ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΑΛΚΟΟΛΙΚΗΣ ΑΦΥΔΡΟΓΟΝΑΣΗΣ ΤΗΣ D. melanogaster ΣΕ ΑΡΣΕΝΙΚΑ ΑΤΟΜΑ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗΣ ΜΥΓΑΣ Ceratitis capitata ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΝΟΣ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΩΝ ΑΡΡΕΝΟ-ΕΙΔΙΚΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ ΤΑΤΑΡΗ ΜΑΡΙΑΝΘΗ ΠΑΤΡΑ 2006

Η Μεσογειακή μύγα Ceratitis capitata Tephritidae Ceratitis Ceratitis capitata Συνομοταξία Αρθρόποδα Ομοταξία Έντομα Διαίρεση Πτερυγωτά Υποδιαίρεση Ενδοπτερυγωτά Υπέρταξη Μερκοπτεροειδή Τάξη Δίπτερα Υπόταξη Βραχύκερα Υπεροικογένεια Σχιζοφόρα Οικογένεια Γένος Είδος

Ο κύκλος ζωής της Μεσογειακής μύγας

Μέθοδοι καταπολέμησης της Μεσογειακής μύγας εντομοκτόνα: η έντονη χρήση τους έκανε περισσότερο ανθεκτικούς τους πληθυσμούς, ενώ επιπλέον δεν είναι φιλικά προς το περιβάλλον βιολογικές μέθοδοι πληθυσμιακού ελέγχου: α) παγίδες β) παράσιτα της μύγας γ) Τεχνική Στείρων Εντόμων (Sterile Insect Technique)

Sterile Insect Technique (SIT) Στείρα άτομα Γόνιμα άτομα Μείωση του φυσικού πληθυσμού ♂ ♀ ♂ ♀ Προβλήματα: Τάση στείρων ατόμων να ζευγαρώνουν μεταξύ τους και όχι με τα γόνιμα του φυσικού πληθυσμού Τα στείρα θηλυκά άτομα εξακολουθούν να προκαλούν βλάβες στους καρπούς με τον ωοαποθέτη τους

Sterile Insect Technique (SIT) Στείρα άτομα Γόνιμα άτομα Μείωση του φυσικού πληθυσμού ♂ ♀ Πλεονεκτήματα: Αποφυγή ζευγαρώματος με στείρα θηλυκά Καλύτερη κατανομή στο πεδίο Αύξηση της αποδοτικότητας της μεθόδου κατά 3-5 φορές

Στελέχη Γενετικού Διαχωρισμού του Φύλου (Genetic Sexing Strains, GSS) Δημιουργία με τη χρήση μετατοπίσεων μεταξύ του χρωμοσώματος Υ και ενός αυτοσώματος με το επιλογικό γνώρισμα Στελέχη από τα οποία είναι δυνατόν να προκύψουν μόνο αρσενικά άτομα κάτω από περιοριστικές συνθήκες π.χ. αύξηση της θερμοκρασίας ή Στελέχη στα οποία είναι εύκολή η διάκριση των 2 φύλων σε κάποιο στάδιο του κύκλου λόγω μορφολογικών διαφορών π.χ. διαφορετικό χρώμα βομβυκίου

Στελέχη Γενετικού Διαχωρισμού του Φύλου (Genetic Sexing Strains, GSS) Προβλήματα: Μερική αστάθεια σε συνθήκες μαζικής παραγωγής και απώλεια του γνωρίσματος Σχετικά μικρότερη προσαρμοστική ικανότητα λόγω των χρωμοσωμικών ανακατατάξεων Στελέχη Διαχωρισμού Φύλου με τη χρήση διαγονιδιακής τεχνολογίας

Διαγονιδιακή Τεχνολογία και Έλεγχος Επιβλαβών Εντόμων 1982 Rubin and Spralding: πρώτη επιτυχημένη προσπάθεια μετασχηματισμού εμβρύων D. melanogaster με το μεταθετό στοιχείο Ρ 6 Μεταθέσιμα Γενετικά Στοιχεία έχουν χρησιμοποιηθεί για το μετασχηματισμό 15 διαφορετικών ειδών εντόμων Robinson et al., 2004

