ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ή ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ

Παρουσίαση με θέμα: "ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ή ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ή ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ή ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ü   Βιολογική «μεμβράνη» αποτελούμενη από λιπίδια και πρωτεΐνες ü   Περικλείει το κυτταρόπλασμα και προσδίδει στο κύτταρο την ατομικότητά του κυρίως λόγω της ελεγχόμενης επικοινωνίας με το περιβάλλον τους ή με άλλα κύτταρα ü   Αλλες λειτουργίες: Αναγώριση-μετάδοση μοριακών σημάτων, Διαμερισματοποίηση ενζυμικών αντιδράσεων (ειδικές "θέσεις" για βιοχημικές αντιδράσεις που οδηγούν στη γένεση ενέργειας -αναπνοή, φωτοσύνθεση), κυτταρική κίνηση ü   Η πιο συντηρημένη κυτταρική δομή – ίδια βασική σύσταση/δομή σε όλους τους οργανισμούς (~ 8nm) ü 

2 Ελεγχόμενη διαμεμβρανική διαπερατότητα
Ελεγχόμενη διαμεμβρανική διαπερατότητα

3 Οι μεμβράνες είναι μη ομοιοπολικά συγκροτήματα με μεγάλη ρευστότητα
  Οι μεμβράνες είναι μη ομοιοπολικά συγκροτήματα με μεγάλη ρευστότητα Η ρευστότητα των μεμβρανών επιτρέπει την οριζόντια κίνηση και διάχυση των μορίων αλλά όχι την περιστροφή από τη μία όψη της μεμβράνης στην άλλη. Για το λόγο αυτό, οι μεμβράνες είναι ασύμμετρες Τα μεμβρανικά λιπίδια έχουν μια υδρόφοβη και μια υδρόφιλη περιοχή. Σε υδάτινο περιβάλλον σχηματίζουν αυθόρμητα κλειστά διμοριακά λεπτά φύλλα. Η λιπιδική αυτή διπλοστοιβάδα είναι πρακτικά μη διαπερατή από πολικά μόρια

4 Τα κυριώτερα λιπίδια προκαρυωτικών μεμβρανών είναι φωσφολιπίδια (γλυκερόλη + 2 λιπαρά οξέα + φωσφορυλιωμένη αλκοόλη). Στα ευκαρυωτικά στερόλες Πολλές μεμβρανικές πρωτεΐνες είναι διαμεμβρανικές (80%), άλλες περιφερειακές (20%). Μερικές είναι γλυκοσιλυωμένες (2-10%) Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες προσδίδουν στην μεμβράνη τις χαρακτηριστικές λειτουργίες της. Οι πρωτεΐνες αυτές κυρίως ελέγχουν την είσοδο-έξοδο ουσιών και είναι γνωστές ως μεταφορείς, αντλίες, κανάλια, πορίνες. Αλλες λειτουργούν ως υποδοχείς, ένζυμα ή δομικές πρωτείνες

5 ΟΙ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΕΙΝΑΙ ΥΔΡΟΦΟΒΕΣ
Οι διαμεμβρανικές περιοχές των πρωτεϊνών μπορούν να προβλεφθούν από την αλληλουχία αμινοξέων (Προφιλ υδροφοβικότητας) Υδρόφοβα αμινοξέα: Α, L, V, I, F, W, Y*, M*, C* Φορτισμένα ή Πολικα: R, K, H, D, E, Q, N, S, T Μη-δομικά: G, P

6 ΜΙΑ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ α-ΕΛΙΚΑ
ΜΙΑ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ α-ΕΛΙΚΑ (ΚΥΡΙΩΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ), β-ΠΤΥΧΩΤΗ (ΠΟΡΙΝΕΣ), κλπ ΜΙΑ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗ α-ΕΛΙΚΑ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΊΝΑΙ ΑΜΦΙΦΙΛΙΚΗ ΑΜΦΙΦΙΛΙΚΕΣ α-ΕΛΙΚΕΣ ΣΥΜΜΕΤΕΧΟΥΝ ΣΕ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΑΤΕΣ ΠΟΛΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΟΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Ή ΑΛΛΑ ΜΕΡΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ

