Biochimia proteinelor

Selenocisteina Selenocisteina este un aminoacid neobişnuit prezent în câteva enzime fiind util pentru activitatea lor Nu este sintetizat ca urmare a prelucrărilor posttranslaţionale. O modificare a serinei apare când aceasta se leagă la tARN-ul unic, formând selenocisteinil-ARNt. Selenocisteina este ulterior inserată într-o proteină cu care va fi sintetizată.

Proteine

Proteine

Proteine Proteinele sunt substanţe azotate complexe prezente în toate celulele animale sau vegetale Roluri: 1. structural- arhitectura celulară 2. funcţional- enzime, hormoni, receptori, represori, contractil, transport gaze sangvine, coagulare 3. fizico-chimic- menţinerea presiunii osmotice şi a echilibrului acido-bazic 4. energetic- proteine de rezervă (caseina, ovalbumina pentru creşterea embrionului) sau eliberare de energie (4,5kcal/g proteine oxidate)

Proteine

Proteine

Proteine

Structura primară a proteinelor Unicitatea proteinelor este dictată de secvenţa lineară de aminoacizi, denumită structură primară.

Structura primară a proteinelor Numărul proteinelor a căror structură primară se cunoaşte este de ordinul zecilor de mii. Insulina (51 aminoacizi), ribonucleaza (124 aminoacizi), hemoglobina (catenele α cu 141 aminoacizi, cele β cu 146 aminoacizi), mioglobina (453 aminoacizi), citocromul c (204 aminoacizi), gamaglobulina (1320 aminoacizi) Structura proteică primară determină gradul de pliere şi modul de interacţiune cu alte molecule intracelulare astfel încât proteina să-şi poată exercita funcţia. Structurile primare ale tuturor proteinelor sunt sintetizate pornind de la cei 20 aminoacizi care se succed într-o secvenţă lineară determinată de codul genetic.

Structura primară a proteinelor Codul genetic este secvenţa de trei baze (nucleotide) din ADN, conţinând informaţia secvenţei lineare de aminoacizi din lanţul polipeptidic (structura primară) O genă este porţiunea din ADN care codează produsul funcţional precum lanţul polipeptidic. Mutaţiile care sunt modificări în nucleotidele genei determină alterarea produsului codificat de genă.

Structura primară a proteinelor La nivelul ribozomilor se realizează translaţia informaţiei genetice de la ARNm în lanţul polipeptidic În nucleu, ARNm copiază informaţia genetică de la ADN nuclear iar apoi migrează în citoplasmă. Fiecare moleculă de ARNt posedă la mijlocul lanţului său un anticodon a căror 3 baze consecutive se pot asocia prin legături de hidrogen cu 3 baze complementare de un codon ARNm. Pe baza acestui anticodon aminoacizii vor fi poziţionaţi conform mesajului genetic din ARNm. Această poziţionare a aminoacil-ARNt se realizează la suprafaţa ribozomului la nivelul a două situsuri stereospecifice: situl "P" (peptidil) şi situl "A" (aminoacil), situate la suprafața subunităţilor.

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor Substituţia unui singur aminoacid modifică funcţia proteinei sau conferă un avantaj specific unui anumit ţesut sau unui set de circumstanţe. Multe proteine precum hemoglobina pot prezenta polimorfisme sau variante genetice ale structurii primare La acelaşi individ, structura primară a proteinelor diferă în funcţie de stadiul de dezvoltare, fiind prezentă ca izoforme fetale şi adulte ca în cazul hemoglobinei. Structura primară a creatin-kinazei variază în funcţie de ţesut (izoforme specific tisulare) sau în cadrul aceluiaşi ţesut, în funcţie de localizarea intracelulară. Separarea electroforetică a izoenzimelor tisular-specifice este utilă în localizarea injuriei tisulare

Structura primară a proteinelor Înafara aminoacizilor codificaţi genetic şi care formează structura primară, mai există şi aminoacizi specifici modificaţi prin fosforilare, oxidare, carboxilare sau prin alte tipuri de reacţii Când aceste reacţii sunt catalizate enzimatic, modificările sunt denumite post-translaţionale.

