εργαστηριακη διαγνωση και ΑΞΙΟΛΟΓΙΣΗ ΙoΓΕΝΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ ΜΠΟΓΙΑ ΕΥΤΕΡΠΗ ΕΔΕΙΚ/ΜΕΝΗ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΣΥΝΤΟΝΙΣΤΡΙΑ ΓΚΙΟΥΛΑ ΓΕΩΡΓΙΑ

Λοιμώξεις Γρίπη Λαρυγγοτραχειοβρογχίτιδα (croup) Κοινό κρυολόγημα Οξεία βρογχίτιδα Οξεία βρογχιολίτιδα Πνευμονία - βρογχοπνευμονία Κοινό κρυολόγημα Φαρυγγίτιδα Αμυγδαλίτιδα Παραρρινοκολπίτιδα - μέση ωτίτιδα Γρίπη

ΓΝΩΣΤΟΙ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΙ ΙΟΙ RNA DNA PICORNAVIRIDAE ΡΙΝΟΪΟΙ    ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Coxsackie A,B - ECHO ADENOVIRIDAE (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14) MYXOVIRIDAE   ΟΡΘΟΒΛΕΝNΟΪΟΙ Γρίπη Α(Η1),(H2),(Η3), Β, C ΠΑΡΑΒΛΕΝNΟΪΟΙ PIV ( 1-3 ) Πνευμοϊοί RSV CORONAVIRIDAE

ΝΕΟΙ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΙ ΙΟΙ   PICORNAVIRIDAE Parecho 3,4 RNA DNA PARVOVIRIDAE hBoV POLYOMAVIRIDAE BKV (1-4) MYXOVIRIDAE ΟΡΘΟΒΛΕΝΝΟΪΟΙ Γρίπη Α (Η5)(Η7)(Η9)   ΠΑΡΑΒΛΕΝΝΟΪΟΙ hPIV-4 , Nipah Πνευμοϊοί hMPV CORONAVIRIDAE SARS coV, NL63, HKU1, OC43, 229E REOVIRIDAE BYD1

Εργαστηριακή διάγνωση ιώσεων Τρόποι εργαστ. διάγν. Εργαστηριακή διάγνωση ιώσεων                                Άμεση ή ταχεία διάγνωση 2. Καλλιέργεια, απομόνωση, τυποποίηση ιών 3. Ορολογική διάγνωση 4. Μοριακή διάγνωση

1.ΑΜΕΣΗ ή ΤΑΧΕΙΑ διάγνωση Τρόποι άμεσης διάγν. 1.ΑΜΕΣΗ ή ΤΑΧΕΙΑ διάγνωση  Ανεύρεση των σωματιδίων του ιού με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.  Ανίχνευση αντιγόνων του ιού

Ρινοφαρυγγικό επίχρισμα (swab) Ρινοφαρυγγικό έκλπυμα (wash) ΤΙ ΥΛΙΚΟ ? Ρινοφαρυγγικό επίχρισμα (swab) ή Ρινοφαρυγγικό έκλπυμα (wash) πτύελα Βρογχικές εκκρίσεις με προστατευμένη βούρτσα (PSB) Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL):

Πότε? Τα πρώτα 2-3 24ωρα από την έναρξη των συμπτωμάτων του ασθενούς

? Ολικό αίμα? Δεν προτιμάται λόγο του ότι κάποιοι δεν κάνουν καθόλου Ιαιμία ή και όσοι από αυτούς κάνουν δεν κάνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα

Πολυμορφισμός Γρίππη ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ Ιοί Γρίππης

Corona Ιοί Corona

SARS SARS CoV Οι SARS είναι CORONA ιοί .

Αδενο Αδενοϊοί

ΑΜΕΣΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ :Ανίχνευση Ag με ELISA Απαιτείται φωτόμετρο X ιός (δείγμα) Υπόστρωμα ενζύμου Χρώμα + γνωστό Αb σημασμένο με ένζυμο

Rapid Tests Πολύς λόγος κατά την διάρκεια της πανδημίας. Πολύς λόγος κατά την διάρκεια της πανδημίας. Μέθοδος ανοσοχρωματογραφίας. Χρησιμοποιήθηκαν ευρέως. Από διάφορες μελέτες έχουμε χαμηλά ποσοστά ευαισθησίας. ΆΡΑ:μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν ένα 1ο screening test.

2 . Καλλιέργεια Πειραματόζωα Κυτταροκαλλιέργειες Πειραματόζωα Κυτταροκαλλιέργειες Εμβρυοφόρα αυγά όρνιθας Πειραματόζωα: σχεδόν καθόλου. Αυγά : παλαιότερα ο κύριος τρόπος διάγνωσης

Ι . Εμβρυοφόρα αυγά όρνιθας για ιούς Γρίπης-Παρωτίτιδας-Έρπητα απλού Ανεμευλογιάς-Ζωστήρα 10 ΗΜΕΡΕΣ ΕΠΩΑΣΗ

1ο αν είναι ζωντανό το έμβρυο

2ο σημειώνουμε το μάτι του εμβρύου με ένα Χ το οποίο σ΄αυτή την ηλικία των 10-12 ημ είναι πολύ μεγάλο και φαίνεται χαρακτηριστικά οπότε εμβολιάζουμε εκεί τον ιό ώστε να είμαστε σίγουροι ότι τον εμβολιάσαμε μέσα στο έμβρυο και από εκεί ο ιός θα βγει στην αμνιακή και αλαντοϊκη κοιλότητα.