7 Πολύπλοκες υδρόφοβες και πολικές ενδοπρωτεϊνικές
αλληλεπιδράσεις καθορίζουν τη συμπαγή αλλά δυναμική τριτοταγή δομή των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών Αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-λιπιδίων είναι επίσης σημαντικές στη ρύθμιση & λειτουργία Ο ρόλος εξειδικευμένων λιπιδίων (Lipid rafts)

8 1/3 των γονιδίων κωδικεύει μεμβρανικές πρωτεΐνες…
  ΤΟΠΟΓΕΝΕΣΗ Ρύθμιση της στόχευσης και ενσωμάτωσης/εξωσωμάτωσης πρωτεϊνών σε μεμβράνες 1/3 των γονιδίων κωδικεύει μεμβρανικές πρωτεΐνες… …για τη λειτουργία τους είναι απαραίτητη η φυσιολογική στόχευση, ενσωμάτωση ή εξωσωμάτωση σε συγκεκριμένες μεμβράνες (τοπογένεση) Η ρύθμιση της τοπογένεσης ως μέρος της φυσιολογικής ζωής μιας πρωτεΐνης ή σε απόκριση σε αναπτυξιακά ή φυσιολογικά σήματα αποτελεί βασικό μετα-μεταφραστικό μηχανισμό ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης Γενετικές ασθένειες συσχετίζονται με ελαττωματική στόχευση π.χ. κυστική ίνωση (μεταφορέας Cl-)   

9 Το ίδιο μονοπάτι ισχύει και για τις εκκρινόμενες πρωτεΐνες
Τοπογένεση  Πρώτο βήμα: Η ενσωμάτωση στη μεμβράνη του ΕΔ, του μιτοχόνδριου, του χλωροπλάστη (ευκαρυωτικά) ή κατευθείαν στη κυτταρική μεμβράνη (προκαρυωτικά) Δεύτερο βήμα: Διαλογή, απόκτηση ταυτότητας (μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, γλυκοσιλίωση, εξειδικευμένα κυστίδια) για το ταξίδι τους προς το Golgi και τη κυτταρική μεμβράνη ή το χυμοτόπιο Το ίδιο μονοπάτι ισχύει και για τις εκκρινόμενες πρωτεΐνες

10 Μηχανισμοί τοπογένεσης μεμβρανικών πρωτεϊνών
Πρώτο βασικό στάδιο ελέγχου (quality check point) η ενσωμάτωση στη μεμβράνη του ΕΔ Δυο βασικοί μηχανισμοί ενσωμάτωσης: 1.Συν-μεταφραστικός (G. Blobel, Nobel 1999) 2. Μετα-μεταφραστικός Μια πολύπλοκη δυναμική μοριακή συνομιλία ….. Βασικοί trans πρωταγωνιστές: Σύμπλοκο Τρανσλοκάσης Sec (Sec61p/SecYEG), ριβόσωμα, βοηθητικοί παράγοντες: Signal Recognition Particle (SRP), SRP receptor (SR), Translocating Chain-Associating Membrane Protein (TRAM), SecA, Sec62/63, BIP , άλλες chaperones, λιπίδια της μεμβράνης Σήματα cis στις μεμβρανικές πρωτείνες: υδρόφοβα μοτίβα-σήματα [αμινοτελικά (signal recognition sequence) ή εσωτερικά (transmembrane signal sequences ή transmembrane anchor sequences). Αλληλουχίες που επηρεάζουν τον ρυθμό μετάφρασης στο ριβόσωμα. Εξειδικευμένες αλληλουχίες για κάθε οικογλενεια πρωτεϊνών?

11 Νμέσα-Cέξω ή Νέξω-Cμέσα
Πολλαπλοί παράγοντες καθορίζουν την τοπολογία διαμεμβρανικών τμημάτων (TMS) στη μεμβράνη Νμέσα-Cέξω ή Νέξω-Cμέσα 1.      H κατανομή φορτισμένων αμινοξέων στα άκρα των TMS. O νόμος του «τα θετικά μέσα» (positive inside rule). 4 φορές πιο πολλά θετικά φορτισμένα αμινοξέα σε κυτταροπλασματικές περιοχές (ΕΔ, μιτοχόνδρια, χλωροπλάστες). Αλλαγή της διαφοράς +/- μπορεί να αντιστρέψει την τοπολογία ενός TMS. Αλληλοεπιδράσεις με αρνητικά φορτισμένα λιπίδια? Σημαντική η ύπαρξη και η σύσταση του αμινοτελικού άκρου αλλά και εσωτερικών υδρόφιλων περιοχών ανάμεσα στα TMS. 2. Yδροφοβικότητα. Πειράματα με ομο-ολιγομερή πεπτίδια έδειξε ότι η ικανότητα ενσωμάτωσης στο ΕΔ είναι I>L>V,W>Y>F>M. Ολιγομερή A δεν ενσωματώνονται. Συμπέρασμα, το SRP δεν αναγνωρίζει αλληλουχίες αλλά υδροφοβικότητα και μικρές διαφορές σε δευτεροταγείς δομές.

