“Mutations causing syndromic autism define an axis of synaptic pathophysiology” Ονοματεπώνυμο φοιτήτριας: Μπαρέτα Ελένη Α.Μ.: 4886 Μάθημα: Βιοτεχνολογία Ακαδ. Έτος: 2011/2012

Τι είναι αυτισμός; Το Φάσμα του Αυτισμού (ASD), περιλαμβάνει μια ομάδα διαταραχών η οποία χαρακτηρίζεται από : - ποιοτικές δυσκολίες στη κοινωνική κατανόηση, συναλλαγή και συναισθηματική αμοιβαιότητα, - δυσκολίες στον τρόπο επικοινωνίας και στη γλώσσα, - περιορισμένο, στερεότυπο, επαναλαμβανόμενο ρεπερτόριο δραστηριοτήτων και ενδιαφερόντων, ενώ στη συμπεριφορά επικρατούν ιδιόρρυθμα ενδιαφέροντα και ενασχολήσεις, - ανομοιογενή ανάπτυξη γνωσιακών λειτουργιών. - συχνά ανακόλουθη επεξεργασία αισθητηριακών προσλήψεων. Οι δυσκολίες και οι περιορισμοί αυτοί, που ποικίλουν σε βαρύτητα από άτομο σε άτομο, αποτελούν διάχυτο χαρακτηριστικό της λειτουργικότητας του.

Πως σχετίζεται ο αυτισμός με το Σύνδρομο Εύθραυστου Χ; Το σύνδρομο εύθραυστου Χ περιλαμβάνει ψυχονευρωτικές αναπτυξιακές διαταραχές που εντάσσονται στο Φάσμα του Αυτισμού. Η μοριακή διαταραχή που σχετίζεται με το σύνδρομο αφορά  την επέκταση της αλληλουχίας CGG στο γονίδιο FMR-1. Ο αριθμός επαναλήψεων της αλληλουχίας CGG στα φυσιολογικά άτομα κυμαίνεται από 6-50 φορές. Στους ασθενείς η αλληλουχία επεκτείνεται πάνω από 200 φορές (πλήρης μετάλλαξη) και έχει σαν αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του γονιδίου και τη μη παραγωγή της πρωτεΐνης FMRP Η πρωτεΐνη FMRP είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύει rRNA και mRNA με σκοπό να αναστείλει τη μετάφραση και τελικά να ρυθμίσει την πρωτεινοσύνθεση. Συμμετέχει σε ένα σηματοδοτικό μονοπάτι που ξεκινάει με τη διέγερση των γλουταμικών υποδοχέων του γκρουπ 1 (mGluR1, mGluR5). Σε ασθενείς με έλλειψη της FMRP το μονοπάτι απορυθμίζεται με αποτέλεσμα την ανεξέλεγκτη πρωτεινοσύνθεση στους νευρώνες.

..και με την Οζώδη Σκλήρυνση; Η Οζώδης Σκλήρυνση αποτελεί επίσης ένα γενετικό σύνδρομο που προκαλεί διάχυτες αναπτυξιακές διαταραχές. Η μοριακή διαταραχή που σχετίζεται με το σύνδρομο αφορά  την μετάλλαξη των κατασταλτικών ογκογονιδίων του συμπλέγματος της οζώδους σκλήρυνσης, TSC1 & TSC2. Απώλεια του TSC1 ή του TSC2 οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα rheb-GTP, μιας GTPασης της οικογένειας ras, οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί μια βασική κινάση σερίνης-θρεονίνης την mTOR, αφου αλληλεπιδρα με ένα ειδικό σύμπλοκό της, το mTORC1. Η ενεργοποίηση του mTORC1 οδηγεί σε καθοδική αλληλουχία μεταγωγής σημάτων της κινάσης με τελικό αποτέλεσμα την συνεχόμενη σύνθεση πρωτεινών που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο, την αγγειογέννεση και τη γλυκόλυση. Η ανεξέλεγκτη αυτή πρωτεινοσύνθεση οδηγεί στη δημιουργία όζων (καλοήθων όγκων) σε διάφορα όργανα του σώματος, συχνοτερα όμως στον εγκέφαλο.

