Φασματοσκοπικές μέθοδοι Φασματοφωτομετρία ορατού-UV Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας – Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Τεχνολογίας Οργάνων Φασματοσκοπικές μέθοδοι Φασματοφωτομετρία ορατού-UV Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 6 Δεκεμβρίου 2017

Ορισμοί: Οι φασματοσκοπικές τεχνικές βασίζονται στην ικανότητα διαφόρων ουσιών να εκπέμπουν ή να αλληλεπιδρούν με ακτινοβολίες χαρακτηριστικών συχνοτήτων. Σε αυτές ανήκουν: Φασματοφωτομετρία Φθορισμομετρία Φασματοφωτομετρία ατομικής απορροφήσεως Φλογοφασματοφωτομετρία Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού

Χαρακτηριστικά ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας Για τον χαρακτηρισμό της ακτινοβολίας χρησιμοποιείται το μήκος κύματος ή η συχνότητα. Μήκος κύματος= η απόσταση μεταξύ δύο διαδοχικών κορυφών του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος και συμβολίζεται με λ. Έχει μονάδες μέτρησης στην υπεριώδη και την ορατή περιοχή το nanometer (nm) και στο υπέρυθρο το micrometer (μm). Συχνότητα= είναι το πλήθος των κυμάτων πού διέρχονται από ένα συγκεκριμένο σημείο και ανά δευτερόλεπτο. Μετρείται σε Hertz.

Διέγερση - Αποδιέγερση Με την επίδραση ακτινοβολίας, ένα ηλεκτρόνιο εγκαταλείπει την τροχιά του και μεταβαίνει σε άλλη τροχιά υψηλότερης ενεργειακής στάθμης, προσλαμβάνοντας ενέργεια, τότε το άτομο διεγείρεται. Στην κατάσταση αυτή το άτομο δεν παραμένει επί πολύ, αλλά επανέρχεται στην προηγούμενη σταθερή κατάσταση (αποδιέγερση) ενώ το ηλεκτρόνιο επιστρέφει στην τροχιά του δίνοντας την ενέργεια πού προσέλαβε προηγουμένως. Η απόδοση της ενέργειας αυτής γίνεται με την μορφή ενός φωτονίου. Τα φωτόνια αυτά, συνιστούν αυτό πού αντιλαμβανόμαστε ως ακτινοβολία.

Έτσι γεννιούνται τα δομικά συστατικά της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, δηλαδή τα φωτόνια. Ανάλογα μάλιστα με την ενέργεια πού αποδίδεται στο αποβαλλόμενο φωτόνιο, αυτό αντιστοιχεί σε ορισμένη συχνότητα ή μήκος κύματος. Αν τώρα αυτό το μήκος κύματος είναι τέτοιο πού μπορεί και διεγείρει τον αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού μιλάμε για το ορατό φώς, αλλιώς έχουμε την αόρατη (υπεριώδη ή υπέρυθρη) περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Με άλλα λόγια το σύνολο των συχνοτήτων πού μπορούν να προκύψουν από την αποδιέγερση των ατόμων αποτελεί το φάσμα της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, ένα τμήμα του οποίου είναι τό φώς. Συγκεκριμένα τό φώς είναι η πολύ μικρή περιοχή πού αντιστοιχεί στο ορατό και φαίνεται σαν έγχρωμη ταινία. Κάθε ένωση που απορροφά στην ορατή περιοχή (400-800nm) εμφανίζεται έγχρωμη

Ιονίζουσες – Μη ιονίζουσες ακτινοβολίες Εάν το ηλεκτρόνιο δεν επιστρέψει στην αρχική του τροχιά, αλλά με την ενέργεια που προσέλαβε καταφέρει να εγκαταλείψει το άτομο, τότε λέμε ότι το άτομο ιονίζεται, μετατρέπεται σε θετικό ιόν και το φαινόμενο ονομάζεται ιονισμός. Κατά τον ιονισμό δηλαδή αλλάζει ουσιαστικά η δομή της ύλης. Οι ακτινοβολίες πού όταν επιδρούν στα άτομα της ύλης καταφέρνουν να της αποσπούν ηλεκτρόνια ονομάζονται ιονίζουσες. Ιονίζουσες είναι και οι σωματιδιακές ακτινοβολίες α (πυρήνων του στοιχείου Ήλιον) και β (θετικών και αρνητικών ηλεκτρονίων) που εκπέμπονται κατά την εκδήλωση της ραδιενέργειας τύπου α ή β, αντίστοιχα, αλλά και η φυσική κοσμική ακτινοβολία πού κυριαρχεί σε μεγάλα ύψη.