12 Πολλαπλοί παράγοντες καθορίζουν την τοπολογία διαμεμβρανικών τμημάτων (TMS) στη μεμβράνη
4. O συγχρονισμός μετάφρασης-μεταφοράς στη μεμβράνη 5. Βοηθητικοί παράγοντες (SRP, TRAM, άλλοι?) 6. Η ύπαρξη αποκοπτόμενου αμινοτελικού σήματος στις εκκρινόμενες πρωτεΐνες

13 Οι Βιολογικές Μεμβράνες δεν Επιτρέπουν τη Διέλευση Μεταβολιτών & Ιόντων
13

14 ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΙ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ
ΟΡΙΣΜΟΣ-ΒΑΣΙΚΟΣ ΡΟΛΟΣ Η επικοινωνία των κυττάρων ή των κυττάρων με το περιβάλλον τους επιτυγχάνεται χημικά με τη μεταφορά σχετικώς μικρών μορίων. Η κυτταρική μεμβράνη όλων των κυττάρων αποτελεί ουσιαστικό και επιλεκτικό εμπόδιο στα περισσότερα πολικά μόρια όπως είναι τα σάκχαρα, τα αμινοξέα, τα νουκλεοσίδια, οι αζωτούχες νουκλεοτιδικές βάσεις, τα ιόντα, οι ορμόνες, οι βιταμίνες οι νευροδιαβιβαστές κ.α. Η διακίνηση των μορίων αυτών απαιτεί τη λειτουργία ποικίλων οικογενειών εξειδικευμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών που ονομάζονται μεταφορείς περμεάσες, κανάλια, δίαυλοι ή πορίνες με βάση την δομή τους και τον μηχανισμό μεταφοράς του υποστρώματος.

15 ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ
Η μεγάλη πλειοψηφία μεταφορέων διευκολούμενης διάχυσης και ενεργού μεταφοράς είναι πρωτεΐνες οι οποίες αποτελούνται από συμπαγή διαμεμβρανικά τμήματα a-έλικας που ενώνονται μεταξύ τους με μικρά υδρόφιλα εξωκυτταρικά ή κυτταροπλασματικά τμήματα Εξαίρεση αποτελούν οι πορίνες νερού-γλυκερόλης (στην εξωτερική μεμβράνη των βακτηρίων) που σχηματίζονται από β-πτυχωτές επιφάνειες που σχηματίζουν "βαρέλια« Οι διάφορες διαμεμβρανικές περιοχές "συνεργάζονται" και "κτίζουν" την τελική τριτοταγή δομή του μεταφορέα η οποία θα εμπεριέχει ένα υδρόφιλο "μονοπάτι" μέσω του οποίου θα "ταξιδέψει" το υπόστρωμα τους Στα Κανάλια και τις Πορίνες, σχηματίζεται μια δίοδος (πόρος), της οποίας το άνοιγμα είναι συχνά ελεγχόμενο, μέσω της οποίας μεταφέρονται τα υποστρώματα (συνήθως ιόντα, νευροδιαβιβαστές) μόνο από υψηλή συγκέντρωση σε χαμηλότερη (διάχυση). Ο έλεγχος του σύντομου ανοίγματος μπορεί να είναι μοριακός ή ηλεκτρογενής. Οι Μεταφορείς αντίθετα, έχουν ένα εξειδικευμένο κέντρο δέσμευσης του υποστρώματος όμοιο με αυτό των ενζύμων. Η δέσμευση του υποστρώματος στην μια πλευρά της μεμβράνης προκαλεί αλλοστερικές αλλαγές που μεταφέρουν το δεσμευμένο υπόστρωμα από την αντίθετη πλευρά της μεμβράνης.

