« ΒΙΟΡΓΑΝΙΚΕΣ ΝΑΝΟΔΟΜΕΣ » Collagen-Related Peptides (CRP) : αυτ o οργάνωση μικρών, μονόκλωνων αλυσίδων σε λειτουργικό Βιολογικό υλικό στην κλίμακα του μικρομέτρου Ξυνίδη Δήμητρα Α. Μ : 262

 Το κολλαγόνο είναι μια ινώδης πρωτεΐνη που εμφανίζεται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς.  Ιδιαιτερότητα να σχηματίζει αδιάλυτες ίνες με μεγάλη αντοχή στον εφελκυσμό  η πιο άφθονη πρωτεΐνη των θηλαστικών, αποτελεί το ¼ της συνολικής πρωτεΐνης του οργανισμού βασικό συστατικό : δέρματος Οστών τενόντων χόνδρων αγγείων δοντιών Σχήμα : Ίνες κολλαγόνου δέρματος από ηλεκτρονική μικροσκοπία

 βασική δομική μονάδα αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, οι οποίες διαμορφώνονται δεξιόστροφα σε τριπλή έλικα και σχηματίζουν μία άκαμπτη ράβδο. Σε κάθε περιστροφή της έλικας απαντώνται περίπου 3 αμινοξέα.  Οι αλυσίδες, ωστόσο μπορεί να διαφοροποιούνται ως προς το μέγεθος και την ακριβή σύσταση ανάλογα με τον τύπο του κολλαγόνου.

 δύο αμινοξέα την υδροξυπρολίνη (Hyp) και την υδροξυλυσίνη (Hyl)  αλληλουχία αμινοξέων σχεδόν περιοδική τυπική αλληλουχία : Gly- X – Y X= πολύ συχνά προλίνη Υ = πολύ συχνά υδροξυπρολίνη  κάθε τρίτο αμινοξύ είναι γλυκίνη που επιτρέπει στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες να πλησιάζουν η μία την άλλη

Το μόριο αποτελείται και από τα τελοπεπτιδια που είναι μη ελικοειδείς περιοχές στα άκρα των αλυσίδων. Η μια περιοχή είναι καρβοξυλικη και η άλλη αμινική. Σημαντικό ρόλο για σχηματισμό ινιδίων.

Δημιουργία μιας αλυσίδας CRP 1a ( σχήμα ) η οποία θα αυτό – οργανώνεται με μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις σε τριπλή έλικα συνθέτοντας ινίδια. Πειράματα 1a αλυσίδα αποτελείται από την τυπική επαναλαμβανομένη αλληλουχία του κολλαγόνου Gly-Pro-Hyp ενώ οι τελοπεπτιδικες περιοχες περιέχουν κατάλοιπα i) Phe και F 5 -Phe ii) Phe-Phe ii) Phe-Leu και δημιουργούν ( αλληλεπιδρούν ) με μη ομοιοπολικες αλληλεπιδράσεις

R : F 5 -Phe Z: F 5 -Phe φαινυλαλανίνη υποκατεστημένη με 5 φθόρια → πιο υδροφοβικό 1b) FGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF Phe – Phe R : Phe Αρωματικοί δακτύλιοι εκμεταλλευόμενοι την υδροφοβικότητα τους δημιουργούν μη - ομοιοπολικούς δεσμούς 1c) FGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXL Phe - Leu R : Leu Περιέχει τρεις άνθρακες Δεσμοί Van der Waals 1 α ) Phe και F 5 -Phe ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF

XED (extended electron distribution) Πρόκειται για μια θεωρητική μέθοδο στην οποία με βάση το πώς αλληλεπιδρούν μικρά μόρια μεταξύ τους μπορούν να προβλέψουν βασικές παραμέτρους όπως ενέργειες αλληλεπίδρασης μεταξύ μακρομορίων.

Υπολογίζονται οι ενέργειες αλληλεπίδρασης ανάμεσα σε πεπτίδια μιας έλικας με σκοπό τον προσδιορισμό τις τριτοταγούς δομής. Άρα μπορούμε να έχουμε ισχυρές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντιδιαμετρικων άκρων EntrySelf-assembly pairInteraction Energy (kcal/mol): total IE coulombic van der Waals Comments 1Phe- F 5 -Phe (starting with face to face orientation) model of 1a Phe-F 5 -Phe (starting T-shaped orientation) model of 1a Minimizes back to face-to-face orientations 3Phe-Phe model of 1b Minimizes towards edge-to face orientations 4Phe-Leu model of 1c

1a End

Η φασματοσκοπία CD είναι μια μέθοδος απορρόφησης η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δευτεροταγούς δομής. Διάλυμα από 1a: ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF (Z: F 5 -Phe) χαρακτηριστική απορρόφηση κοντά στα 225 nm ( λόγο πλευρικών ομάδων η οποία είναι χαρακτηριστική και για το κολλαγόνο.