Αλληλεπίδραση ακτινοβολίας- ύλης Τύποι αλληλεπίδρασης: Απορρόφηση: Όταν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία διέρχεται μέσα από ένα διάλυμα γίνεται εκλεκτική απορρόφηση αυτής, δηλαδή απορροφούνται μόνο οι ακτινοβολίες, των οποίων τα φωτόνια έχουν ενέργειες που αντιστοιχούν στις ενεργειακές απαιτήσεις του μορίου προκειμένου αυτό να διεγερθεί. Φωταύγεια: Εκπεμπόμενη ενέργεια ως φθορισμός ή φωσφορισμός, ανάλογα με το χρόνο που μεσολαβεί μεταξύ απορροφήσεως και εκπομπής. Εκπομπή: Εκπομπή ακτινοβολίας χαρακτηριστικών μήκων κύματος από διεγερμένα σωματίδια. Η φωταύγεια είναι ειδική περίπτωση εκπομπής. Σκεδασμός:

Χρήση φασματοσκοπικών μεθόδων Με τις φασματοσκοπικές τεχνικές μετρείται η απορρόφηση (Α) ή η διαπερατότητα (Τ) μέσω των οποίων μπορεί να γίνει ποιοτική και ποσοτική ανάλυση ουσιών σε ένα δείγμα. Διαπερατότητα= το ποσοστό της μονοχρωματικής ακτινοβολίας που απορροφάται από ένα διάλυμα Ποιοτική ανάλυση: Εξακρίβωση της δομής της υπό μελέτη ουσίας, την ταυτοποίησή της και την διαπίστωση ύπαρξης χαρακτηριστικών ομάδων → Φάσμα απορρόφησης Ποσοτική ανάλυση: Εύρεση συγκέντρωσης μιας ουσίας με ορισμένη απορρόφηση → Νόμος Lambert-Beer

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ - ΟΡΑΤΟΥ Παράδειγμα εφαρμογής της μεθόδου Αναφέρεται στην απορρόφηση μονοχρωματικής ακτινοβολίας από τα συστατικά του δείγματος στην περιοχή του υπεριώδους (190-400nm) και του ορατού (400-800nm) Ποσοτική ανάλυση Ποιοτική ανάλυση Παράδειγμα εφαρμογής της μεθόδου Στη φαρμακευτική ανάλυση, για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός φαρμάκου σε ένα σκεύασμα ή σε ένα βιολογικό δείγμα.

Βήματα για ποσοτική ανάλυση Επιλογή απορροφούσας ουσίας και λήψη φάσματος απορρόφησης Επιλογή του καταλληλότερου μήκους κύματος Κατασκευή πρότυπης καμπύλης Μέτρηση απορροφήσεως διαλύματος άγνωστης συγκέντρωσης και Υπολογισμός της συγκέντρωσης από την καμπύλη αναφοράς

Επιλογή απορροφούσας ουσίας και λήψη φάσματος απορρόφησης Εάν η προς μελέτη ουσία απορροφά επαρκώς στις χρησιμοποιούμενες περιοχές του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος προσδιορίζεται όπως είναι. Σε αντίθετη περίπτωση, μετατρέπεται με κατάλληλα αντιδραστήρια σε άλλη ουσία (παράγωγο) η οποία να απορροφά ισχυρά. Κατά το σχηματισμό του παραγώγου θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψην: Το παράγωγο να είναι σταθερό, τα χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια να μην απορροφούν στην περιοχή απορρόφησης της ουσίας και να μην σχηματίζονται υποπροϊόντα αντιδράσεων που θα επηρέαζαν το αποτέλεσμα. Επιλογή βέλτιστων συνθηκών όπως: pH, Συγκέντρωση αντιδραστηρίων Διαλύτης: Ο διαλύτης επηρεάζει το φάσμα απορρόφησης και την απορροφητικότητα της ουσίας και τη διαλυτότητα των προσδιοριζόμενων ουσιών και των αντιδραστηρίων. Στην περίπτωση που η ουσία είναι δυσδιάλυτη στο νερό, χρησιμοποιούνται οργανικοί διαλύτες . Χρόνος- Σταθερότητα: Η ουσία θα πρέπει να είναι σταθερή για μακρό χρονικό διάστημα ώστε η μέτρηση της απορρόφησης να γίνεται με άνεση. Εάν δεν είναι σταθερή για πολύ, η μέτρηση θα πρέπει να γίνεται σύντομα. Σε περιπτώσεις, φωτοευαίσθητων ουσιών πρέπει να αποφεύγεται η έκθεσή τους στο φως.