Το Μεταθετό Στοιχείο Minos Loukeris et al., 1995 Minos: Βρέθηκε ως μια επαναλαμβανόμενη αλληλουχία στο rDNA της D. hydei Συνολικό μέγεθος 1775 nt με ανεστραμμένα επαναλαμβανόμενα άκρα μεγέθους 225 nt το καθένα Δύο μη αλληλεπικαλυπτόμενα ORFs Ανήκει στην οικογένεια Tc-1/mariner και πραγματοποιεί DNA-κατευθυνόμενη μετάθεση Έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία και για το μετασχηματισμό θηλαστικών

Διαγονιδιακή Τεχνολογία και Έλεγχος Επιβλαβών Εντόμων Απαραίτητα μοριακά εργαλεία Υποκινητές που καθορίζουν την ισχυρή συστατική (constitutive) και παραγοντικά-εξαρτώμενη (conditional) έκφραση γονιδίων, καθώς και φυλοειδικοί υποκινητές. Γονίδια δείκτες, τα προϊόντα των οποίων θα διευκολύνουν σημαντικά την αναγνώριση-παρακολούθηση (monitoring) των διαγονιδιακών εντόμων στις μονάδες παραγωγής και στο περιβάλλον μετά την απελευθέρωσή τους Γονίδια Τοξικότητας και γονίδια Ανθεκτικότητας σε διάφορους παράγοντες Γονίδια που συμμετέχουν στον φυλοκαθορισμό

Διαγονιδιακή Τεχνολογία και Έλεγχος Επιβλαβών Εντόμων Αρρενο-ειδικός υποκινητης Γονίδιο ανθεκτικότητας Ανθεκτικότητα και επιβίωση των αρσενικών και θάνατος των θηλυκών α) + Θηλεο-ειδικός υποκινητης Γονίδιο τοξικότητας Θάνατος των θηλυκών και τελική επιβίωση των αρσενικών β) +

Male Specific Serum Proteins (MSSP) Έχουν βρεθεί 5 αρρενο-ειδικές πρωτεΐνες στην αιμολέμφο της Ceratitis capitata (MSSP 1-5) οι οποίες είναι διμερή δύο τύπων πολυπεπτιδίων, των α και β και εμφανίζονται με χαρακτηριστικό χρονικό πρότυπο μετά την εκκόλαψη των ενήλικων ατόμων από τις νύμφες. Καταλαμβάνουν σχεδόν το 50 % των πρωτεϊνών της αιμολέμφου Από τη μελέτη των MSSPs έχουν προκύψει τα ακόλουθα συμπεράσματα: Η σύνθεση των MSSPs ξεκινάει 8-16 ώρες μετά την εκκόλαψη των ενήλικων ατόμων φτάνοντας το μέγιστο επίπεδο την 3η ημέρα Αρχικά κυρίαρχο σε ποσότητα είναι το MSSP α, ενώ μετά την 3η ημέρα συντίθεται κυρίως το MSSP β πολυπεπτίδιο

Male Specific Serum Protein Genes Christophides et al., 2000 Περεταίρω ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό μιας πολυγονιδιακής οικογένειας αρρενο-ειδικών γονιδίων η οποία αποτελείται από 7 διακριτά μέλη τα οποία κατατάσσονται σε 3 υποομάδες mssp a: mssp a1 και α2 mssp β: mssp β1, β2 και β3 mssp γ: mssp γ1 και γ2 Οι υποομάδες mssp α και mssp β οργανώνονται σε ένα σύμπλεγμα μεγέθους 35Κb και παρουσιάζουν εξαιρετική ομοιότητα στην αμινοξική αλληλουχία των προϊόντων τους (84%), ενώ τα μέλη της υποομάδας mssp γ ομαδοποιούνται σε ένα μικρότερο σύμπλεγμα μεγέθους 15Κb και τα προϊόντα τους παρουσιάζουν 57% και 55% ομολογία με τα προϊόντα των mssp α και β αντίστοιχα.

