Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια προκειμένου να τα προστατέψουν από την εισβολή ξένου DNA. Αναγνωρίζουν ειδικές.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια προκειμένου να τα προστατέψουν από την εισβολή ξένου DNA. Αναγνωρίζουν ειδικές."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1

2

3 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια προκειμένου να τα προστατέψουν από την εισβολή ξένου DNA. Αναγνωρίζουν ειδικές ακολουθίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA Είναι τα βιολογικά «ψαλίδια» Μια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιείται συνήθως είναι η EcoRI που απομονώνεται από το βακτήριο Εsherichia coli animation

4 ένζυμοβακτήριο Ακολουθία αναγνώρισης Κόψιμο DNA Κάποια είδη περιοριστικών ενδονουκλεασών

5 Φορείς κλωνοποίησης • πλασμίδια (ενσωματώνουν έως 20kb ξένου DNA) • DNA φάγων(ενσωματώνουν έως 25kb ξένου DNA) Ποια είναι τα χαρακτηριστικά που πρέπει να έχει ένα πλασμίδιο για να είναι ικανός φορέας κλωνοποίησης; • (Να μπορεί να αντιγράφεται αυτόνομα μέσα στο κύτταρο ξενιστή) •Να διαθέτει γονίδιο (ή γονίδια) ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά •Να περιέχει την ακολουθία που αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση, που θα χρησιμοποιηθεί μια μόνο φορά animation

6

7 E coli πλασμίδιο 2. Κόψιμο με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση Θέση που κόβει η περιοριστική ενδονουκλεάση Γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό 1. απομόνωση DNA Μονόκλωνα άκρα 3. Ανάμιξη των μορίων DNA 4. H DNA δεσμάση ενώνει τα διαφορετικά κομμάτια ανασυνδυασμένο DNA

8 5. Το ανασυδυασμένο πλασμίδιο εισάγεται σε βακτήριο ξενιστή 6. Τα βακτήρια καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει κατάλληλο αντιβιοτικό 7. Επιλέγονται τα βακτήρια που έχουν προσλάβει (ανασυνδυασμένο ή μη) πλασμίδιο. Βακτήρια που έχουν προσλάβει πλασμίδιο (λευκά) animation

9 Στάδια κατασκευής μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 1.Απομόνωση DNA ευκαρυωτικού οργανισμού και πλασμιδίων 2.Κόψιμο τόσο του του γονιδιώματος του ευκαρυωτικού οργανισμού, όσο και του πλασμιδίου με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση 3.Ανάμειξη των δύο DNA (αυτού του ευκαρυωτικού οργανισμού με τα πλασμίδια). 4.Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων με τη βοήθεια του ενζύμου DNA δεσμάση. 5.μεταφορά των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων σε βακτήρια- ξενιστές (μετασχηματισμός). 6.καλλιέργεια των βακτηρίων σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αντιβιοτικό. 7.Προσδιορίζονται τα βακτήρια που έχουν δεχθεί πλασμίδιο. Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει το συνολικό DNA οργανισμού-δότη και αποτελεί τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη.

10 Μια επισήμανση Η EcoRI κόβει όποτε βρεί την ακολουθία: …… 5΄ G A A T T C 3 ΄…… …… 3΄ C T T A A G 5΄ …… … 5΄ G- OH … 3΄ C T T A A - P Σε κάθε κόψιμο σπάει δυο φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και 8 δεσμούς υδρογόνου P- A A T T C 3΄ … G 5΄…G 5΄… HO- Κολλώδη άκρα

11

12 πλασμίδια ξένο DNA Κόψιμο με την ίδια ενδονουκλεάση + + Προσθήκη δεσμάσης Μερικά πλασμίδια «κλείνουν» χωρίς να πάρουν ξένο DNA ανασυνδυασμέναμη ανασυνδυασμένα

13 … …… Τα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια ; ; Μετασχηματισμένα με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Μετασχηματισμένα με μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Μη μετασχηματισμένα (τα περισσότερα) ………..


Κατέβασμα ppt "Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια προκειμένου να τα προστατέψουν από την εισβολή ξένου DNA. Αναγνωρίζουν ειδικές."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google