ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Παρουσίαση με θέμα: "ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ
Ιωαννίδη Λυδία Ελένη Α.Μ. :4840 Ακ.Ετος:

2 «A PGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis»
Nature 481, 463–468 (26 January 2012)

3 «Η PGC1-α εξαρτώμενη μυοκίνη που οδηγεί στην τύπου φαιού λίπους ανάπτυξη του λευκού λίπους και στην θερμογένεση»

4 PGC1-α Μεσολαβεί σε πολλά βιολογικά προγράμματα
Διεγείρει την αγγειογένεση και τον ερεθισμό των μυϊκών ινών Παρέχει αντοχή σε μυϊκή δυστροφία Συνενεργοποιητής του PPAR-γ, μιας διαμεσολαβητικής πρωτεΐνης που αυξάνει : Την έκφραση της UCP1(uncoupling protein) και την θερμογένεση στον φαιό λιπώδη ιστό Την βιογένεση των μιτοχονδρίων και τον μεταβολισμό σε πολλούς τύπους κυττάρων.

5 Μέθοδοι

6 qPCR qPCR για θερμογόνα γονίδια και γονίδια που σχετίζονται με το φαιό λίπος βασίζεται στην PCR εντοπίζει και πολλαπλασιάζει ένα στοχοθετημένο μόριο DNA το ενισχυμένο DNA ανιχνεύεται ενώ η αντίδραση εξελίσσεται σε πραγματικό χρόνο. 

7 Ανοσοϊστοχημική ανιχνευση
Ανοσοϊστοχημική ανιχνευση  Διαδικασία ανίχνευσης αντιγόνων(π.χ. πρωτεϊνών) Βασίζεται στο ότι τα αντισώματα δεσμεύουν συγκεκριμένο αντιγόνο Χρησιμοποιείται για την κατανόηση της κατανομής και τον εντοπισμό πρωτεϊνών

8 Αποτύπωση κατά western (western blot)
 Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών σε συγκεκριμένο δείγμα  Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή για διαχωρισμό  Μεταφέρονται σε μεμβράνη (συνήθως νιτροκυτταρίνης ή PVDF) Ανιχνεύονται με χρήση αντισωμάτων ειδικών για την πρωτεΐνη-στόχο. 

9 Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με ποντίκια με αυξημένη διαγονιδιακά PGC1-α στους μύες (MCK-PGC1-α)

10 Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των ειδικών γονιδίων φαιού λίπους στον μεταξύ των ωμοπλατών φαιό λιπώδη ιστό(ΒΑΤ) ή στον σπλαχνικό (επιδιδυμίδας) λευκό λιπώδη ιστό

11 Ωστόσο, το υποδόριο στρώμα λίπους (βουβωνοκήλη), λευκός λιπώδης ιστός πιο επιρρεπής στον σχηματισμό UCP1 θετικών λιποκυττάρων, σημαντικά αυξημένα επίπεδα mRNAs UCP1 και Cidea

12 Αποτυπωση κατά western
Ανοσοϊστοχημική ανιχνευση

13 Αλληλεπίδραση PGC1-α λιποκυτταρων
Εμβολίασαν καλλιέργεια από υποδόρια λιποκύτταρα με μυϊκά κύτταρα που εκφράζουν το PGC1-α ή με κύτταρα που εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη(GFP). Στην καλλιέργεια με τα κύτταρα PGC1-α παρουσιάστηκαν αυξημένα επίπεδα mRNA από διάφορα γονίδια φαιού λίπους. Το PGC1-α προκαλεί τα μυϊκά κύτταρα να εκκρίνουν ένα μόριο (α) που εντείνουν το θερμογόνο πρόγραμμα γονιδίων

14 Διαμεσολαβητικές πρωτεΐνες που ελέγχονται από την PGC1-α
Για τον εντοπισμό τους χρησιμοποιήθηκαν : Μικροσυστοιχίες DNA Αλγόριθμος που υπολογίζει την έκφραση πρωτεϊνών (Affymetrix)

