ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΙ Με βάση τη ροδοψίνη Σύνθετοι οφθαλμοί Απλοί οφθαλμοί Δομές Hofbauer-Buchner ΕΚΦΡΑΖΟΜΕΝΟΙ ΣΤΟ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ κρυπτόχρωμα

 Ανήκει στην ομάδα των φλαβοπρωτεϊνών  Είναι ευαίσθητο στα μπλε μήκη κύματος  Δύο γονίδια Cry1 και Cry2 κωδικοποιούν τις αντίστοιχες πρωτεΐνες

Συντηρημένες περιοχές σε διάφορα είδη

 Παρόμοια δομή με φωτολυάση

Domain φωτολυάσης από CRY Arabidopsis(α) και E.coli(b) Η αναδίπλωση της πρωτεΐνης και οι τομείς της

Καθοριστικός ρόλος στη ρύθμιση των κιρκάδιων ρυθμών φυτών και ζώων

Λειτουργούν ως αισθητήρες των μαγνητικών πεδίων

1. Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς 2. Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως 3. Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων 4. Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης 5. Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

Τονική διέγερση με λευκό φως και άμεση διέγερση με μπλε φως

Η συχνότητα διέγερσης σε φως/σκοτάδι ποικίλλει ανάλογα με την ένταση του φωτός. Οι λανθασμένες μπάρες οφείλονται στο SEM

γενετική εκτομή όλων των εξωτερικών φωτοϋποδοχέων με βάση την οψίνη. Δεν είχε καμία επίδραση στην ανταπόκριση των νευρώνων στο φως. Γενετική εκτομή όλων των εξωτερικών φωτοϋποδοχέων με βάση την οψίνη. Δεν είχε καμία επίδραση στην ανταπόκριση των νευρώνων στο φως.

Αντιπροσωπευτικές καταγραφές της ανταπόκρισης των νευρώνων στα διάφορα μήκη κύματος

φασματικά προφίλ της ανταπόκρισης στο φως ανάμεσα στις φυσιολογικές και τις gl60j είναι αμελητέες ενώ είναι σημαντικές αναφορικά με τις CRYb. φασματικά προφίλ της ανταπόκρισης στο φως ανάμεσα στις φυσιολογικές και τις gl60j είναι αμελητέες ενώ είναι σημαντικές αναφορικά με τις CRYb.

1. Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς 2. Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως 3. Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων 4. Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης 5. Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

 Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς

J. Benito et al J. Biol. Rhythms 23, 296 (2008)

Η ανοσοκυτταροχημεία επιβεβαιώνει την μητρική έκφραση CRY στις μύγες ελέγχου

Απουσία anti-CRY σήματος

Εξακρίβωση ύπαρξης anti-CRY σήματος σε μύγες με γενετική διάσωση της έκφρασης CRY

Αντιπροσωπευτικές μετρήσεις σε μύγες με έλλειψη του γονιδίου cry και σε νευρώνες που έχει γίνει γενετική διάσωση του cry

Απεικόνιση ανταπόκρισης σε διαδοχικούς κύκλους φωτεινών/σκοτεινών συνθηκών

1. Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς 2. Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως 3. Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων 4. Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης 5. Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

 Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως

 Οι μύγες με έλλειψη του γονιδίου Cry παρουσίασαν φυσιολογική αυθόρμητη αντίδραση των νευρώνων σε ηλεκτρική διέγερση αλλά καμία αντίδραση στο φως  ΑΡΑ, το Cry είναι απαραίτητο για την αντίδραση των νευρώνων στο φως

 CRY  παρέχει ανταπόκριση στο φως σε εγγενώς αδρανείς νευρώνες  ΔΕΙΓΜΑ  οσφρητικοί νευρώνες

 Δυνατότητα να παρέχουν αυτόνομη ανταπόκριση στο φως  Ύπαρξη ενός συντηρημένου μηχανισμού σύζευξης για αλλαγές στην μεμβράνη νευρώνων που δεν σχετίζονται με τους κιρκάδιους ρυθμούς  Μη συσχέτιση με το μηχανισμό CRY-TIM

Αντίδραση των τροποποιημένων νευρώνων σε διαδοχικούς κύκλους έντονου μπλε φωτός

Φασματικό προφίλ οσφρητικών νευρώνων ΔΕΞΙΑ : τροποποιημένοι νευρώνες με έκφραση CRY ΑΡΙΣΤΕΡΑ : φυσιολογικοί οσφρητικοί νευρώνες

 Ανταπόκριση των τροποποιημένων νευρώνων σε λευκό, μπλε-ιώδες, και σκούρο μπλε και όχι σε πορτοκαλί  Παρόμοια αντίδραση με τους νευρώνες που εκφράζουν φυσιολογικά την πρωτεΐνη