2. Επιλογή του καταλληλότερου μήκους κύματος Προσδιορισμός μήκους κύματος (λmax) στο οποίο παρατηρείται μέγιστη απορρόφηση της ουσίας. Για το σκοπό αυτό κατασκευάζεται το φάσμα απορρόφησης που είναι η γραφική παράσταση της απορρόφησης (Α) σε συνάρτηση με το μήκος κύματος. Μέσω αυτού μπορεί να γίνει η ταυτοποίηση ή η ανίχνευση μιας ουσίας (ποιοτική ανάλυση)

φάσμα απορρόφησης χλωροφυλλών

3. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης ή καμπύλης αναφοράς Είναι η γραφική παράσταση που συσχετίζει την απορρόφηση μιας ουσίας (Α) με την συγκέντρωσή της στο διάλυμα (C). Κατασκευάζεται μέσω μέτρησης της απορρόφησης πρότυπων διαλυμάτων με γνωστή συγκέντρωση της ουσίας στο μήκος κύματος που επιλέχθηκε (λmax).

Νόμος Lambert-Beer A=-logT=log Io/I=εbC Η απορρόφηση είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύματος και της διαδρομής της ακτινοβολίας μέσα στο διάλυμα T= διαπερατότητα, το ποσοστό της μονοχρωματικής ακτινοβολίας που απορροφάται από το διάλυμα μιας ουσίας Ιο=η ένταση της ακτινοβολίας που προσπίπτει στο διάλυμα Ι= η ένταση της ακτινοβολίας που εξέρχεται από το διάλυμα

Όταν δεν παρατηρείται απορρόφηση ακτινοβολίας από ένα διάλυμα τότε Ι=Ιο Κάθε διάλυμα έχει διαπερατότητα μικρότερη, από 1 αφού Τ=Ι/Ιο. Η διαπερατότητα του τυφλού διαλύματος είναι 1 (100%)

Προϋποθέσεις νόμου Lambert-Beer 1) Ο μόνος μηχανισμός αλληλεπιδράσεως ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και της διαλυμένης ουσίας είναι η απορρόφηση 2) Η προσπίπτουσα ακτινοβολία είναι μονοχρωματική. 3) Η απορρόφηση γίνεται σε έναν όγκο διαλύματος ομοιόμορφης διατομής. 4) Τα σωματίδια που απορροφούν δρουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και άσχετα προς τον αριθμό και το είδος τους.

4. Μέτρηση απορροφήσεως διαλύματος άγνωστης συγκέντρωσης και Υπολογισμός της συγκέντρωσης από την καμπύλη αναφοράς Παράδειγμα: Έστω Α=0,350 η απορρόφηση ενός διαλύματος ασκορβικού οξέος άγνωστης συγκέντρωσης. Για να βρούμε την συγκέντρωση χρησιμοποιούμε την γραμμική εξίσωση και λύνουμε ως προς χ. Χ= (0,350-0.0085)/0,0473=7,22μΜ

Ρυθμιστής διαφράγματος Οργανολογία Φασματοφωτομετρίας Φασματοφωτόμετρο Πηγή φωτός Μονοχρωμάτορας Κυψελίδα Δείγμα Ανιχνευτής Ενισχυτής Όργανο ανάγνωσης Ρυθμιστής διαφράγματος

Τύποι φασματοφωτόμετρου ανάλογα με την πηγή ακτινοβολίας Τύποι φασματοφωτόμετρου ανάλογα με την πηγή ακτινοβολίας Ανάλογα με την παραγόμενη ακτινοβολία διακρίνονται τα: Φασματοφωτόμετρο ορατού (340-800nm) Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους – ορατού (190-800nm) Φασματοφωτόμετρο υπέρυθρου (2-15μm)

Πηγές ακτινοβολίας Λυχνίες υπεριώδους: Λυχνίες ορατού:

Πηγές ακτινοβολίας Λυχνίες υπέρυθρου: Laser

Ρυθμιστής διαφράγματος Επιλογείς μήκους κύματος Πηγή φωτός Μονοχρωμάτορας Κυψελίδα Δείγμα Ανιχνευτής Ενισχυτής Όργανο ανάγνωσης Ρυθμιστής διαφράγματος

Μονοχρωμάτορες

Μονοχρωμάτορες πρίσματος Το πρίσμα αναλύει μια πολυχρωματική ακτινοβολία στα συστατικά της. Τα πρίσματα είναι κατασκευασμένα από χαλαζία για την υπεριώδη περιοχή, επειδή η ύαλος απορροφά ακτινοβολίες που έχουν μήκος κύματος μικρότερο από 330nm. Αποτελείται από ύαλο για το ορατό φως επειδή επιτυγχάνεται μεγαλύτερη διασπορά σε σύγκριση με τον χαλαζία.

