Βασικές αρχές Μοριακής Βιολογίας Burton E. Tropp Jones & Bartlett Learning 2014 Aκαδημαϊκές Εκδόσεις 2015 Κεφάλαιο 15: Γονιδιακή αποσιώπηση μέσω μικρών.

Παρουσίαση με θέμα: "Βασικές αρχές Μοριακής Βιολογίας Burton E. Tropp Jones & Bartlett Learning 2014 Aκαδημαϊκές Εκδόσεις 2015 Κεφάλαιο 15: Γονιδιακή αποσιώπηση μέσω μικρών."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Βασικές αρχές Μοριακής Βιολογίας Burton E. Tropp Jones & Bartlett Learning 2014 Aκαδημαϊκές Εκδόσεις 2015 Κεφάλαιο 15: Γονιδιακή αποσιώπηση μέσω μικρών RNA

2 15 Γονιδιακή αποσιώπηση μέσω μικρών RNA

3 ΕΙΚΟΝΑ 15.1 Τα κυριότερα ανατομικά χαρακτηριστικά του νηματώδους σκώληκα C. elegans

4 ΕΙΚΟΝΑ 15.2 Η μεταγραφή και η μετάφραση ενός οπερονίου του C. elegans Τα γονίδια ενός οπε- ρονίου υπόκεινται στον έλεγχο ενός κοινού υποκινητή, από όπου αρχίζει η μεταγραφή τους για να σχηματιστεί ένα κοινό πρόδρομο μόριο pre- mRNA. Το pre-mRNA υφίσταται επεξεργασία, από την οποία προκύπτουν δια- φορετικά ώριμα μόρια mRNA. Καθένα από αυτά τα μόρια μετα- φράζεται σε ένα ξεχω- ριστό πολυπεπτίδιο.

5 ΕΙΚΟΝΑ 15.3 Η παρεμβολή RNA (RNAi) Νηματώδεις σκώληκες C. elegans ενέθηκαν με σημαίνον RNA, αντισημαίνον RNA ή δίκλωνο RNA του γονιδίου unc-22. Μετά από 3 ώρες παρατηρήθηκε η κίνησή τους. Πολύ λίγοι από τους σκώληκες που είχαν ενεθεί με σημαίνον RNA ή αντισημαίνον RNA παρουσίασαν ασυντόνιστη κίνηση. Αντίθετα, σχεδόν όλοι οι σκώληκες που είχαν ενεθεί με δίκλωνο RNA παρουσίασαν ασυντόνιστη κίνηση λόγω σπασμωδικών συσπάσεων.

6 ΕΙΚΟΝΑ 15.4 Πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για την παραγωγή δίκλωνου RNA Το γονίδιοστόχος (γαλάζιο χρώμα) έχει εντεθεί σε έναν κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα (μπλε χρώμα). Εκατέ-ρωθεν της αλληλουχίας του γονιδίου υπάρχει από ένα αντίγραφο του ίδιου υποκι-νητή (πράσινο χρώμα). Έτσι πραγματοποιείται μετα- γραφή και προς τις δύο κατευθύνσεις, με αποτέ- λεσμα να συντίθεται και ο σημαίνων και ο αντιση- μαίνων κλώνος RNA του γονιδίου. Τα κόκκινα βέλη υποδηλώνουν την κατεύ- θυνση της μεταγραφής.

7 ΕΙΚΟΝΑ 15.5 Το μονοπάτι της RNAi στον C. elegans (1) Η Dicer, που είναι ένα ένζυμο με ενεργότητα RNάσης III, συνδέεται με την RDE-4 (μια πρωτεΐνη που προσδένεται σε δίκλωνο RNA), σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο το οποίο κόβει το μακρύ δίκλωνο RNA σε μικρά δίκλωνα μόρια RNA καθορισμένου μεγέθους που ονομάζονται μικρά παρεμ-βαλλόμενα RNA (siRNA). (2) Ο ένας από τους δύο κλώνους του siRNA αλληλεπιδρά με μια πρωτεΐνη Αργοναύτη και με άλλες πρωτεΐνες, σχηματίζοντας ένα νουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που ονομάζεται επαγόμενο από RNA σύμπλοκο αποσιώπησης (siRISC). (3) Το μονόκλωνο RNA καθοδηγεί το siRISC στο mRNAστόχο, το οποίο κόβει στη συνέχεια η πρωτεΐνη Αργοναύτης. Παρότι το βασικό αυτό μονοπάτι ισχύει γενικά και σε άλλους ευκαρυώτες, διαφέρει σε ορισμένες λεπτο- μέρειες από οργανισμό σε οργανισμό.