Επώαση 2 ημ.Χ 37οC Συλλογή Ανοίγουμε το αυγό μετά από 2 ΗΜ και συλλέγουμε με ειδικό τρόπο το αμνιακό και αλλαντοϊκό υγρό οπότε διαπιστώνουμε την ύπαρξη των ιών .

Ανίχνευση Ιών με αιμοσυγκόλληση Ιοί Γρίππης, Ερυθράς, Ιλαράς, Παραϊνφλουέντζας κ.ά. Κατάλληλα ερυθρά X ιός Ορατή συγκόλληση των ερυθρών +

Ανάγνωση αποτελέσματος Αιμοσυγκόλληση 1η θετικη 2η αρνητική

Αναστολή αιμοσυγκόλλησης Τυποποίηση ιών Αναστολή αιμοσυγκόλλησης + το κουμπάκι με γνωστό αντίσωμα

ΙΙ .ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΚυΙΙτΙΙτ/καλλ. ΙΙ .ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ Monkey Kidney cells - Πρωτογενής κυτταρική σειρά + Κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις ΚΑΛΛΙΈΡΓΕΙΑ Εμβολιασμός δείγματος Επώαση 3-7 ημέρες Madin-Darby Canine Kidney cells + Συνεχής κυτταρική σειρά - Απουσία κυττ/παθ/κών αλλοιώσεων Συλλογή υπερκειμένου υγρού του καλλιεργήματος

Συνεχόμενη σειρά

Ιοί REO Αδενοϊός

Corona σε Vero

Ιός RS HΕp-2

Τίτλος 3 . Ορολογική διάγνωση Ιώσεων

Ορισμός ΠΟΥ ; ΟΡΟΣ ΑΙΜΑΤΟΣ Ορολογική διάγνωση Ανίχνευση αντισωμάτων =

Τι Αb; Τι αντισώματα ;

Πορεία IgM, IgG IgM ; IgG ; Ολικά ;

IgM IgG Πρόσφατη λοίμωξη: ή ΟΛΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ : Ένα δείγμα Θετικό Πρόσφ. λοίμ. Πρόσφατη λοίμωξη: IgM Ένα δείγμα  Θετικό ή ≥ 4πλάσια αύξηση Αναστολή αιμοσυγκόλησης 2 δείγματα σε 2 εβδομάδες Δύο δείγματα με διαφορά ~2 εβδ ΟΛΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ :  IgG Αρκετά δύσκολο γιατί ο ασθενής δεν επανέρχεται για επανεξέταση αφότου γίνει καλά ,η διαδικασία μέτρησης πρέπει να γίνει ταυτόχρονα και για τα 2 δείγματα από το ίδιο άτομο με την ίδια μέθοδο

IgM IgG Παλιά λοίμωξη: Παλιά λοίμ. Αρνητικά Δύο δείγματα με διαφορά ~2 εβδ.  4πλάσια αύξηση ή και καμία IgG 

4.Μοριακές τεχνικές Στόχος  Γενετικό Υλικό

Ρινοφαρυγγικό επίχρισμα (swab) ΤΙ ΥΛΙΚΟ ? Πτύελα Βρογχικές εκκρίσεις με προστατευμένη βούρτσα (PSB) Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) Ρινοφαρυγγικό επίχρισμα (swab) ή έκλπυμα (wash) Χρήση αίματος δεν συνίσταται.

Πότε? Τα πρώτα 2-3 24ωρα από την έναρξη των συμπτωμάτων.

ΠΡΟΣΟΧΗ ! ( ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ) Μοριακά Προσοχή ΠΡΟΣΟΧΗ ! ( ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ)  Λήψη, μεταφορά, συντήρηση κατάλληλου δείγματος (2 το πολύ 3 24ωρα στην κοινή ψύξη).  Απολύμανση χώρου  Διαφορετικοί χώροι για απομόνωση & πολλαπλασιασμό γενετικού υλικού  Επιλογή κατάλληλων εκκινητών (primers)  Χρήση θετικών & αρνητικών μαρτύρων

Αρχή της PCR Αρχή μεθόδου PCR

Reverse-transcription Μετατροπή RNA σε cDNΑ Ανάστροφη μεταγραφή Όταν έχουμε RNA πρέπει να δημιουργηθεί συμπληρωματικό DNA Ένζυμο : Ανάστροφη μεταγραφάση

Multiplex PCR Χρησιμοποιείται κυρίως από εργαστήρια που ασχολούνται με την διάγνωση των λοιμώξεων του αναπνευστικού με χαμηλά όμως ποσοστά ευαισθησίας και απαιτει πολλους primers (γρίπη Β - RSV A – RSV B )

Γονίδιο της μητρικής πρωτεΐνης REAL TIME PCR RT-PCR για A(H1N1) ΘΕΤΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ όταν και τα 3 γονίδια του ιού θετικά Γονίδιο της μητρικής πρωτεΐνης νουκλεοπρωτεΐνης αιμοσυγκολλητίνης

Ανάλυση αλληλουχίας γωνιδιώματος (SEQUENCE ) προϊόντων της PCR α pp Αρκετά εξειδικευμένα διαγνωστικά κέντρα δεν σταματούν σ ‘αυτό το σημείο( αρνητικό ή θετικό δείγμα) αλλά συνεχίζουν με την ανάλυση του γωνιδιώματος με στόχο: Επιδημιολογική διερεύνηση στελεχών. Ανεύρεση τυχόν μεταλλαγμένων στελεχών Ταυτοποίηση νέων παθογόνων Σύγκριση με τα υπάρχοντα στελέχη και διαφορές από τα στελέχη που συμπεριλαμβάνονται στα εμβόλια .

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