15 Μικροσυστοιχίες γονίδιων
Οι μικροσυστοιχίες των νουκλεινικων οξέων λειτουργούν με υβριδοποίηση σεσημασμένου RNA ή DNA σε διάλυμα από μόρια DNA που έχουν προσκολληθεί σε θέσεις της επιφάνειας(π.χ. γυαλί) Εκμεταλλεύονται την εκλεκτική φύση της συμπληρωματικότητας μεταξύ νουκλεινικων οξέων DNA-DNA ή DNA-RNA ή πρόσφατα και μεταξύ  αμινοξέων  πρωτεϊνών, υπό αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και με τη χρήση φθοριζουσών ουσιών

16 Όλες οι πρωτεΐνες με μιτοχονδριακο στόχο αποκλείστηκαν
Πέντε πρωτεΐνες αναγνωρίστηκαν ως γονίδια-στόχοι της PGC1-α στους μύες και ως πιθανές να είναι η εκκρινόμενη, οι εξής: IL-15, FNDC5, VEGF-B, LRG1 και TIMP4

17 Διαπιστώθηκε ότι ήταν αυξημένες σε επίπεδο mRNA στους μύες από ποντίκια που ασκούνται

18 Σε βιοψίες μυών ανθρώπων πριν και μετά μια ελεγχόμενη περίοδο άσκησης τα mRNAs των FNDC5, VEGFB TIMP4 παρουσίασαν αύξηση

19 Στοιχειά που οδηγούν στην FNDC5

20 Εισαγωγή FNDC5 20(nΜ) οδήγησε σε επταπλασιασμο του mRNA UCP1
Πρωτεΐνες εφαρμόστηκαν άμεσα στον υποδόριο λευκό λιπώδη ιστό κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των λιποκυττάρων. Παράγοντες όπως η IL-15 ή VEGF-B (200nM+) είχε ελάχιστες επιπτώσεις στην έκφραση των UCP1 (κ.α. γονίδιων) Εισαγωγή FNDC5 20(nΜ) οδήγησε σε επταπλασιασμο του mRNA UCP1 SVF(6)

21 SVF Τα αποτελέσματα της χρήσης FNDC5 ήταν εξαιρετικά ισχυρά
UCP1 mRNA αυξήθηκε φορές σε περισσότερα από 10 πειράματα χρησιμοποιώντας FNDC5 (20 nM) Σε αντίθεση, o BMP7, ισχυρός επαγωγέας της δημιουργίας φαιού λίπους, είχε μια πολύ μικρότερη επίδραση (κατ 'ανώτατο όριο στο διπλάσιο) για τα ίδια τα κύτταρα σε 3,3μΜ SVF

22 Υπήρχε σαφής σχέση δόσης-αποτελέσματος
SVF

23 Με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρατηρήθηκε:
υψηλότερη πυκνότητα μιτοχονδρίων μεγέθη παρόμοια μεταξύ των ομάδων Μέτρηση του καταναλισκόμενου Ο2 φανέρωσε αύξηση: ενεργειακής δαπάνης συνολικής κατανάλωσης οξυγόνου(100%) με 20nM της FNDC5

24 Xρονικό διάστημα κατά τη διαδικασία διαφοροποίησης που η FNDC5 είναι αποτελεσματική
για 2 μέρες από 0-6 σε όλη τη διάρκεια της 6-ήμερης διαδικασίας διαφοροποίησης 3ης-6ης ημέρας ->αύξηση του Ucp1mRNA <όταν η FNDC5 ήταν παρούσα καθ 'όλη τη διαδικασία διαφοροποίησης. 2 πρώτες ημέρες ->καμία επίδραση επίπεδα UCP1