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor Proteinele sunt polipeptide rezultate prin condensarea AA, cu eliminarea unei molecule de apă între gruparea –COOH a unui AA şi gruparea –NH2 a AA următor

Structura primară a proteinelor Secvenţa AA într-un lanţ polipeptidic: de la capătul N-terminal spre C-terminal

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor Stabilirea secvenţei de AA dintr-un lanţ polipeptidic: prin metode chimice sau enzimatice- “TRADIŢIONALE” Etape: 1. Determinarea AA de la capetele N- ;C-terminale 2. Stabilirea secvenţei de AA din interiorul lanţului pp 3. Separarea lanţurilor în cazul proteinelor oligomere, urmată de parcurgerea primelor etape

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor Prima etapă în stabilirea structurii primare a unui polipeptid constă în identificarea şi cuantificarea aminoacizilor constituienţi. O probă purificată din polipeptidul de analizat este iniţial hidrolizată prin tratare cu un acid tare la 110ºC timp de 24ore Această procedură induce clivarea legăturilor peptidice şi separarea aminoacizilor individuali care pot fi detectaţi cu ajutorul cromatografiei prin schimb ionic.

Structura primară a proteinelor În cadrul acestei metode, amestecul de aminoacizi este plasat într-o coloană formată din granulele unei răşini sintetice care conţine grupări electronegative. Aminoacizii din amestec aderă la coloană cu afinităţi diferite, în funcţie de încărcarea electrică, caracterul hidrofob, etc. Prin creşterea treptată a pH-ului şi a concentraţiei ionice în soluţiile apoase eluante, aminoacizii migrează în coloană cu viteze diferite, iar eluantul este colectat în fracţii mici. .

Structura primară a proteinelor Aceste fracţiuni care conţin aminoacizi sunt analizate cantitativ cu ajutorul reacţiei cu ninhidrină, un reactant care prin încălzire reacţionează cu majoritatea aminoacizilor, cu amoniacul, cu aminele şi formează compuşi roşu-violet Determinarea cantitativă a fiecărui aminoacid se realizează prin spectrofotometrie, care măsoară cantitatea de lumină absorbită de derivatul ninidrinic. Procedura descrisă se realizează cu ajutorul analizorului de aminoacizi.

Structura primară a proteinelor

Structura primară a proteinelor Determinarea secvenţei de aminoacizi a peptidelor Secvenţierea reprezintă un proces etapizat de identificare a aminoacizilor constituienţi ai unui lanţ peptidic începând de la capătul N-terminal al acestuia. Fenilizotiocianatul, cunoscut şi ca reactiv Edman, reacţionează cu gruparea amino terminală a peptidului în condiţii de pH uşor alcalin Rezultă un derivat feniltiohidantoinic care produce instabilitatea legăturii peptidice la capătul N-terminal, iar aceasta poate fi hidrolizată selectiv, fără clivarea celorlalte legături peptidice.

Structura primară a proteinelor Derivatul aminoacidic rezultat poate fi separat şi identificat ulterior

Structura primară a proteinelor Avantajul metodei este că restul lanţului peptidic rămâne intact după îndepărtarea aminoacidului N-terminal, iar reactivul Edman este utilizat în mod repetat asupra lanţului peptidic scurtat în urma testării anterioare până la identificarea tuturor resturilor de aminoacizi Prin degradarea Edman se poate identifica o secvenţă de pînă la 30 aminoacizi, cu o eficienţă de 98%/aminoacid. Un alt avantaj ar fi cantitatea de numai 10-100 picomoli de peptidă necesari pentru determinare.

Structura primară a proteinelor Clivarea lanţurilor polipeptidice în fragmente mai mici Numeroase polipeptide au o structură primară alcătuită din peste 100 de aminoacizi. Astfel de molecule nu pot fi secvenţiate direct, de la un capăt la celălat. În schimb, aceste molecule mari sunt clivate în anumite locuri cu secvenţierea ulterioară a fragmentelor rezultate Se pot folosi doi sau mai mulţi agenţi de clivare

Structura primară a proteinelor Metode de analiză cu enzime: 1. Bromura de cianogen scindează lanţul pp: Met-X 2. Etilamina: transformă cisteina în aminoetil-cisteină 3. Tripsina scindează şi legăturile Cys- X 4. Tripsina: Lys-X, Arg-X 5. Chimotripsina: Phe-X, Tyr-X, Trp-X 6. Carboxipeptidazele: X-Phe, X-Lys