8 ΕΙΚΟΝΑ 15.6 Σχηματική αναπαράσταση των δομικών επικρατειών της Dicer (α) Η Dicer του ανθρώπου και (β) η Dicer του C. elegans. Οι επικράτειες που υποδεικνύονται είναι οι εξής: ΑΤΡάσης/ελικάσης, DUF283 (η λειτουργία της είναι άγνωστη), PAZ, RNάσης IIIa, RNάσης IIIb και dsRBD (επικράτεια πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA).

9 ΕΙΚΟΝΑ 15.7 Η συναρμολόγηση του συμπλόκου siRISC στην Drosophila Η Dicer 2 (Dcr-2) και η R2D2, μια πρωτεΐνη που προσδένεται σε δίκλωνο RNA, αλληλεπιδρούν με το siRNA, σχηματίζοντας το σύμπλοκο φόρτωσης του RISC. Κατόπιν, προστίθεται και η πρωτεΐνη Αργοναύτης Ago 2, οπότε σχηματίζεται το σύ- μπλοκο pre-RISC. Στη συνέχεια, η Ago 2 τεμαχίζει τον κλώνο-επιβάτη, και τα τμήματά του απο- δεσμεύονται από το pre-RISC. Έτσι προκύπτει το ενεργό σύμπλοκο siRISC, που περιλαμβάνει τον κλώνο-οδηγό μέσω του οποίου προσδένεται στο mRNA-στόχο. Με κόκκινο τρίγωνο υποδεικνύονται οι θέσεις στις οποίες κόβεται το RNA. Το σύμπλοκο φόρτωσης του RISC και το siRISC διαθέτουν επιπλέον πρωτεΐνες που δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόμα και ως εκ τούτου δεν εμφανίζονται στο σχή-μα. Στην εικόνα παρουσιάζεται η συναρμολόγηση του siRISC στην Drosophila, όμως η ίδια διαδικασία ακολουθείται και σε άλλα ζώα, αν και μπορεί να διαφέρει σε κάποιες λεπτομέρειες από οργανισμό σε οργανισμό.

10 ΕΙΚΟΝΑ 15.8 Μεταγραφή σε ένα τρανσποζόνιο

11 ΕΙΚΟΝΑ 15.9 Το φαινόμενο της μεταβατικής RNAi Κατά τη μεταβατική RNAi στον C. elegans, η αποσιώπηση εξαπλώνεται ανοδικά ενός mRNA- στόχου, υπό την έννοια ότι, ενώ αρχικά τα siRNA στοχεύουν μια συγκεκριμένη περιοχή του mRNA- στόχου, σε επόμενη φάση παράγονται δευτερογενή siRNA που στοχεύουν νέες, ανοδικές περιοχές του. Το φαινόμενο αυτό ανακαλύφθηκε σε γενετικά τροποποιημένους σκώληκες που εκτός από το φυσιολογικό unc-22 έφεραν και ένα υβριδικό γονίδιο προερχόμενο από τη συγχώνευση του γονιδίου της πρωτεΐνης GFP με ένα τμήμα του unc-22. Ένα δίκλωνο RNA που στόχευε το γονίδιο της GFP οδηγούσε, όπως αναμενόταν, σε απώλεια του φθορισμού. Όταν όμως το unc-22 είχε συντηχθεί ανοδικά του γονιδίου της GFP (αριστερά), το δίκλωνο RNA του γονιδίου της GFP προκαλούσε εντελώς απροσδόκητα στους σκώληκες πέραν της απώλειας του φθορισμού και αδυναμία συντονισμού των κινήσεών τους. Το γεγονός αυτό έδειχνε πως η αποσιώπηση είχε εξαπλωθεί ανοδικά στο υβριδικό γονίδιο, ώστε πλέον να περιλαμβάνει και τις αλληλουχίες του unc-22. Όταν το unc-22 είχε συντηχθεί καθοδικά του γονιδίου της GFP (δεξιά), η έκφρασή του δεν επηρεαζόταν, όπως αποδεικνυόταν, από το γεγονός πως οι σκώληκες δεν εμφάνιζαν κινητικά προβλήματα.

12 ΕΙΚΟΝΑ 15.10 Παραδείγματα αλληλεπίδρασης του miRNA lin-4 του C. elegans με το mRNAστόχο του lin-14 Το RNA 22 νουκλεοτιδίων που προκύπτει από το αρχικό μετάγραφο του lin-4 θεωρείται ότι ζευγαρώνει με επτά θέσεις της 3′ αμετάφραστης περιοχής του lin-14. Στο σχήμα παρου- σιάζονται οι δύο από τις θέσεις αυτές. Το κατάλοιπο C που υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα μένει αζευγάρωτο σε τέσσερις από τις επτά θέσεις-στόχους του lin-4. Η μεταλλαγή αυτού του καταλοίπου σε U οδηγεί σε απώλεια λειτουργίας του lin-4.