25 Πώς η FNDC5 δρα στα γονίδια?
PPAR-α είναι παράγοντας μεταγραφής που προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας συστοιχίες γονίδιων Πυρηνικός υποδοχέας που οδηγεί σε έκφραση του UCP1 και αρκετών άλλων γονίδια που εμπλέκονται στην δημιουργία φαιού λίπους. Ο PPAR-α αυξάνεται στο τριπλάσιο σε επίπεδο mRNA παρουσία FNDC5 SVF

26 Η αύξηση UCP1 μειώθηκε σημαντικά (αντίθετα η μείωση λεπτινής) όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν ταυτόχρονα σε έναν PPAR-α ανταγωνιστή, τον GW6471 Ο FNDC5 επάγει την έκφραση των γονιδίων UCP1,τουλάχιστον εν μέρει, μέσω του PPAR-α.

27 Fndc5 διασπάται και εκκρίνεται ως Irisin
FNDC5 (επίσης γνωστή ως FRCP2 και pep), έχει ένα πεπτίδιο, δύο τομείς φιμπρονεκτίνης και ένα υδρόφοβο τομέα που είναι πιθανό να εισέρχεται σε μεμβράνη θα μπορούσε να συντίθεται ως τύπου Ι μεμβράνική πρωτεΐνη , ακολουθούμενη από πρωτεολυτική διάσπαση και απελευθέρωση των αμινοξέων πρωτεΐνης στον εξωκυττάριο χώρο

28 Flag ενδογενή FNDC5 πρωτεΐνη 32 kilodalton (kDa): HEK293

29 Με Φασματομετρία μάζας προσδιορίστηκε η αλληλουχία του πολυπεπτιδίου που προέρχεται από τοFNDC5 .
Έχει αξιοσημείωτη διατήρηση μεταξύ των ειδών, με 100% ομοιότητα μεταξύ ποντίκων και ανθρώπων. irisin, κατά την Ίριδα( μεταφέρει σήματα από μυς σε άλλους ιστούς )

30 Irisin είναι παρούσα στο πλάσμα
Αναλύθηκαν τα επίπεδα irisin στο πλάσμα ποντίκων, μετά από ενδοφλέβια εισαγωγή του FNDC5 με αδενοιό. Εκφραση από το ήπαρ και πιθανή έκκριση στο πλάσμα, όπου εντοπίζουμε irisin χρησιμοποιώντας την ανοσοαποτυπωση κατά Western. Όπως φαίνεται και στο σχήμα, ο ιός που εξέφραζε FNDC5 οδήγησε σε σαφή αύξηση μιας ζώνης στα 22 kDa.

31 Μια ιδία ζώνη βρέθηκε στο ανθρώπινο πλάσμα

32 Αναλύθηκε επίσης το πλάσμα PGC1-a muscle-specific knockout mice ως αρνητικός έλεγχος
Και η ζώνη της irisin στα 22 kDa, μειώθηκε κατά 72% σε αυτά τα ζώα .

33 Εξετάσαμε τα επίπεδα στο αίμα της irisin μετά την άσκηση σε ποντίκια και είχαν σημαντικά αυξημένα (65%) επίπεδα irisin στο πλάσμα τους μετά από 3 εβδομάδες τροχό( ακολουθουμενες από 12h ξεκούραση)

34 σε υγιείς ενήλικες ανθρώπους που υπόκεινται σε προπόνηση αντοχής για 10 εβδομάδες έχουμε αύξηση των κυκλοφορούντων επιπέδων irisin στο διπλάσιο σε σύγκριση με των μη ασκηθέντων

35 Έτσι, irisin είναι παρούσα σε ποντίκια και ανθρώπινο πλάσμα, και αυξάνεται με την άσκηση. Η αύξηση της κυκλοφορούσας πρωτεΐνης στα δύο είδη είναι περίπου ανάλογη με το αυξήσεις που έχουν σημειωθεί σε επίπεδο mRNA στους μύες

