Αφού μεταφέραμε τις μικροποσότητες, τοποθετήσαμε το TLC plate μέσα σε γυάλινο δοχείο παρακολούθησης, το οποίο περιείχε 96 ml αιθέρα, 3 ml μεθανόλη και 1 ml αποστειρωμένο νερό.

Μετά από περίπου 1 ώρα η στάθμη έφτασε στην πάνω γραμμή και βγάλαμε το TLC plate από το δοχείο και το αφήσαμε να στεγνώσει σε απορροφητικό χαρτί. Τέλος, σε συνθήκες σκότους και με την χρήση UV λάμπας παρατηρήσαμε ότι η μέθοδος TLC δεν έδωσε αποτελέσματα. Αυτό πιθανόν οφείλεται σε διάφορους παράγοντες που είναι υπό διερεύνηση.

B. Παρασκευή του θρεπτικού υποστρώματος PDA για ανάπτυξη διαφόρων μυκήτων. o 200 gr πατάτας o 1000 ml απιονισμένο H2O o 20 gr δεξτρόζη o 20 gr Agar Πειραματική άσκηση 2

C. Καταμέτρηση συμπτωμάτων ασθενειών βερτισιλλίωσης και φουζαρίωσης σε φυτά μελιτζάνας και τομάτας στο θερμοκήπιο Πειραματική άσκηση 3

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1) Αλέθεται ο ιστός σε υγρό Ν 2 σε γουδί ή σε περίπτωση μικρού ιστού με τη βοήθεια των pestles. 2) Προσθέτεται 1ml trizol και αναδεύεται. 3) Παγώνεται στους -70C ή σε υγρό Ν 2 με σκοπό να διαταραχτούν τα κύτταρα. Αφήνεται το δείγμα για 5min σε θερμοκρασία δωματίου. Πειραματική άσκηση 4 Απομόνωση RNA και RT-PCR με σκοπό τον έλεγχο της έκφρασης PR γονιδίων

4) Προστίθεται 200ml χλωροφόρμιο και αναδεύεται στο Vortex για 15sec. 5) Αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10min τουλάχιστον. 6) Φυγοκεντρείται στις στροφές για 15min στους 4C. 7) Μεταφέρεται το υπερκείμενο σε νέο tube και αναδεύεται. 8) Αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5-10min.

9) Φυγοκεντρείται στις στροφές για 15min στους 4C. 10) Αφαιρείται το υπερκείμενο με την βοήθεια πιπέτας για να μείνει όσο πιο στεγνό γίνεται το pellet και καθαρίζεται με 1ml αιθανόλη 70%. 11) Φυγοκεντρείται στις στροφές για 10min στους 4C. 12) Με την βοήθεια πιπέτας αφαιρείται η αιθανόλη και αφήνεται το pellet να στεγνώσει στο laminair (προσοχή να μην στεγνώσει εντελώς).

13) Προστίθενται 50μl RNAase free water ή DD H 2 O. 14) Έπειτα διαλύεται το pellet. 15) Γίνεται ποσοτικοποίηση: 10D 260 = 40μgRNA/ml. 260/280 η αναλογία πρέπει να είναι 1,8 – 2,0. 16) Τέλος ηλεκτροφορείται 0,5μg RNA σε 1% πήκτωμα αγαρόζης για να ελέγξουμε την ποιότητα και την ποσότητα του.

Σκοπός της RT PCR: Είναι η μετατροπή ενός RNA σε cDNA με σκοπό τον έλεγχο έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Αφού μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις στο nanodrop δηλαδή πόσο ng/ml RNA έχω, ακολουθείται η εξής διαδικασία. 1) Με την απλή μέθοδο των τρίων προκύπτει ότι: x ( γνωστό ) ng στο 1 μl 2000 ng yμl. Αφού βρεθεί το y προστίθεται νερό μέχρι τα 8,5μl και τοποθετείται στην PCR σε συγκεκριμένο πρόγραμμα ή σε υδατόλουτρο στους 70C για 5min. RT PCR

2) Προετοιμάζεται το εξής μείγμα σε πάγο: 2 mM dNTP2μl2μl 30 μΜ oligo dT2μl2μl RNAase inhibitor (40 U/μl)0.5μl Superscript II (50 U/μl)1μl1μl 5X buffer4μl4μl 100mM DTT2μl2μl 3) Έχοντας συνολικό όγκο V = 20μl τοποθετείται στην PCR στους 42C για 90 min ή στους 70C για 10 min.

F. Μεταφύτευση φυτών αραβίδοψης διαφόρων γονότυπων από το σπορείο στο θερμοκήπιο με σκοπό να πραγματοποιηθεί μόλυνση με διάφορα εδαφογενή παθογόνα. Πειραματική άσκηση 5

G. Καταπολέμηση του Aspergillus flavus με μη τοξικογόνα στελέχη. Τοποθετούνται τοξικογόνα και μη στελέχη στο ίδιο τρυβλίο και αφού αναπτυχθούν παρατηρείται αν έχουν μειωθεί οι τοξίνες. Με την βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου μετρούνται τα κονίδια με σκοπό να τοποθετηθεί όμοιος αριθμός τοξικογόνων και μη. Πειραματική άσκηση 6

H. Καθαρισμός και τακτοποίηση θερμοκηπίου. Πειραματική άσκηση 7