Structura primară a proteinelor După scindarea proteinei cu obţinerea mai multor peptide mai mici se definitivează succesiunea lor utilizând tehnica peptidelor suprapuse Lanţul polipeptidic iniţial se scindează prin metode diferite, iar prin compararea seturilor de peptide obţinute se stabileşte integral secvenţa iniţială

Structura primară a proteinelor Tripsina: Glu-Met-Leu-Gly-Arg Val- Tyr-Lys Ala-Ser-Asp BrCN: Leu-Gly-Arg-Ala-Ser-Asp Val-Tyr-Lys-Glu-Met Secvenţa finală??????

Structura primară a proteinelor Val- Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Ala-Ser-Asp

Structura primară a proteinelor Determinarea structurii primare a unei proteine prin secvenţiere ADN Secvenţierea nucleotidelor dintr-o regiune ADN codificatoare a proteinelor identifică secvenţa de aminoacizi a unui polipeptid Dacă secvenţa de nucleotide este stabilită, pe baza informaţiilor referitoare la codul genetic are loc traducerea secvenţei de nucleotide în secvenţa de aminoacizi corespunzătoare polipeptidului studiat.

Structura primară a proteinelor Determinarea structurii primare a unei proteine prin secvenţiere ADN Acest procedeu, deşi utilizat de rutină pentru a preciza secvenţa de aminoacizi din componenta proteinelor, este limitat de faptul că nu poate preciza poziţiile legăturilor disulfidice la nivelul lanţurilor pliate, precum şi de faptul că nu identifică aminoacizii cu modificări post-translaţionale Secvenţierea directă a proteinelor constituie un instrument important în stabilirea exactă a structurii primare.

Variaţii ale structurii primare Deşi aproape fiecare aminoacid din structura proteică primară contribuie la realizarea conformaţiei sale (structura tridimensională), structura primară a proteinei diferă în funcţie de specie. În cadrul aceleiaşi specii există diferenţe ale secveţei de aminoacizi la nivelul individului, în funcţie de ţesut sau de stadiul de dezvoltare. Aceste diferenţe ale proteinelor funcţionale sunt tolerate în măsura în care aparţin unor regiuni „necritice” denumite variabile, dacă sunt substituţii conservative (înlocuirea unui aminoacid cu altul de structură similară) sau îi conferă un avantaj Dacă mai mulţi aminoacizi sunt toleraţi în aceeaşi poziţie, regiunea este denumită hipervariabilă.

Variaţii ale structurii primare În contrast, regiunile care formează situsuri de legare sau sunt critice în formarea structurii tridimensionale funcţionale sunt frecvent invariabile şi au exact aceeaşi secvenţă de aminoacizi la toţi indivizii, ţesuturile sau speciile Polimorfismul în structura proteinelor La nivelul populaţiei umane, structura primară a proteinei ar putea să difere puţin interindividual. Variaţiile apar din mutaţiile ADN transmise generaţiei următoare. Mutaţiile pot fi punctiforme şi rezultă prin substituţia unei baze în secvenţa de ADN sau sunt deleţii/ inserţii de baze.

Polimorfismul în structura proteinelor Pentru majoritatea alelelor, aceste schimbări au consecinţe fenotipice distincte determinând disfuncţii obiective ( boli congenitale sau genetice) sau creşteri ale susceptibilităţii pentru anumite boli O proteină defectivă diferă de majoritatea alelelor printr-un singur aminoacid care reprezintă o substituţie nonconservativă (înlocuirea unui aminoacid cu altul de polaritate diferită sau de mărime diferită) într-o regiune invariabilă Asemenea mutaţii ar putea afecta capacitatea proteinelor de a-şi exercita funcţia, de a cataliza o anumită reacţie. Pentru alte proteine variaţiile nu au semnificaţie.

Polimorfismul în structura proteinelor Variantele unei alele care apar cu o frecvenţă semnificativă în populaţie sunt considerate polimorfisme Când acea variaţie a unei alele creşte în populaţie la o frecvenţă de 1% este considerată stabilă Siclemia este un exemplu de mutaţie punctiformă stabilă în populaţia umană. Persistenţa sa este probabil atribuită presiunii selective asupra fenotipului mutant heterozigot ce conferă o anumită protecţie în malarie.