Μονοχρωμάτορες φράγματος Ένα φράγμα αποτελείται από μεγάλο αριθμό παράλληλων ισοπαχών χαραγών για την ανάλυση μιας πολυχρωματικής ακτινοβολίας Πλεονεκτήματα: Χαμηλό κόστος Σταθερός βαθμός μονοχρωματικότητας Μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα Η ισχύς της ακτινοβολίας δεν επηρεάζεται από το υλικό του φράγματος

Κυψελίδες Είναι κατασκευασμένες από χαλαζία όταν χρησιμοποιούνται στην υπεριώδη περιοχή και από γυαλί ή πλαστικό όταν χρησιμοποιούνται στην ορατή περιοχή.

Ανιχνευτές

Ενισχυτής και όργανο ανάγνωσης Το ηλεκτρικό σήμα στην έξοδο του ανιχνευτή ενισχύεται και η διαπερατότητα ή η απορρόφηση δείχνεται στο φασματοφωτόμετρο ως ένδειξη μιας κλίμακας ή ως ψηφιακή μορφή. Σε μια φωτομέτρηση ρυθμίζεται: Τ=100% (Α=0) με τοποθέτηση του τυφλού στην κυψελίδα Μέτρηση της % Τ ή της Α του δείγματος

Φασματοφωτόμετρο απλής δέσμης Η δέσμη της ακτινοβολίας ακολουθεί μία και μονή διαδρομή μέσα από το δείγμα. Κάθε φορά για τη μέτρηση της απορρόφησης ενός δείγματος απαιτείται βαθμονόμηση με το τυφλό δείγμα (Α=0).

Φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης Η ακτινοβολία μετά τον μονοχρωμάτορα διχάζεται σε δύο δέσμες, μια για το τυφλό διάλυμα και η άλλη για το προς μέτρηση δείγμα. Απαιτούνται δύο προσαρμοσμένοι ανιχνευτές Τα σήματα από τους ανιχνευτές ενισχύονται και ο λόγος τους (ή ο λογάριθμος του λόγου τους) προσδιορίζεται με ηλεκτρονικά μέσα και παρουσιάζεται στο όργανο ανάγνωσης.

Πλεονεκτήματα φασματοσκοπικών μεθόδων Μεγάλη ευαισθησία μεθόδου: ανίχνευση συγκεντρώσεων της τάξης 10-7-10-6Μ. Ταχύτητα Εκλεκτικότητα Αυτοματοποίηση της μεθόδου Δεν καταστρέφεται το δείγμα Μειονέκτημα: Απαιτούνται πρότυπα διαλύματα για τη βαθμονόμηση των οργάνων

Σφάλματα φασματοφωτομετρίας Όργανα: Μεταβολές στην ισχύ της πηγής ακτνοβολίας στην ευαισθησία του ανιχνευτή την τοποθέτηση της κυψελίδας το μήκος κύματος Προσωπικά σφάλματα Προσμείξεις: Λόγω της μικρής συγκέντρωσης των προσδιοριζόμενων ουσιών οι προσμείξεις των σκευών ή του διαλύτη μπορεί να προκαλέσουν σφάλματα. Για να μην υπάρχουν τέτοια σφάλματα χρησιμοποιείται το τυφλό δείγμα που περιέχει το διαλύτη χωρίς την ουσία, και υφίσταται τον ίδιο χειρισμό όπως το δείγμα. Απορροφούσες παρεμποδίζουσες ουσίες: Εάν στο δείγμα υπάρχουν κι άλλες ουσίες οι οποίες απορροφούν στην ίδια περιοχή με την προς εξέταση ουσία τότε προκύπτουν σφάλματα μέτρησης. Χημικές παρεμποδίσεις: Προκύπτουν από συμμετοχή της ουσίας σε δευτερεύουσες αντιδράσεις (υδρόλυση ή διάσπαση της ουσίας)