ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΣΕΚΟΥΡΑΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΑΜ ΤΜΗΜΑ ΕΦΠ ΘΕΜΑ: DNA BARCODING ΣΕ ΦΥΤΙΚΑ ΕΙΔΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ KAΘΗΓΗΤΗΣ : κ.ΚATINAKHΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ

1) ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

H όλη διαδικασία του DNA barcoding εφαρμόζεται σε 3 τομείς. Α. Συλλογή και ταξινόμηση δειγμάτων βάσει εξειδικευμένων γνώσεων ανατομικών και μορφολογικών χαρακτηριστικών των οργανισμών ( στα φυτά η βοτανική) B. Μοριακή βιολογία : απομόνωση ολικού DNA, ενίσχυση τμήματος περιοχής που μας ενδιαφέρει (πχ ΙΤS) μέσω PCR,DNA sequencing –editing (αλληλούχιση βάσεων, final barcode) Γ. Bιοπληροφορική : Μέσω Η/Υ, γενετικά δεδομένα (DNA) αποθηκεύονται για μεγάλο αριθμό δειγμάτων (barcode library), γίνονται συγκρίσεις και κατασκευάζονται φυλογενετικά δέντρα για μιά τάξη οργανισμών,ως αποτελέσμα μπορεί να γίνει και ανακάλυψη νέων ειδών. A B Γ

H καινοτομία της μεθόδου είναι η αξιόπιστη και γρήγορη αναγνώριση διαφορετικών ειδών, ακόμα και για περιοχές εκατοντάδων βάσεων,πως επιτυγχάνεται αυτό ? Με την δημιουργία DNA barcode, κάθε βάση Α,T/U,G,C έχει το δικό της χρώμα και σημειώνεται ως μια μπάρα (bar) έτσι πολλές μπάρες μαζί μας δίνουν ένα ραβδόγραμμα (barcode) που είναι μοναδικό για κάθε είδος,συνήθως για αυτή τη διαδικασία επιλέγουμε «συντηρημένες » περιοχές - δείκτες χλωροπλαστικού και πυρηνικού DNA (πχ ΙΤS) οι οποίες δεν έχουν αλλάξει πολύ κατά το πέρασμα των χρόνων, είναι μοναδικές για κάθε είδος και είναι σχετικά μικρές σε μήκος (σε ζεύγη βάσεων,base pairs). Αυτές είναι οι περιοχές DNA που μετατρέπονται σε barcode (aφού προηγουμένως αλληλουχηθούν-sequence).Έτσι μπορούν εύκολα να εντοπισθούν οι διαφορές μεταξύ 2 η/και περισσότερων barcode διαφορετικών ειδών εύκολα και με μια ματιά ακόμη και απο τον μη ειδικό. Παρακάτω φαίνονται τα DNA barcodes για 2 διαφορετικά φυτικά είδη.

2) ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΤΑ ΒΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ( ΣΥΝΟΠΤΙΚΑ) 1) Aπομόνωση ολικού DNA απο το φυτικό ιστό, μέθοδος CTAB. 2) Eνίσχυση ΙΤS,το οποίο είναι μια συντηρημένη περιοχή του ολικού γονιδιώματος που έχουμε απομονώσει, μέθοδος PCR. 3) Ανάλυση των αποτελεσμάτων της PCR με ηλεκτροφόρηση (gel electrophoresis),ανάκτηση των δειγμάτων DNA απο τη πηκτή (gel extraction). 4) Παραγωγή του ΙΤS1 σε μεγάλες ποσότητες (με τη τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA) 5) Επιλογή,ανάκτηση του DNA aπο τις υγρές καλλιέργειες και αποστολή αποτελεσμάτων για DNA sequencing (aλληλούχιση DNA).

1) Aπομόνωση ολικού DNA απο το φυτικό ιστό, μέθοδος CTAB.  Λυοφιλοποίση του φυτικού ιστού σε ιγδύο με τη βοήθεια υγρού αζώτου και μεταφορά σε eppendorf  Προσθέτουμε CTAB για να διαρρηχθούν τα κύτταρα  Προσθέτουμε Seveg σε ίση ποσότητα με το CTAB για καθαρισμό δείγματος, φυγοκέντρηση  Μεταφορά υδατικής φάσης σε νέο eppendorf, προσθήκη ισοπροπανόλης,αιθανόλης  Φυγοκέντρηση, παραλαβή DNA σε μορφή pellet  Καθαρισμός pellet (απο αλκόολη,άλατα CTAB) με ddH20 και φυγοκέντρηση  Διαλυτοποίηση pellet σε δ/μα Τris –HCl και οπτικές μετρήσεις (OD)

Φυτικός ιστός και Seveg (μετά απο φυγοκέντρηση 2min, rpm)