Exemple

Exemple 1. WS este un băiat de 17 ani care s-a prezentat în urgenţă cu dureri lombare severe, dureri abdominale şi ale membrelor care au debutat după două zile de greţuri şi vărsături cauzate de gastroenterită La vârsta de 3 ani a fost diagnosticat cu siclemie şi a fost internat de nenumărate ori pentru asemenea episoade

Exemple La internare: nivelul Hg serice a fost 7,8 g/dL (IBR: 12-16g/dL); Ht era 23,4% (IBR: 41-53%); Bil serică totală (un pigment ce rezultă din degradarea Hb) era 2,3 mg/dL (IBR: 0,2-1 mg/dL) Radiografia abdominală a evidenţiat calculi radiopaci în vezica biliară.

Exemple Din cauza hemolizei cronice (distrucţia hematiilor) cantitatea de hem degradată la bilirubină este crescută. Calculii sunt rezultatul excreţiei unei cantităţi crescute de bilirubină din ficat în bilă cu formarea depozitelor de cristale de bilirubinat în lumenul vezicii biliare Termenul de „calcul” este folosit pentru a descrie orice depunere anormală ca un precipitat a sărurilor minerale. Aproape întotdeauna se formează în organele cavitare (rinichi) sau în lumenul unor ducte (duct biliar comun).

Exemple Pacientul are siclemie produsă de o mutaţie punctiformă a a ADN care modifică al 6-lea aminoacid din lanţul globinic β al hemoglobinei prin care glutamatul este înlocuit cu valina Ce diferenţe apar în modul de realizare a legăturilor chimice în cazul celor doi aminoacizi?

Exemple Glutamatul prezintă la pH-ul fiziologic o sarcină negativă în radical stabilind legături ionice sau de hidrogen cu apa sau cu alte catene laterale. Valina este un aminoacid hidrofobic ce tinde să interacţioneze cu ale lanţuri hidrofobice pentru a exclude apa, modificându­se structura cuaternară Înlocuirea glutamatului cu valina în lanţul β permite separarea HbS de Hb adultă normală prin electroforeză. În acest caz, pacienta era homozigotă pentru HbS şi avea o cantitate crescută de Hb fetală, HbF. Heterozigoţii pentru HbS prezintă atât HbA cât şi HbS, precum şi cantităţi mici de HbF

Exemple La indivizii heterozigoţi pentru siclemie, alela celulei S oferă o oarecare protecţie împotriva malariei, boală cauzată de Plasmodium falciparum care îşi petrece o parte din ciclul de viaţă în hematie Hematia infectată la indivizii cu Hb adultă normală dezvoltă protruzii care se ataşează la endoteliul capilar. Această legare blochează vasele şi oxigenul nu mai ajunge în regiunea afectată, rezultând moartea celulară La heterozigoţi, HbS în celulele afectate se adună în fibre lungi, care determină distorsionarea celulei. Aceste celule distorsionate conţinând parazitul sunt recunoscute preferenţial de splină şi sunt rapid distruse, încetând viaţa parazitului.

Exemple La indivizii homozigoţi cu siclemie, hematiile iau frecvent forma de seceră în special în condiţii de presiune scăzută a oxigenului. Rezultatul este apariţia crizelor vaso-ocluzive în care celulele distorsionate blochează capilarele şi împiedică oxigenarea cu apariţia durerii Distrugerea crescută a hematiilor modificate în splină determină anemie.

Structura primară a insulinei Insulina este un hormon polipeptidic ce s-a conservat puternic la nivelul diferitelor specii, presentând câteva substituţii ale aminoacizilor niciuna în regiunile care să-i afecteze activitatea.

Structura primară a insulinei Prezintă 51 aminoacizi şi este alcătuită din lanţuri polipeptidice. Este sintetizată iniţial ca lanţ polipeptidic unic (proinsulina), dar este clivată în trei puncte înaintea secreţiei, formând peptidul C şi molecula de insulină activă conţinând lanţurile A şi B diferite Prin clivare se îndepărtează câţiva aminoacizi şi peptidul C al aminoacidului 31 ce leagă lanţurile A şi B Structura tridimensională corectă a lanţurilor A şi B este favorizată de prezenţa legăturilor disulfidice: o legătură intracatenară şi două legături intercatenare formate de reziduurile de cisteină.