Στην έρευνα μας.. Σκοπός των ερευνητών ήταν να μελετήσουν αν σύνδρομα που μοιράζονται κοινή παθοφυσιολογία οφείλονται σε βλάβες με ίδιο μηχανισμό και σε μοριακό επίπεδο Επέλεξαν τη μελέτη των FXS και TSC γιατί και τα δυο: 1. είναι μονογονιδιακές διαταραχες και εμφανιζουν όλα τα βασικα συμπτωματα των αυτιστικων διαταραχων 2.τα εμπλεκόμενα γονιδια κωδικοποιουν πρωτεινες που συμμετεχουν σε μονοπάτια μεταγωγης σηματος από τους υποδοχεις της επιφανειας του κυτταρου μεχρι την μεταφραση του mRNA 3.διαθέτουν μοντελα καλα μελετημένα σε ποντικους 4.καποια από τα μοντελα αυτά σε προηγούμενες μελέτες είχαν ανταποκριθεί θετικά σε φαρμακευτικη αγωγή για την αναστολή της πρωτεινοσύνθεσης

Συγκεκριμένα: Η βασικη υποθεση ηταν εάν το mTORC1 επαγει την πρωτεινοσυνθεση μεσω του ιδιου μονοπατιου που δρα και η FMRP, δηλαδη εκεινου που ξεκινα με τη διεγερση του mGluR5 στην επιφανεια του κυτταρου. Εάν αυτό επαληθευόταν, φαρμακα τα οποια καταστέλουν τον γλουταμινικο υποδοχεα θα μπορουσαν να ελέγξουν την πρωτεινοσυνθεση στην περιπτωση της TSC, όπως ακριβως ειχε παρατηρηθει να συμβαινει στην περιπτωση του FXS.

Οι mGluRs-Μεταβοτροπικοι γλουταμινικοι υποδοχεις Οι ιονοτροπικοί υποδοχείς συνδέονται με ένα κανάλι μέσα από το οποίο περνούν ιόντα (π.χ. Na+ και K+). Το κανάλι αποτελείται από 5 υπομονάδες τοποθετημένες κυκλικά. Οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς δεν συνδέονται με κανάλια, αλλά με ρυθμιστικές G- πρωτεΐνες μέσα στην κυτταρική μεμβράνη, οι οποίες βοηθούν στη μεταφορά του σήματος. Oι τελεστές είναι εκτελεστικές πρωτεΐνες που βοηθούν στη παραγωγή δεύτερων αγγελιοφόρων Αυτοί οι υποδοχείς ρυθμίζουν ή τροποποιούν την τεράστια ποικιλία χημικών διεργασιών που πραγματοποιούνται στο εσωτερικό των νευρώνων και για το λόγο αυτό η επίδραση που ασκούν οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς ονομάζεται νευρορύθμιση ή νευροτροποποίηση.

Μία γεύση για το πώς δουλεύει το σύστημα… Η φυσιολογική ηλεκτρική απάντηση στην απελευθέρωση νευροδιαβιβαστή αποτελεί μέτρηση της συναπτικής ισχύος. Αυτή μπορεί να ποικίλλει και η μεταβολή μπορεί να διαρκεί για λίγα δευτερόλεπτα, λίγα λεπτά ή ακόμη για μια ζωή. Μακράς διάρκειας μεταβολές στη συναπτική ισχύ μπορούν να προκληθούν από σύντομες περιόδους νευρωνικής δραστηριότητας, κυρίως σε δύο διαδικασίες που ονομάζονται μακροπρόθεσμη ενδυνάμωση (long-term potentiation, LTP), η οποία αυξάνει την συναπτική ισχύ, και μακροπρόθεσμη καταστολή (long-term depression, LTD), που την μειώνει.

a.Η προκληση LTD σε πυραμιδικους νευρωνες της περιοχης CA1του ιπποκαμπου των ποντικων με χρηση του ανταγωνιστη DHPG(3,5-διυδροξυφενυλγλυκινη)-Παρατηρειται σημαντικα ασθενεσθερη LTD στα Tsc2 ετερ. ποντικια σε σχεση με τα WT αντιθετα με την αρχικη προβλεψη. b. Η ιδια διαφορα παρατηρειται και όταν η διεγερση που προκαλει LTD γινεται μεσω των κυτταρων Schaffer που συνδεονται συναπτικα με τα πυραμιδικα κυτταρα στους εγκεφαλους των ποντικων.

c. Δν παρατηρειται καμια διαφορα στην LTD όταν αυτή προκαλειται με διεγερση των NMDA υποδοχεων (με D-AP5) γεγονος που υποδεικνυει ότι η LTD είναι εξαρτωμενη από τον συγκεκριμενο τυπο υποδοχεα d.Για να απορρηφθει η περιπτωση της γενικης διαταραχης του γλουταμινικου υποδοχεα μετρηθηκε η επαγωμενη από DHPG φωσφορυλιωση της κινασης ERK1/2.Οι μετρησεις ηταν ιδιες και στις δυο περιπτωσεις

Ωστοσο στα ποντικα που φερουν τη μεταλλαξη το cycloheximide δν επηρεασε την πρωτεινοσυνθεση.Αυτο πιθανον σημαινει μερικη απωλεια της εξαρτησης της LTD από την πρωτεινοσυνθεση στα μεταλλαγμενα ποντικια Η LTD σε μετασυναπτικο επιπεδο απαιτει αμεση μεταφραση RNΑ (πρωτεινων που θα επηρεασουν την εκφραση των AMPA υποδοχεων).Το cycloheximide αναστελει την πρωτεινοσυνθεση αρα και την LTD σε WT ποντικια.