Αφού απομονώσουμε το DNA σε μορφή pellet και το διαλύσουμε σε δ/μα Τris (pH=8, προστασία DNA απο ενδονουκλεάσες) μετά απο 1 h, παίρνουμε οπτικές αντικειμενικές τιμές των DNA (OD) με τη βοήθεια φωτόμετρου. Το φωτόμετρο nanodrop αναρροφά μια σταγόνα απο το δείγμα μας, και αφού την επεξεργασθεί, εμφανίζονται τα αποτελέσματα (συγέντρωση DNA σε ng/μl, λόγος καθαρότητας DNA – πρωτεϊνών A260/A280, καλές τιμές κοντά στο 2) στον Η/Υ. Πρίν πάρουμε τις μετρήσεις μηδενίζουμε το φωτόμετρο με μάρτυρες (νερό, δ/μα Τris) πριν και μετά τις μετρήσεις των δειγμάτων μας.

Eάν θέλουμε, μετά την απομόνωση του φυτικού γονιδιώματος (genomic), κάνουμε ηλεκτροφόρηση για να επιβεβαιωθούμε ότι η διαδικασία έχει γίνει σωστά. Δεξιά τρεις ποικοιλίες αμπελιού Α,Β,Γ αριστερά ο μάρτυρας (marker)

2) Eνίσχυση του ΙΤS - μια συντηρημένη περιοχή του ολικού γονιδιώματος που έχουμε απομονώσει-, με μέθοδο PCR. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 1)DMSO (υψηλό ιξώδες που βοηθά για ομαλή αυξομείωση της Τ (C) και να μην καταστραφεί το ένζυμο πολυμεράση) 2)dntps (δεοξυριβονουκλεότίδια) 3)Το 2GC Buffer (5X) : χρησιμοποιείται για να διασπαστούν οι δεσμοί υδρογόνου σε περιοχές του DNA με πολλές βάσεις G,C. 4) K polymerase (DNA πολυμεράση) 5) Primers (F,R) : είναι διαφορετικοί για κάθε γονίδιο, περιοχή DNA που θέλουμε να ενισχύσουμε,για το ΙΤS (1,2), χρησιμοποιήθηκε ο primer sp6. 6) ddH20 αποστειρωμένο ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Παρασκευάζουμε ένα μητρικό δ/μα (ΜΙΧ) με τα κοινά για τα δείγματα αντιδραστήρια και το μοιράζουμε σε καινούργια eppendorf, έπειτα βάζουμε τα δείγματα DNA που απομονώσαμε στο 1 ο βήμα. Τα τοποθετούμε εντός της τράπεζας PCR, επιλέγουμε το αντίστοιχο πρόγραμμα με τις ανάλογες ρυθμίσεις (θερμοκρασίες, αριθμός κύκλων PCR αντίδρασεων, κλπ).

ΣΥΣΚΕΥΗ PCR

3α) Ανάλυση των αποτελεσμάτων της PCR με ηλεκτροφόρηση (gel electrophoresis). ΔΙΑΤΑΞΗ ΣΥΣΚΕΥΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ (το gel υπερκαλύπτεται με δ/μα TAE )

Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε 1,2 % gel αγαρόζης.To 1/10 του όγκου των δειγμάτων είναι DNA loading buffer (με χρωστική bromophenol blue για μεγέθη ως 4 kb), σε κάθε πηγάδι φορτώνουμε δείγμα DNA απο τη PCR, δείγμα γνωστού μοριακού βάρους (molecular weight size marker),και ένα δείγμα (control) (χωρίς DNA), το οποίο πρέπει να βγεί αρνητικό (να μη δούμε τίποτα στη φωτό του gel ηλεκτροφόρησης με UV φως, εάν δούμε τα δείγματα μας έχουν μολυνθεί).Αφού παρασκευαστεί το gel, το υπερκαλύπτουμε με simple loading buffer (δ/μα ΤΑΕ). Kατά τη διάρκεια της ηλεκτρόφόρησης τα δείγματα μετακινούνται απο τα πηγάδια προς τα κάτω, και όταν φτάσουν εντελώς κάτω, τότε καταλαβαίνουμε ότι η ηλεκτροφόρηση έφτασε στο τέλος. ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΙΝ ΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΟΥ GEL ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ (PCR για 5 είδη ψυχανθών)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΟΥ GEL ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ (PCR για 3 ποικιλίες αμπελιού)