Αντίστοιχη θερμική σταθερότητα 1a) ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF (Z: F 5 -Phe) (Tm= 57 0 C) 2a) CH 3 -coo-GPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXG-OH (Tm= 70 0 C)

Οπότε η τριπλή έλικα αρχίζει να σπάει και να αποδιατάσεται σε θερμοκρασίες πολύ υψηλότερες από θερμοκρασία δωματίου και άρα του ανθρώπινου οργανισμού. Η χαμηλή Tm της 1a σε σύγκριση με την 2a μπορεί να οφείλεται σε κάποιες δομικές διασπάσεις στο τέλος της τριπλής έλικας από τους αρωματικούς δακτυλίους.

Τεχνική μέτρησης του σχήματος και του μεγέθους των σωματιδίων που περιέχονται στο διάλυμα. Φως πέφτει πάνω στο διάλυμα → ένα μέρος ακτινοβολίας σκεδάζεται → συσχετίσει των σκεδαζόμενων φωτονίων που δέχεται σε τακτά χρονικά διαστήματα → μετατροπή σε μέγεθος σωματιδίων. Οι διακυμάνσεις της έντασης είναι αποτέλεσμα της κίνησης των σωματιδίων ( κίνηση Brawn)

Όταν τοποθετήσαμε το διάλυμα 1a για ανάλυση → 2 είδη μεγέθους (3nm k αι 190 nm κόκκινο ) Μετά από 24 ώρες → ένα συνολικό υλικό 1000nm ( πράσινο ) 1a) ZGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF Z: F 5 -Phe

Τοποθετήσαμε το διάλυμα 2a για ανάλυση → 2 είδη μεγέθους (4 nm k αι 100 nm) Μετά από 24 ώρες δεν αυξήθηκε 2a) CH 3 -coo-GPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXG-OH Αποτελέσματα δείχνουν ότι η αυτο - οργάνωση 1a ενισχύεται από αλληλεπιδράσεις του F 5 -Phe

Αξιολόγηση της δισδιάστατης δομής και της σύστασης της 1 α. Υδατικό διάλυμα από 1 α τοποθετείται πάνω σε ένα πλέγμα από χαλκό για την απεικόνιση ΤΕΜ και ξεραίνεται σε θερμοκρασία 40 o C Παρατηρούμε δημιουργία συνθετών ινιδίων που μοιάζουν με ινίδια κολλαγόνου. Αριστερή φωτογραφία ινίδια κολλαγόνου από αορτικό ιστό ποντικιού.

Έλεγχος της 1a να μιμηθεί τη βιολογική λειτουργιά κολλαγόνου Τα αιμοπεταλια είναι κύτταρα του αίματος τα οποία είναι πολύ σημαντικά για την πήξη του. Έτσι μετά από μια αγγειακή ζημιά το εκτιθέμενο κολλαγόνο στο τοίχωμα των αγγείων προκαλεί συσσώρευση αιμοπεταλίων που δεσμεύονται σε μεγάλες ποσότητες στις ίνες του κολλαγόνου για την πρόληψη της αιμορραγίας και την προώθηση της επιδιόρθωσης των ιστών

1a) ΖGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXF Z: F 5 -Phe 2b) PXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXGPXG τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι με την πάροδο του χρόνου η 1a αλυσίδα μπορεί να αυτοοργανωθει σε μεγέθη κατάλληλου μήκους και να ικανοποιήσει τις απαιτήσεις για συνάθροιση αιμοπεταλίων

 Δημιουργία μιας αυτοοργανωμενης αλυσίδας CRP 1a με μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις σε ινίδια κολλαγόνου με τις ιδιότητες του μιμητικού κολλαγόνου.  Συγκεκριμένα δημιουργία τριπλής έλικας στην οποία σχηματίζονται σύνθετα ινίδια. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ αρωματικών δακτυλίων δημιουργώντας ισχυρότερους δεσμούς ώστε να ενωθεί η τριπλή έλικα για μεγαλύτερο διάστημα και σχηματίζοντας ισχυρές δομές ( ίνες ).  Η αλυσίδα 1a ενέργησε ως μια λειτουργική πρωτεΐνη με την ικανότητα να προκαλεί συσσώρευση αιμοπεταλίων ανάλογη με το κολλαγόνο