Σε πρωτο σταδιο η υποθεση, ότι δηλαδη ανεξελεγκτη πρωτεινοσυνθεση επαγωμενη από τη δραση του mGluR5 συμβαινει στα Tsc ποντικια, απορριφθηκε.Ωστοσο οι ερευνητες θεωρησαν ότι μπορει τα αποτελεσματα στις μετρησεις της LTD να οφειλονται σε ελλατωματικη συνθεση των απαιτουμενων πρωτεινων. Η υποθεση αυτή οφειλεται στην παρατηρηση ότι στα μεταλλαγμενα ποντικια είναι μειωμενη η ποσοτητα μεθειονινης/κυστεινης (ραδιοισοτοπων) που ενσωματωνονται εκ νεου σε πρωτεινες

Μελετησαν ετσι συγκεκριμενα την πρωτεινη Arc, μια πρωτεινη που συντιθεται αμεσα μετα από διεγερση του mGluR και που είναι απαραιτητη για την LTD.Ωστοσο και η ποσοτητα του Arc είναι μειωμενη στα ποντικια που φερουν τη μεταλλαξη.(ανοσοαποτυπωση) Για να διευκρινιστει εάν η μειωση στην ποσοτητα του Arc οφειλοταν σε αναστολη της συνθεσης νεου Arc μετρηθηκε το νεοσυντιθεμενο Arc, εμμεσα, με μετρηση της ποσοτητας της σημασμενης μεθειονινης/κυστεινης που ενσωματωθηκε σ αυτό.

Για να εξασφαλιστει ότι η αναφερομενη LTD ειναι μετασυναπτικου επιπεδου, και δηλαδη εξαρτωμενη από την πρωτεινοσυνθεση, χορηγηθηκε η ιδια ποσοτητα rapamycin υπο την παρουσια cycloheximide χωρις και δν παρατηρηθηκε η προηγουμενη μεταβολη Η ιδια ποσοτητα rapamycin επανεφερε τα επιπεδα πρωτεινοσυνθεσης των Τsc στα επιπεδα των WT ποντικων Ο αναστολεας του mTORC1 ,rapamycin,επαναφερει τα επειπεδα της LTD στ α φυσιολογικα επιπεδα.Αυτο πιθανον να υποδεικνυει ότι η μειωμενη mGluR-LTD οφειλεται στην αναστολη της πρωτεινοσυνθεσης απο το mTOR

Θετικη αλλοστερικη τροποποιηση του mGluR5 από το CDPPB ενισχυει το σηματοδοτικο μονοπατι και επαναφερει τα επιπεδα LTD στα φυσιολογικα παρα τη δραση του mTOR Η επαναφορα αυτή οφειλεται στην πρωτεινοσυνθεση αφου αναστελλεται και παλι από το cyclohexamide

To CDPPB επαναφερει τα επιπεδα και την ολικης πρωτεινοσυνθεσης αλλα και της συνθεσης Arc συγκεκριμενα. Για να εξετστει εάν η χορηγηση του CDPPB βελτιωνει τις ικανοτητες μνημης και μαθησης των Tsc ποντικων υποβληθηκαν σε δοκιμασια φοβου.Τα Tsc ποντικια δεον αναγνωριζαν το περιβαλλον που ειχαν υποστει το πρωτο σοκ σε αντιθεση με τα WT.Αυτο διορθωθηκε με τη χορηγηση CDPPB.

Η διασταυρωση ζώων ώστε να είναι φορεις και του FXS και της TSC δημιουργησε ζωα με φυσιλογικα επιπεδα LTD και πρωτεινοσυνθεσης

Τελικα… Δυο μεταλλαξεις οι οποιες προκαλουν ιδιου τυπου γνωσιακες διαταραχες μπορει να οφειλονται σε αντιδιαμετρικα αντιθετες μοριακες βλαβες. Ενδεχομενως το αιτιο της μιας να αποτελει θεραπευτικη λυση για την άλλη.

Οι μεθοδοι Τα συναπτικα δυναμικα μετρηθηκαν με εξωκυτταρια ηλεκτροδια Οι πρωτεινες στοχοι ανιχνευτηκαν με ανοσοαποτυπωση western blot

Βιβλιογραφια Mark F. Bear et al “Mutations causing syndromic autism define an axis of synaptic pathophysiology” Nature (2011) 480, 63–68 Εric R.Kandel, James.H. Schwartz, Thomas M. Jessell,“Νευροεπιστημες και συμπεριφορα”, Πανεπιστημιακες εκδοσεις Κρητης