16 Υπάρχει ουσιαστική διαφορά;
Μεταφορείς & Κανάλια Υπάρχει ουσιαστική διαφορά; Μεταφορείς: εύκαμπτη, δυναμική. Έλλειψη ανοιχτού πόρου δέσμευση υποστρώματος- αλλαγή διαμόρφωσης-μεταφορά Κινητική Michaelis-Menten ( molecules/sec) και εξειδίκευση. Δομή: διαμεμβρανικές α-έλικες, μικρές ή μεγαλύτερες θηλιές, Κανάλια: Διαλογή ιόντος μέσω μοριακώνφίλτρων και ελεγχόμενο άνοιγμα-κλείσιμο πόρου (gating). 107 ions/sec (ηλεκτρικό ρεύμα). Ολιγομερή σύμπλοκα. Δομή: 2-6 διαμεμβρανικές α-έλικες 16

17 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ Ελεγχόμενη Επικοινωνία των κυττάρων ή των κυττάρων με το περιβάλλον τους ·        Θρέψη κυττάρων ή ετερότροφων ιστών ·        Κατανομή μεταβολιτών σε οργανίδια ·        Απέκκριση τοξικών ουσιών ·        Μεταφορά μορίων "άμυνας" του οργανισμού σε καταπονημένους ιστούς Μεταγωγή μοριακών σημάτων (π.χ. νευροδιαβιβαστές, ορμόνες) Ευκαιριακοί υποδοχείς ιών

18 ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ στην ιατρική & φαρμακολογία
Στους παθογόνους μικροοργανισμούς οι μεταφορείς αποτελούν μόρια στόχους για την αναστολή της θρέψης διαμεσολαβητές πρόσληψης φαρμάκων Στα θηλαστικά η σωστή λειτουργία μεταφορέων είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού. Ο μεταφερόμενος μεταβολίτης μπορεί να χρησιμεύει ως μοριακό σήμα, νευροδιαβιβαστής, μόριο άμυνας ή ορμόνη. Μια σειρά από σοβαρές γενετικές ασθένειες (κυστική ίνωση, γενική ή συγγενής μυοτονία, κυστινουρία κ.α) οφείλονται σε μεταλλαγές σε γονίδια που κωδικεύουν μεταφορείς. Επίσης οι μεταφορείς μεσολαβούν στη διαμεταφορά καθορίζοντας την αποδοτικότητα διαφόρων αντικαρκινικών, αντιικων και αντιπαρασιτικών φαρμάκων Στα φυτά η τροποποίηση της δράσης μεταφορέων θα μπορούσε να αποβεί χρήσιμη στη βελτιστοποίηση της θρεπτικής αξίας των φρούτων ή στην ανθεκτικότητα των φυτών σε καταπονήσεις

19 ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ στη βασική έρευνα
Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-μεταβολιτών Δομή διαμεμβρανικών πρωτεϊνών Τοπογένεση-Στόχευση-Ενδοκυτταρικά «ταξίδια» Εξαιρετική δομική ομοιομορφία καθώς και η ύπαρξη συντηρημένων προτύπων αμινοξικών αλληλουχιών σε μεταφορείς με παρόμοια λειτουργία από τους μικροοργανισμούς μέχρι τους ανώτερους οργανισμούς, υποδεικνύει ότι η κατάλυση της μεταφοράς περιλαμβάνει κοινούς μηχανισμούς και επιπλέον επιτρέπει την πρόβλεψη ότι απλοί οργανισμοί-πρότυπα μπορούν να συμβάλλουν ουσιαστικά στη λειτουργική ανάλυση ομόλογων μεταφορέων από περισσότερο πολύπλοκους οργανισμούς.

20 ΕΙΔΗ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ
1.     Απλή Διάχυση μέσω λιπιδίων [περιορισμένη] 2.     Διευκολούμενη Διάχυση μέσω διαμεμβρανικών πρωτεϊνών X X

21 Ενεργός μεταφορά μέσω διαμεμβρανικών πρωτεϊνών
Αντίθετα με τη διάχυση, ουσίες μπορούν να μεταφερθούν ενάντια σε κλίση συγκέντρωσης με κατανάλωση ενέργειας X ATP ADP H + , Na Πρωτογενής Ενεργειακή Μεταφορά (Δέσμευση και υδρόλυση ATP) Ενεργός μεταφορά μέσω διαμεμβρανικών πρωτεϊνών [η σημαντικότερη μέθοδος για την θρέψη] Δευτερογενής Ενεργειακή Μεταφορά (συμμεταφορά ή αντιμεταφορά πρωτονίων ή ιόντων Να, Κ)