13 ΕΙΚΟΝΑ 15.11 Το μονοπάτι σχηματισμού του miRISC στην Drosophila Τα πρώτα βήματα του μονοπατιού λαμβάνουν χώρα στον πυρήνα και εξαρτώνται από το αν η αλληλουχία του miRNA βρίσκεται σε ιντρόνιο ή όχι. Αν η αλληλουχία του miRNA (σκούρο πράσινο) βρίσκεται σε ιντρόνιο, τότε, μετά την απελευθέρωσή του σε μορφή λάσου κατά το μάτισμα, μετατρέπεται σε γραμμικό μόριο από το ένζυμο αποδιακλάδωσης του λάσου και αναδιπλώνεται ώστε να αποκτήσει την τυπική δομή φουρκέτας των pre-miRNA. Αν η αλληλουχία του miRNA δε βρίσκεται σε ιντρόνιο, τότε το πρώτο βήμα της επεξεργασίας του pri-mRNA πραγματοποιείται από ένα σύμπλοκο που ονομάζεται Μικροεπεξεργαστής. Ο Μικροεπεξεργαστής, που διαθέτει μία πρωτεΐνη πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA και μία RNάση ΙΙΙ, απομακρύνει τις πλευρικές αλληλουχίες του pri-mRNA οδηγώντας στην απελευθέρωση του pre-miRNA. Το pre-miRNA που δημιουργείται με έναν από τους δύο παραπάνω τρόπους μεταφέρεται μέσω των πυρηνικών πόρων στο κυτταρόπλασμα. Εκεί, ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο που περιέχει την Dicer-1 και μια πρωτεΐνη πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA αποκόπτει τον ακραίο βρόχο του. Έτσι σχηματίζεται ένα δίκλωνο μόριο miRNA-miRNA* μήκους 22 νουκλεοτιδίων. Το miRNA συνήθως φορτώνεται σε μια πρωτεΐνη Αργοναύτη, οπότε σχηματίζεται το miRISC. Το miRISC περιέχει και άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες δεν εμφανίζονται στο σχήμα γιατί δεν έχουν ακόμα χαρακτηριστεί.

14 ΕΙΚΟΝΑ 15.12 Οι δύο τρόποι δράσης του miRISC Όταν υπάρχει πλήρης ομολογία αλληλουχίας ανάμεσα στο μήκους 22 νουκλεοτιδίων miRNA-οδηγό και σε μια περιοχή του mRNA-στόχου, τότε το miRISC κόβει το mRNA-στόχο. Αν η ομολογία είναι ατελής, τότε το miRISC προσδένεται στην 3′ αμετάφραστη περιοχή του mRNA-στόχου και καταστέλλει τη μετάφρασή του.

15 ΕΙΚΟΝΑ Π15.1α Η οργάνωση των επικρατειών της Dicer του Giardia intestinalis

16 ΕΙΚΟΝΑ Π15.1β Η κρυσταλλική δομή της Dicer του Giardia intestinalis Καθεμία από τις επικράτειες RNάσης διαθέτει στο ενεργό της κέντρο ένα ζεύγος δισθενών ιόντων μετάλλου, τα οποία στην κρυσταλλική δομή είναι ιόντα μαγγανίου (μοβ σφαίρες), ενώ στο κύτταρο ενδέχεται να είναι ιόντα μαγνησίου. Η απόσταση ανάμεσα στα ζεύγη των ιόντων μετάλλου είναι 17,5 Å και αντιστοιχεί στο πλάτος της μεγάλης αύλακας του δίκλωνου RNA. Η απόσταση ανάμεσα στη θέση ΡΑΖ, όπου προσδένεται το 3′ προεξέχον άκρο του δίκλωνου RNA, και στο ενεργό κέντρο της RNάσης ΙΙΙa είναι περίπου 65 Å και αντιστοιχεί στο μήκος περίπου 25 νουκλεοτιδίων του δίκλωνου RNΑ.

17 ΕΙΚΟΝΑ Π15.1γ Σχηματική αναπαράσταση που απεικονίζει την Dicer του G. intestinalis να κόβει το δίκλωνο RNA Η επικράτεια ΡΑΖ προ- σδένεται στο ένα άκρο του δίκλωνου RNA (πρά-σινο). Η απόσταση ανά-μεσα στη θέση πρόσδεσης της ΡΑΖ και στο ενεργό κέντρο της RNάσης ΙΙΙa είναι περίπου 65 Å και αντιστοιχεί στο μήκος 25 περίπου ζευγών βάσεων του δίκλωνου RNΑ. Συνεπώς η Dicer λει-τουργεί σαν μοριακός χάρακας που μετρά και κόβει ανά 25 περίπου νουκλεοτίδια από το άκρο του δίκλωνου RNΑ.