Λειτουργική Ανάλυση των υποκινητών των γονιδίων mssp-α2 και β2 με Γενετικό Μετασχηματισμό α2PS (-283/+37): αρρενο-ειδική έκφραση στο λιπώδη ιστό των ενηλίκων εντόμων α2PL (-522/+37): αρρενο-ειδική έκφραση στο λιπώδη ιστό των ενήλικων εντόμων και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης (5x) β2PS (-287/+37): χαμηλή έκφραση στο μέσο έντερο αρσενικών και θηλυκών ατόμων β2PL (-485/+37): σχετικά υψηλότερη έκφραση στο μέσο έντερο αρσενικών και θηλυκών ατόμων

Αλκοολική Αφυδρογονάση (ADH) Πολύ σημαντικό ένζυμο: α) συμμετέχει στο μεταβολισμό των αλκοολών και β) βοηθάει στην αποτοξίνωση Στη D. melanogaster υπάρχουν 2 βασικές διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου οι: FAST και SLOW Στην C. capitata υπάρχουν 2 γονίδια τα οποία κωδικοποιούν 2 διαφορετικές ως προς την αλληλουχία, τις ιδιότητες και το πρότυπο έκφρασης πρωτεΐνες, τις ADH1 και ADH2 Η DmADHFAST παρουσιάζει μεγαλύτερη ενεργότητα από τις CcADH1 και 2 Πολύ καλό υποψήφιο γονίδιο ανθεκτικότητας για την κατασκευή ενός διαγονιδιακού GSS στελέχους

ΣΚΟΠΟΣ α) β) Αρρενο-ειδική υπερέκφραση της DmADH στη Μεσογειακή μύγα GSS στέλεχος: θάνατος των θηλυκών ατόμων παρουσία αλκοόλης β) β1PL: καθορισμός του φύλο- και χρονο-ειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου msspβ1

Αρρενο-ειδική υπερέκφραση της DmADHFAST στη Μεσογεική μύγα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αρρενο-ειδική υπερέκφραση της DmADHFAST στη Μεσογεική μύγα

Κατασκευή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου Mi-α2PL-DmadhFAST a2PL (-522/+37) Dmadh HSP70P-Ccwhite-HSP70T

Κατασκευή των γενετικά μετασχηματισμένων σειρών της Μεσογειακής μύγας Ισχυρά φαινόμενα θέσης Διαφορετικοί φαινότυποι

Μοριακός χαρακτηρισμός των ενθέσεων Mi-α2PL-DmadhFAST στις μετασχηματισμένες σειρές

Τελικές Ομόζυγες Σειρές Αριθμός Ενθέσεων Ένταση Χρώματος Οφθαλμών α2-1 1 5,5+ α2-2 3,5+ α2-3 3+ α2-4 ♀: 4,5+ ♂: 5+ α2-5 5+ α2-6 2,5+ α2-7 6+ α2-8 2 0,5+ α2-9 α2-10 1,5+ α2-11 α2-12 1+ α2-13 2+ α2-14 4,5+ α2-15 α2-16 4+ α2-17 Σειρές Αριθμός Ενθέσεων Ένταση Χρώματος Οφθαλμών α2-18 1 1,5+ α2-19* 2 ♀: 4+ ♂: 3,5+ α2-20 ♀: 1+ ♂: 1,5+ α2-21 4,5+ α2-22 2,5+ α2-23 α2-24 α2-25 4+ α2-26 3+ α2-27 α2-28 α2-29 ♀: 3,5+ ♂: 4+ α2-30 5,5+ α2-31 4+/w α2-32 α2-33 5+ α2-34 3,5+ Συχνότητα Μετασχηματισμού: 34/1239 x 100% = 3.14%

Μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου DmadhFAST στις μετασχηματισμένες σειρές Αρρενο-ειδικό πρότυπο έκφρασης του διαγονιδίου Φαινόμενα Θέσης Διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου Το στέλεχος wy δεν έδωσε σήμα όπως ήταν αναμενόμενο Τα στελέχη 8, 12, 16, 17, 19, 20, 23, 29 και 30 επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη

Μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου DmadhFAST στις μετασχηματισμένες σειρές Ο υποκινητης είναι αρρενο-ειδικός Μεταγραφική ρύθμιση Τα θηλυκά άτομα εμφανίζουν διπλάσια ενεργότητα ενδογενούςADH σε σχέση με τα αρσενικά H συνολική ενεργότητα ADH στα αρσενικά άτομα των μετασχηματισμένων σειρών είναι πολύ χαμηλότερη από των θηλυκών

Μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου DmadhFAST κατά την ανάπτυξη των ενήλικων ατόμων της σειράς 12 Διατήρηση του αναπτυξιακού προτύπου έκφρασης Το τμήμα α2PL διαθέτει τα απαραίτητα ρυθμιστικά στοιχεία για τη σωστή φυλο- και χρονο- ειδική έκφραση Αναλογία μεταξύ RNA και πρωτεΐνης Μεταγραφική ρύθμιση