Το CRY είναι απαραίτητο στοιχείο για την ανταπόκριση των νευρώνων στο φως

1. Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς 2. Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως 3. Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων 4. Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης 5. Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

 Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων

 Μελέτη ισομορφών CRY  Αφαίρεση αμινοξέων από το C- τελικό άκρο  Cry m  πρόσδεση σε ΤΙΜ εξίσου καλά με φυσιολογικό  εξαρτώνται από το φως A. Busza of the et al, role of the two Drosophila CRYPTOCHROME structural domains in circadian photoreception. Science 304, 1503

Είναι απαραίτητη η φωτοεξαρτώμενη αλληλεπίδραση CRY-TIM για το μηχανισμό που μελετάμε;

ΠΑΝΩ: μύγες με έλλειψη ΤΙΜ ΚΑΤΩ: μύγες με CRY m

 Έντομα  CRY 2  αποτελεί ισχυρό μεταγραφικό ρυθμιστή, αλλά δεν έχει ευαισθησία στο φως Q. Yuan et al Insect cryptochromes: Gene duplication and loss define diverse ways to construct insect circadian clocks. Mol. Biol. Evol. 24, 948 (2007).

CRY1 και CRY2 από έντομα

 ΑΡΑ, απαιτείται CRY που είναι φωτοευαίσθητο αλλά όχι μεταγραφικό ενεργό

Σημειακή μετάλλαξη αποσταθεροποιεί το σημείο σύνδεσης της χρωμοφόρου φλαβίνης R. Stanewsky et al The cryb mutation identifies cryptochrome as a circadian photoreceptor inDrosophila. Cell 95, 681 (1998).

 Οξεία αναστολή της οξειδοαναγωγικής αντίδρασης της φωτοεξαρτώμενης φλαβίνης θα μπλόκαρε την αντίδραση των νευρώνων στο φως;

DPI: diphenyleneiodonium chloride Αναστολέας φλαβίνης

Επίδραση DPI στους νευρώνες δείχνει την απουσία των μη ειδικών μεταβολικών επιδράσεων της πυροδότησης

ΤΤΧ: τετραδοτοξίνη ( αναστολέας καναλιών νατρίου) Κ + block: κοκτέιλ αναστολέων καναλιών καλίου Αποδεικνύεται ότι η διαμόρφωση των καναλιών καλίου επηρεάζει την ανταπόκριση των νευρώνων

1. Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς 2. Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως 3. Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων 4. Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης 5. Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

 Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης

Τάση περισσότερων δυναμικών ενέργειας στο φως χωρίς δυνατότητα αναγωγής σε κλίμακα ms 1s πριν και 1s μετά το φως

φιλτράρισμα θορυβού από μεμονωμένες εγγραφές και δίνει ένα καθαρό πλαίσιο εγγραφών

Μεμονωμένες εγγραφές από Α και Β Αύξηση του RMP Αδυναμία μέτρησης FF Οι αλλαγές στο δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης από προκλητές αλλαγές του φωτός συμβαίνουν σε 100ms περίπου.

1. Η ταχεία αύξηση του δυναμικού ενέργειας προς την ουδό πυροδότησης είναι ανεξάρτητη από τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς 2. Απουσία CRY έλλειψη ανταπόκρισης στο φως 3. Έκτοπη έκφραση του CRY μεταβάλλει την ευαισθησία των νευρώνων 4. Σύζευξη CRY-καναλιών Κ + μέσω οξειδοαναγωγικής αντίδρασης 5. Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

 Ταχεία αλλαγή του RMP σε επαναλαμβανόμενους κύκλους φωτός/σκοταδιού

2 ΣΥΝΙΣΤΩΣΕΣ ΒΡΑΔΥΣ + ΤΑΧΥΣ ΕΚΘΕΤΗΣ (ΟΝ+ΟFF) Κλασσικοί φωτοϋποδοχείς Σύζευξη CRY-εκπόλωση καναλιών Ενδιάμεσα στάδια

 Ο οπτικός λοβός περιέχει πλήθος συνάψεων και δεν είναι απίθανο να υπάρχει συνέργια με εξωτερικούς φωτοϋποδοχείς αναφορικά με το FF  Μεγαλύτερο κατώφλι ουδούς πυροδότησης μη διέγερση κυττάρων που σχετίζονται με την δημιουργία εικόνας

 To κρυπτόχρωμα είναι φωτοϋποδοχέας  Προκαλεί τη διέγερση των νευρώνων ύστερα από έκθεση στο φως  Δε σχετίζεται με τους κλασσικούς φωτοϋποδοχείς  Δε σχετίζεται με τη ρύθμιση του κιρκάδιου ρολογιού