Απομόνωση RNA. Εξαγωγή με Φαινόλη - Χλωροφόρμιο Η εξαγωγή με φαινόλη-χλωροφόρμιο χρησιμοποιείται για την απομόνωση DNA, RNA και πρωτεϊνη. Ίσοι όγκοι φαινόλης-χλωροφορμίου αναμιγνύονται και παράγεται ένα διφασικό μίγμα. Τα νουκλεϊνικά οξέα (DNA, RNA) μεταφέρονται στην άνω υδατική φάση ενώ οι πρωτεϊνες στην κατώτερη, οργανική φάση. Στο τελευταίο στάδιο, το RNA συλλέγεται από την υδατική φάση με ισοπροπανόλη ή αιθανόλη. Η θειοκυανική γουανιδίνη (Guanidinium thiocyanate) αποδιατάσσει πρωτεϊνες και RNάσες και διαχωρίζει το rRNA από τις ριβοσωμικές πρωτεϊνες, ενώ η φαινόλη, και η ισοπροπανόλη έχουν μικρή διαλυτότητα. Και η φαινόλη και το χλωροφόρμιο είναι επικίνδυνα χημικά και ειδική μέριμνα πρέπει να λαμβάνεται πριν από τη χρήση τους.

Φαινόλη (αριστερά) και διαχωρισμός φάσεων (δεξιά)

Πρωτόκολλο απομόνωσης RNA (Τροποποιημένο από το αυθεντικό των Chomczynski and Sacchi). Chomczynski and Sacchi Ο χώρος διεξαγωγής του πειράματος πρέπει να είναι απαλλαγμένος από Rnάσες. Για το λόγο αυτό: -Φοράμε καθαρά γάντια. -Χρησιμοποιούμε αποστειρωμένα tips και όλα τα αναλώσιμα πρέπει να είναι αποστειρωμένα. -Το νερό που προστίθεται στα αντιδραστήρια πρέπει να είναι διπλά απιονισμένο και αποστειρωμένο. Αντιδραστήρια (τα οποία πρέπει να είναι έτοιμα τη στιγμή διεξαγωγής του πειράματος). -4Μ GNTC (Guanidine thiocyanate solution): Προσθέτουμε 8 μl μερκαπτοαιθανόλης σε 1 ml διαλύματος GNTC πριν τη χρήση! - 2Μ Οξικό Νάτριο ph: 4 -Φαινόλη (υγρή, αποστειρωμένη) -Χλωροφόρμιο: ισοαμυλική αλκοόλη (49:1)

Πρωτόκολλο απομόνωσης RNA Χρησιμοποιούμε τουλάχιστον 10μl GNTC για κάθε mg ιστού. Ομογενοποιούμε το δέιγμα με το GNTC και δεν το παγώνουμε γιατί οι νουκλεάσες μπορεί να είναι ενεργές πριν το διάλυμα GNTC/ μερκαπτοαιθανόλης παρεμποδίσει τη δράση αυτών των νουκλεασών. 1 η μέρα: 1. Ο ιστός αναμιγνύεται με GNTC και προσθέτουμε : V 2M οξικό νάτριο - 1 V φαινόλη V χλωροφόρμιο, ισοαμυλική αλκοόλη 2. Κάνουμε vortex (μηχανική έντονη ανάδευση) και αφήνουμε για 20 λεπτά στον πάγο: οι δύο φάσεις αρχίζουν να διαχωρίζονται 3. Φυγοκεντρούμε στις 14,000 σ.α.λ. (20,000 g) για λεπτά στους 4 ο C. 4. Προσεκτικά μεταφέρουμε την άνω φάση (υδατική) σε νέο σωλήνα. Πρέπει να είμαστε πολύ προσεκτικοί ώστε να μην πάρουμε δέιγμα από την ενδιάμεση στοιβάδα

Πρωτόκολλο απομόνωσης RNA 5. Προσθέτουμε 1.1 V ισοπροπανόλη σε κάθε σωλήνα. 6. Αφήνουμε να επωαστεί το δείγμα όλη τη νύχτα στους -20 ο και να γίνει η κατακρίμνηση του RNA (ή διαφορετικά γίνεται κατακρίμνηση στους -80 ο για 2 ώρες προσέχοντας να μην παγώσει το δείγμα). 2 η μέρα: 7. Φυγοκεντρούμε τα δέιγματα στους 4 ο για λεπτά στις 14,000 σ.α.λ. (Προσέχουμε η φυγόκεντρος να είναι ήδη παγωμένη). 8. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο πολύ προσεκτικά. Το σφαρίδιο που είναι προσκολλημένο στο σωλήνα eppendorf μπορεί να είναι χαλαρό και να αποκολληθεί. Παρολά αυτά μια δεύτερη φυγοκέντρηση βοηθάει στο να καθαριστεί πλήρως το σφαιρίδιο και το εναπομείναν υγρό το αποβάλλουμε με ένα λεπτό tip. 9. Προσθέτουμε 70 % αιθανόλη. 10. Φυγοκεντρούμε στις 14,000 σ.α.λ. για λεπτά στους 4 ο. 11. Όπως προηγουμένως, απορρίπτουμε γρήγορα το υπερκείμενο και 12. Επαναδιαλύουμε το σφαιρίδιο προσθέτοντας αποστεειρωμένο ddH20.

RΝΑ extraction χρησιμοποιώντας Trizol guanidinium isothiocyanate (powerful protein denaturant) -> inactivation of RNases acidic phenol/chloroform -> partitioning of RNA into aqueous supernatant for separation TRIzol or TRI reagent If you want to make your own reagents, see here RNA extraction using self-made guanidinium-acid-phenol reagents0.8 M sodium citrate / 1.2 M NaClRNA extraction using self-made guanidinium-acid-phenol reagents isopropanol (2-propanol) chloroform 75% EtOH in DEPC H2O RNase free water (filtered or DEPC)DEPC

RΝΑ extraction χρησιμοποιώντας Trizol Cell lysis (διάρκεια λεπτά) -Προσθέτουμε Trizol 1 ml ή 5 ml αν προστεθεί σε φιάλη των 75 ml. -Oμογενοποιούμε, με vortex και ενώ ο ιστός έχει λειοτριβηθεί σε γουδί. -Αφήνουμε 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για την διάσπαση των συμπλόκων των νουκλεοπρωτεϊνών. Διαχωρισμός φάσεων (15-45 λεπτά) -Προσθήκη χλωροφορμίου (1/5 του Τrizol) -Ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα χωρίς vortex. -Φυγοκέντρηση στις 12,000 σ.α.λ. για 5-15 λεπτά σε 2-8 ο. Κατακρήμνιση RNA και έκπλυση (20-40 λεπτά) -Προσθήκη ισοπροπανόλης (1/2 όγκος Τrizol) -0.8 M κιτρικό νάτριο -Επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου -Φυγοκέντρηση για λεπτά στους 4 ο. -Μεταφέρουμε το υπερκείμενο.

RΝΑ extraction χρησιμοποιώντας Trizol Πλύσεις του RNA (15-30 λεπτά) -Πλύση του ιζηματος με 70 % αιθανόλη -Φυγοκέντρηση μέγιστη ταχύτητα, γι 2-10 λεπτά στους 4 ο. Επαναδιάλυση του RNA -Επαναδιάλυση του ιζήματος με μl ddH2O.