3β) Ανάκτηση του DNA απο το gel (gel extraction) με ειδικό kit Τοποθετούμε το gel σε τράπεζα UV, και απομονώνουμε με αποστειρωμένο νυστέρι τις μπάντες DNA του gel που μας ενδιαφέρουν(εδώ τις μπάντες των ΙΤS 1,2). Kάθε τμήμα gel με δείγμα DNA τοποθετείται σε ξεχωριστό eppendorf. Ακολουθεί καθαρισμός και απομόνωση του DNA με το kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up. KΟΠΗ ΤΟΥ GEL TΡΑΠΕΖΑ UV

ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΤΟΥ ΚΙΤ : ΝΤ1,ΝΤ3,ΝΕ ΣΤΗΛΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA (spin column) Kit gel - extraction

ΤΟ DNA ΣΥΓΡΑΤΕΙΤΑΙ ΠΑΝΩ ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΤΗΣ ΣΤΗΛΗΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ (spin column) ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (silica membrane)

4) Παραγωγή του ΙΤS1 σε μεγάλες ποσότητες με τη τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA. A) LIGATION (αντίδραση λιγοποίησης, ένωση του insert με πλασμίδιο ) ΠΕΨΗ ΜΕ ECORI ΣΕ 2 ΘΕΣΕΙΣ,EΙΣΑΓΩΓΗ ΙΝSERT (ITS) ΣΤΟ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟ pGem –T Easy (οι θέσεις που γίνονται οι πέψεις με ΕcorI σημειώνονται με κίτρινο, με μπλε σημειώνεται το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη, με κόκκινο η περιοχή DNA που θα εισαχθεί - insert, με πράσινο το γονίδιο lacZ. Η σύνδεση πλασμιδίου – insert γίνεται με τη Τ4 λιγάση).

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΠΟΣΟΤΗΤΑΣ ΙNSERT Ο φορέας των πλασμιδίων είναι κύτταρα Ε.coli τα οποία έχουν γίνει ικανά (competent) να δεχτούν πλασμίδια με χρήση CaCl2 το οποίο αφήνει ανοικτά τα κανάλια ασβεστίου (Ca) και χλωρίου (Cl) των κυττάρων.O τελικός όγκος για κάθε δείγμα insert (ITS) πρέπει να είναι 10 μl max, διαφορετικά όταν εισάγουμε το μίγμα αυτό με μεγαλύτερο όγκο στα competent E.coli υπάρχει κίνδυνος να μην έχουμε επιτυχή μετασχηματισμό διότι τo εσωτερικό των κυττάρων (E.coli) θα αραιωθεί πολύ. Τα competent E.Coli αποθηκεύονται στην κατάψυξη (-80 C), μαζί με LB, γλυκερόλη, 80 mM CaCl2, σε όγκο 100 μl.

Β) ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ E.coli

ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΣΠΡΩΝ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΤΡΥΒΛΙΟ (περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο) και τοποθέτηση τους σε υγρό υπόστρωμα (LB χωρίς άγαρ). mini - prep (OVERNIGHT)

5) Επιλογή,ανάκτηση του DNA aπο τις υγρές καλλιέργειες και αποστολή αποτελεσμάτων για DNA sequencing. Α. Βοiling prep Η διαδικασία αυτή εφαρμόζεται στις υγρές καλλιέργειες του mini-prep. Για κάθε δείγμα ( έχει και το δικό του τρυβλιο) απομονώσαμε απο το τρυβλίο 2 άσπρες αποικιές και τις τοποθετή- σαμε σε 2 ξεχωριστά φυαλίδια με LB κ’ τα αφήσαμε για 24h (overnight) για να πάρουμε υγρές καλλιέργειες. Η διαδικασία αυτή μας βοηθάει να διαλέξουμε ποια απο τις 2 υγρές καλλιέργειες είναι η καλύτερη. Aπομονώνουμε απο τα competent E.coli των καλλιεργειών το πλασμιδιακό DNA, κάνουμε πέψη με ΕcoRI για να γίνει γραμμικό και το ηλεκτροφορούμε. Με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης του boiling prep, επιλέγουμε τη καλύτερη απο τις δύο καλλιέργειες για κάθε δείγμα, και απο αυτήν με το Kit Nucleospin plasmid DNA purification απομονώνουμε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (plasmid DNA + ITS), το οποίο και θα στείλουμε για ανάλυση DNA Sequencing.Προαιρετικά μετά την απομόνωση του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου,κάνουμε ξανά πέψη με ΕcoRI και ηλεκτροφόρηση για επαλήθευση αποτελεσμάτων.

ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΤΟΥ ΚΙΤ : A1, A2, A3, A4, AE ΣΤΗΛΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA (spin column) Β. “Quia Prep” Απομόνωση ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA με ειδικό kit (το οποίο θα aποσταλεί για DNA sequencing). Kit plasmid DNA purification

AΠΟΣΤΟΛΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΓΙΑ DNA SEQUENCING