Peptidele Produşii reacţiei de condensare a două sau mai multe molecule de aminoacizi formează peptidele Lanţul peptidic rezultat poate fi mai scurt sau mai lung în funcţie de numărul resturilor de aminoacizi participanţi Peptidele formate dintr-un număr mic de aminoacizi (12 < n< 20) se numesc oligopeptide, iar cele cu un număr mai mare de resturi de aminoacizi (n>20) sunt polipeptide (unde n= număr de aminoacizi).

Peptide naturale mai importante Glutationul ( γ-glutamil-cisteinil-glicina) Este un tripeptid atipic deoarece legătura peptidică între acidul glutamic şi cisteină se formează prin condensarea grupării carboxil din poziţia γ a acidului glutamic şi gruparea aminică a cisteinei: În celulele animale, glutationul funcţionează ca un sistem redox, putând exista în forma redusă (GSH) şi/sau oxidată (GSSG).

Peptide naturale mai importante Glutationul participă la procesele redox din majoritatea ţesuturilor (în special în hematii) şi este activator al sistemelor enzimatice Rolul glutationului este conferit de prezenţa în molecula sa a grupării tiolice (-SH) Oxidarea glutationului se poate realiza neenzimatic, în prezenţa ionilor de cupru şi fier: 2GSH  G-S-S-G + 2 H+ + 2e-

Peptide naturale mai importante În forma sa redusă glutationul serveşte la descompunerea apei oxigenate (H2O2) cât şi a peroxizilor de natură lipidică (R-OOH) în prezenţa glutation peroxidazei (GSH-Px), protejând membranele celulare de acţiunea oxidantă a acestora: R-OOH + 2GSH  R-OH + HOH + G-S-S-G

Peptide naturale mai importante GSH-Px (glutation peroxidaza) este o enzimă ce oferă protecţie eficientă faţă de reacţia de peroxidare deoarece: ►combină capacităţile antioxidante ale tiolilor şi seleniului; ► descompune H2O2 cu mai multă eficienţă decât catalaza; ► produşii de reacţie nu sunt radicali liberi ci substanţe hidrosolubileş ►acţionează asupra tuturor peroxizilor existenţi în mediile biologice

Peptide naturale mai importante Dintre cele două forme ale glutationului forma redusă reprezintă forma activă Posibilitatea de interconversiune a glutationului constituie mecanismul său de acţiune prin care cedează şi acceptă H+, intrând în categoria transportorilor de hidrogen Reducerea formei oxidate a glutationului se face în prezenţa enzimei glutation reductază (NADPH-dependentă) astfel: G-S-S-G + NADPH + H+ 2GSH + NADP+

Peptide naturale mai importante Alte roluri ale glutationului: ● transformarea methemoglobinei în hemoglobină ● inactivarea insulinei prin desfacerea legăturilor disulfurice din structura acesteia ● participarea, alături de alţi compuşi, la neutralizarea unor substanţe nocive endogene şi exogene ● în procesul de biosinteză a acidului ascorbic şi a leucotrienelor

Peptide naturale mai importante Alte roluri ale glutationului: previne oxidarea grupărilor –SH din centrul activ al unor enzime reacţionează cu peroxinitritul (ONOO -) formând un nitrozotiol (GSNO) care se descompune regenerând NO∙ Dacă un ţesut este supus unui aflux mare de agenţi peroxidanţi consumul de glutation creşte, o serie de enzime încep să se inactiveze, inclusiv cele implicate în sinteza proteică, proces important pentru viabilitatea celulelor. Se explică astfel obstinaţia celulelor în păstrarea concentraţiei GSSG cât mai mică.

Peptide naturale mai importante Hormonii hipofizei postrioare: oxitocina şi vasopresina (nonapeptide) Oxitocina exercită acţiune contractilă asupra musculaturii netede uterine, iar vasopresina participă şa homeostazia osmolarităţii şi volumului fluidului extracelular.