36 Για να αποδειχθεί ότι η ιρισίνη μειώνει την παχυσαρκία και την αντίσταση στην ινσουλίνη

37 Αρχικά.. Χρησιμοποιήθηκαν αδενοιοι ως φορείς για να εκφράσουν ολόκληρη τηνFNDC5 (ή το GFP control) σε ποντίκια ΒΑLB/c. Αυτή η μέθοδος οδήγησε σε μια αύξηση του mRNA τουFndc5 στο15-πλάσιo στο ήπαρ. Τα επίπεδα ιρισίνης πλάσματος αυξήθηκαν κατά 3-4 φορές

38 Τα ποντίκια δεν εμφάνισαν καμία ανεπιθύμητη ενέργεια
Τα ποντίκια δεν εμφάνισαν καμία ανεπιθύμητη ενέργεια. Δέκα ημέρες μετά την ένεση, το UCP1 mRNA αυξήθηκε κατά 13-φορές στην υποδόρια αποθήκη σε σχέση με τα ποντίκια που έλαβαν τον ιό που εκφράζει το GFP . Έτσι, σε μέτριες αυξήσεις της ιρισίνης μπορεί να προκληθεί μετατροπή του λευκού λιπώδους ιστούς in vivo,και αυξημένη έκφραση του UCP1.

39 ποντίκια C57BL / 6 που έχουν καταστεί παχύσαρκα από διατροφή υψηλή σε λιπαρά.
ιδιαίτερα επιρρεπείς σε δίαιτα που προκαλεί παχυσαρκία και διαβήτη

40 Εισάγουμε αδενοϊό που εκφράζει FNDC5
Η έκφραση της irisin (*3) αύξησε : την εκφραση του γονιδίου UCP1 στον ίδιο βαθμό όπως στα άπαχα ποντίκια την έκφραση πολλών μιτοχονδριακών γονίδιων την κατανάλωση O2 ,ενώ παρατηρήθηκε μείωση σωματικού βάρους(10 ημέρες)

41 Η έκφραση της Irisin βελτίωσε την ανοχή στην γλυκόζη
Intraperitoneal glucose tolerance test

42 Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι ακόμα και μικρή αύξηση στα επίπεδα της irisin μπορούν να αυξήσουν δραστικά την κατανάλωση ενέργειας, να μειώσουν το σωματικό βάρος και να βελτιώσουν την αντίσταση στην ινσουλίνη που προκαλείται από την διατροφή

43  Εισαγωγή  αντι-FNDC5 αντισωμάτων σε ποντίκια  10 ημέρες πριν από την κολύμβηση μείωσε δραματικά το αποτέλεσμα αυτής της άσκησης στην έκφραση των γονιδίων των UCP1 και Cidea . 

44 Έτσι, irisin απαιτείται για ένα σημαντικό μέρος της επίδρασης της άσκησης στην έκφραση των γονιδίων αυτών που συμβάλουν στην μετατροπή του λευκού λίπους σε φαιό

45 Κλείνοντας … Εξωγενώς χορηγούμενη ιρισίνη προκαλεί την μετατροπή του υποδόριου λευκού λίπους σε φαιό και θερμογένεση Αυξημένη δημιουργία φαιού λίπους φαίνεται να έχει επιπτώσεις κατά της παχυσαρκίας και του διαβήτη Μένει να καθοριστεί το αν θεραπείες με υψηλότερες δόσεις θα προκαλέσουν μεγαλύτερη απώλεια βάρους Πιθανώς θα μπορούσε να συνταχθεί και να παραδοθεί ως ένα ενέσιμο πολυπεπτίδιο Η ιρισίνη θα μπορούσε να εχει σημαντικές επιπτώσεις και σε διαταραχές που βελτιωνονται με την ασκηση

46 Η παγκόσμια, εκρηκτική αύξηση της παχυσαρκίας και του διαβήτη καθιστά ελκυστικές τις θεραπευτικές δυνατότητες της ιρισίνης

47