Ποσοτική σύγκριση των επιπέδων μεταγραφής του διαγονιδίου DmadhFAST και των ενδογενών γονιδίων mssp-a και –β και Ccadh Dmadh: 1/10 mssp Φαινόμενα θέσης Ανοδικά ή/και καθοδικά ενισχυτικά στοιχεία Περισσότερα του ενός msssp a και β γονίδια που εκφράζονται στα αρσενικά άτομα σε υψηλά επίπεδα Dmadh: 10x Ccadh

Μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου DmadhFAST κατά την ανάπτυξη των ενήλικων ατόμων Στα αρσενικά: η CcADH μειώνεται με την ηλικία, ενώ η συνολική ενεργότητα ADH παραμένει σχεδόν σταθερά σε υψηλά επίπεδα Η DmADH έχει ενεργότητα

Όχι αύξηση των επιπέδων ενεργότητας ADH πάνω από μια ορισμένη τιμή Ομοιοστατικός Μηχανισμός Το γονίδιο Dmadh ΔΕΝ είναι το κατάλληλο γονίδιο επιλογής για τη δημιουργία ενός GSS στελέχους στη Μεσογειακή μύγα

Λειτουργική ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου msspβ1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Λειτουργική ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου msspβ1

Κατασκευή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου Mi-β1PL-lacZ β1PL: -483/+37 του υποκινητή του γονιδίου msspβ1

Μοριακός χαρακτηρισμός των ενθέσεων Mi-β1PL-lacZ στις μετασχηματισμένες σειρές

Τελικές Ομόζυγες Σειρές Αριθμός Ενθέσεων Ένταση Χρώματος Οφθαλμών 1 3+ 4 1,5+ 5 0,5+ 6 2 5+ 8 9 +2 10 1+ 11 4+ 13 14 15 Συχνότητα Μετασχηματισμού: 11/550 x 100% = 2.72%

Μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου lacZ στις μετασχηματισμένες σειρές β1PL όχι αυστηρά αρρενο-ειδικός Φαινόμενα θέσης Ποικιλία έκφρασης του lacZ ανάμεσα στις σειρές

Μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου lacZ κατά την ανάπτυξη των ενήλικων ατόμων της σειράς 1 Τα επίπεδα του RNA φτάνουν το μέγιστο την 2η- 3η μέρα Συμφωνία με το φυσιολογικό πρότυπο έκφρασης των mssp γονιδίων Η πρωτεΐνη φτάνει το μέγιστο κατά την 3η- 4η μέρα

Συγκριτική μελέτη της έκφρασης του διαγονιδίου lacZ με τα γονίδια mssp-a και –β και DmadhFAST lacZ: ~ 1/300 Dmadh το τμήμα β1PL έχει σημαντικά μικρότερη ισχύ από το τμήμα α2PL lacZ: ~ 1/1000 mssp πιθανόν το γονίδιο msspβ1 ΔΕΝ είναι αυτό που εκφράζεται ισχυρά και μαζί με το msspα2 απαρτίζουν το μεγαλύτερο μέρος των πρωτεϊνών της αιμολέμφου των αρσενικών ατόμων

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ α2PL: Ο υποκινητής είναι κατάλληλος για υψηλή αρρενο-ειδική έκφραση διαγονιδίων στη Μεσογειακή μύγα Το γονίδιο Dmadh δε φαίνεται να είναι το κατάλληλο γονίδιο ανθεκτικότητας για τη δημιουργία Στελεχών Γενετικού Διαχωρισμού του Φύλου στη Μεσογειακή μύγα β1PL: Το τμήμα αυτό του υποκινητή είναι αρκετό για την ορθή χρονο- ειδική έκφραση του διαγονιδίου σύμφωνα με το φυσιολογικό πρότυπο έκφρασης των mssp γονιδίων, εντούτοις ΔΕΝ παρουσιάζει αυστηρά αρρενο-ειδικό πρότυπο έκφρασης Η ισχύς του υποκινητή είναι πολύ χαμηλή και επομένως το γονίδιο msspβ1 ΔΕΝ είναι αυτό που συμμετέχει μαζί με το msspa2 στο μεγάλο ποσοστό των MSSP πρωτεϊνών στην αιμολέμφο των αρσενικών ατόμων της Μεσογειακής μύγας