22 4. Εξειδικευμένοι μέθοδοι μεταφοράς σε βακτήρια
4.     Εξειδικευμένοι μέθοδοι μεταφοράς σε βακτήρια Μεταφορά χημικής μετατροπής (συνήθως φωσφορυλίωση). Τρία ένζυμα και μια μεταφορική πρωτεΐνη Μεταφορά μέσω αρχικής δέσμευσης σε περιπλασμικούς υποδοχείς και διαμεμβρανικής Πρωτογενούς Ενεργειακής Μεταφοράς (Gram-) X - P

23 ΕΙΔΗ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ……

24

25 ΜΟΝΟΤΟΠΙΚΕΣ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ
ΠΟΛΥΤΟΠΙΚΕΣ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Cytochrome bc1 Complexes Cytochrome C Oxidases Respiratory Proteins P-type ATPase ATP Binding Cassette (ABC) Transporters  Major Facilitator Superfamily Transporters  Multi-Drug Efflux Transporters Ion Channels Beta-Barrel Membrane Proteins Monomeric/Dimeric Beta-Barrel Membrane Proteins Multimeric (Porins and Relatives) Photosystems Light Harvesting Complexes G Protein-Coupled Receptors Sensory Rhodopsin II (SR)  Bacteriorhodopsin (BR)

26 Bacteriorhodopsin 3D crystals,  X-ray,  1.55 Å

27 Περμεάσες τύπου MFS

28 Περμεάσες τύπου MFS

29 Και το Nobel πάει…..στα κανάλια!- Μια απίστευτη ιστορία επιμονής…
Press Release: The Nobel Prize in Chemistry 2003 8 October 2003 The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the Nobel Prize in Chemistry for 2003 “for discoveries concerning channels in cell membranes”, with one half of the prize to Peter Agre Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, USA “for the discovery of water channels” and one half of the prize to Roderick MacKinnon Howard Hughes Medical Institute, The Rockefeller University, New York, USA “for structural and mechanistic studies of ion channels”.                                                                                                                               "We used mutagenesis for nearly 10 years to study how the potassium channel works without getting the answer we needed," said Roderick MacKinnon.

30 KcsA Potassium channel, H+ gated: Streptomyces lividans, 3.2 Å
A Chloride channel

31 KvAP Voltage-Dependent Potassium Channel 1ORQ

32 Η ΠΡΩΤΗ ΔΟΜΗ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ: ΠΕΡΜΕΑΣΗ ΛΑΚΤΟΖΗΣ ΤΗΣ E. coli
Και όμως γίνεται! Science Aug 1;301(5633):610-5 Structure and Mechanism of the Lactose Permease of Escherichia coli Jeff Abramson, Irina Smirnova, Vladimir Kasho, Gillian Verner, H. Ronald Kaback,So Iwata Membrane transport proteins that transduce free energy stored in electrochemical ion gradients into a concentration gradient are a major class of membrane proteins. We report the crystal structure at 3.5 angstroms of the Escherichia coli lactose permease, an intensively studied member of the major facilitator superfamily of transporters. The molecule is composed of N- and C-terminal domains, each with six transmembrane helices, symmetrically positioned within the permease. A large internal hydrophilic cavity open to the cytoplasmic side represents the inward-facing conformation of the transporter. The structure with a bound lactose homolog, ß-D-galactopyranosyl-1-thio-ß-D-galactopyranoside, reveals the sugar-binding site in the cavity, and residues that play major roles in substrate recognition and proton translocation are identified. We propose a possible mechanism for lactose/proton symport (co-transport) consistent with both the structure and a large body of experimental data. ….& Η ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΤΗΣ G3P The structures of LacY and GlpT, together with those of Ca2+-ATPase, MsbA, AcrB, and BtuCD mark a new era in defining transport mechanisms in molecular detail….

33 Ο μηχανισμός του μεταφορέα λακτόζης της E. coli
Μια συναρπαστική ιστορία γενετικής, βιοχημείας & τελικά δομικής βιολογίας VI 302 IX R 269 VIII E XII II I III 240 237 VII D V 144 IV 126 325 322 319 X H K 358 XI Asp237/Lys358 Asp240/ Lys319

34 Η ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΛΑΚΤΟΖΗΣ ΤΗΣ E. coli
Mία μακρά ιστορία πείσματος και τα μικρά τρικ που χρειάστηκαν & η σημασία των μικροβιακών μοντέλων

35 Glycerol-3-Phosphate Transporter From E. coli

36 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ        Δομικές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σε λίγες περιπτώσεις λόγω της δυσκολίας απομόνωσης κρυστάλλων και της μη δυνατότητας εφαρμογής μελετών Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) Εναλλακτικοί μέθοδοι προσέγγισης - έμμεσοι τρόποι δομικών μελετών Γενετική, Βιοχημεία, Μοριακή Βιολογία Πρώτο Στάδιο - Εύρεση Βασικής δομής Καθορισμός αλληλουχίας γονιδίου και εύρεση θεωρητικής πρωτογενούς αλληλουχίας πρωτεΐνης. Συγκριτική Ανάλυση με άλλες αλληλουχίες σε βάσεις δεδομένων. Ταξινόμηση οικογενειών. Όσο πιο όμοια λειτουργία τόσο πιο όμοια αλληλουχία. Πρότυπο υδροφοβικότητας. Χρήση προγραμμάτων (Η/Υ) για την Πρόβλεψη διαμεμβρανικών περιοχών Δεύτερο Στάδιο - Εύρεση Σχέσεων Δομής-Λειτουργίας Επιλογή Μεταλλαγών (κλασσική γενετική). Κατασκευή Μεταλλαγών (αντίστροφη ή μοριακή γενετική). Κατασταλτικές μεταλλαγές. Κατασκευή υβριδικών μεταφορέων. Χρήση της Πρωτεΐνης Πράσινου Φθορισμού (GFP). Αντισώματα. Πρωτεόλυση

37 Συγκριτική Ανάλυση Διαμεμβρανικών Μεταφορέων -Ταξινόμηση οικογενειών-
Μοντέλα δευτεροταγούς δομής Εύρεση μοτίβων- πρόβλεψη ρόλου αμινοξέων- σχεδιασμός κατευθυνόμενων μεταλλάξεων

38 Κατασταλτικές μεταλλαγές
Εξαιρετικό εργαλείο αναγνώρισης ενδοπρωτεϊνικών ή διαπρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Q449E F569A

39 Structure-function relationships in UapA
Q449E Q449P N450D N450E G452A G452V G452P Q126T Q126L Q126E Q126N F569S F569T F569A F569N F569Q Motif 1-Topogenesis? Motif 2 – Substrate binding (Q/E/P)NXGXXXXT(K/R/G) (G/A/S)Q(H/Q) Specificity filter Structure-function relationships in UapA out in

40 Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη (GFP)
ένα εξαιρετικό εργαλείο επαναφέρει τη κυτταρική βιολογία στο προσκήνιο Τοπογένεση στη Μεμβράνη Ελαττωματική τοπογένεση ‘Εκαφραση του χιμαιρικού μεταφορέα προλίνης-Green Fluorescent Protein στον Aspergillus nidulans

41 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ-ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ
1.     ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ    Εξειδίκευση Συνάφεια-Συγγένεια ( Κm) 2.     ΚΑΤΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ Tαχύτητα-Απόδοση (V) 3. ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ (ATP, κλίση H+, Na+, K+) Η απαιτούμενη ενέργεια αποκτάται είτε από την υδρόλυση του ATP (πρωτογενής ενεργητική μεταφορά) είτε από την ταυτόχρονη μεταφορά (συμμεταφορά ή αντιμεταφορά) ιόντων όπως τα ιόντα Η+ ή Na+, Κ+ (δευτερογενής ενεργητική μεταφορά) Η ομοιότητα της αμινοξικής αλληλουχίας των μεταφορέων είναι ανάλογη της εξειδίκευσής τους. Αντίθετα οι ενεργειακές απαιτήσεις και τα κινητικά χαρακτηριστικά διαφορετικών μεταφορέων είναι ανεξάρτητα από την εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα τους και μάλλον αντιπροσωπεύουν την εξελικτική προσαρμογή τους στο περιβάλλον στο οποίο λειτουργούν