Peptide naturale mai importante Hormonii hipotalamici (factorii de inhibare sau de eliberare a hormonilor hipofizari) sunt peptide mici, uneori cu structură atipică (TRH este piroglutamil-histidil-prolinamida) Parathormonul şi calcitonina sunt peptide ce participă la reglarea metabolismului calciului ACTH (corticotropina) este un peptid ce controlează dezvoltarea cortexului glandelor suprarenale.

Peptide naturale mai importante Angiotensina II este un peptid antihipertensiv Endorfinele şi encefalinele sunt peptide de mărimi variabile, sintetizate în crecer cu roluri deosebite în somn, memorie, învăţare, durere, comportament Peptidele antibiotice sunt sintetizate de microorganisme. Au o structura peptidică, uneori ciclică şi pot conţine D-aminoacizi.

Exemple AM este un băiat de 18 ani care a fost adus la şcoală de mama lui pentru o durere severă în în flancul stâng, cu iradiere în jurul spre partea stângă în zona pubiană Urina era colorată în roşcat-portocaliu, iar la examinarea sedimentului urinar s-a evidenţiat prezenţa mai multor globule roşii. După acidifiere cu acid acetic s-au observat grămezi de cristale hexagonale transparente.

Exemple Radiografia abdominală a evidenţiat calculi radioopaci în ambii rinichi. Nu există un istoric familial pozitiv pentru litiază renală. Pacienta a eliminat o piatră cu localizare renală, cu liniştirea durerii din flanc. Componenta majoră a fost cistina. În mod normal, aminoacizii sunt filtraţi prin capilarele glomerulare renale în tubii renali, dar aproape întreaga cantitate este reabsorbită în sânge cu ajutorul proteinelor transportoare din celulele tubulare proximale renale.

Exemple Cistinuria este o boală genetică ce se caracterizează printr-o substituţie a aminoacizilor în proteina de transport care, în mod normal, reabsoarbe cistina, arginina şi lizina din lumenul renal în celulale tubulare renale Astfel, urina va conţine cantităţi crescute din aceşti amoniacizi. Cistina, cel mai puţin solubil dintre aceştia, precipită în urină sub formă de calculi.

Structura secundara a proteinelor Este legată de numele lui Pauling şi a colaboratorilor săi care, începând din 1930 au realizat studii de cristalografie cu raze X şi au măsurat unghiurile şi distanţele interatomice din aminoacizii constituienţi S-a stabilit că atomii Cα adoptă poziţii rigide faţă de planul dublei legături şi că în peptidele naturale se întâlneşte numai configuraţia trans mai stabilă decât cis.

Structura secundara a proteinelor Configuraţia trans a unei legături peptidice

Structura secundara a proteinelor Flexibilitatea lanţului polipeptidic se păstrează prin rotaţia liberă în jurul legăturilor:

Structura secundara a proteinelor Structura secundară a proteinelor se datorează în exclusivitate legăturilor de hidrogen care se stabilesc între grupările –CO- aparţinând unei legături peptidice şi –NH- de la alta Conjugarea p-π accentuează această proprietate Un lanţ peptidic, în solutie, ar putea adopta o infinitate de conformatii prin rotatii in jurul legăturilor ―CH(R1)― N şi ―CH(R2)―CO. Unele din aceste conformatii vor fi mai stabile dacă permit realizarea de punţi de hidrogen între gruparile peptidice.

Structura secundara a proteinelor Plecând de la principiul că aranjamentul cel mai stabil este acela în are se realizează el mai mare număr de punţi de hidrogen, Pauling si Corey (1951) au postulat 2 structuri secundare pentru lanţurile peptidice: α-helixul şi conformaţia β în foi pliate O structură helicoidală diferită de cea descrisă de Pauling este întâlnită la colagen, proteina majoră a matricei extracelulare cu o compozitie particulară în aminoacizi.

Structura secundara a proteinelor α - HELIXUL Legăturile de hidrogen. Lanţul polipeptidic se răsuceşte la nivelul legăturilor simple pentru ca grupările O=C şi NH să devină adiacente stereochimic pentru a forma punţi de H. Se obţine astfel o structură repetitivă helicoidală în care toate unităţile se află în raporturi spaţiale identice cu unităţile vecine O grupare NH formează o punte de hidrogen cu gruparea CO aparţinând celui de-al 4 lea rest aminoacidic din secvenţa liniară. În acest fel, toate gruparile CO şi NH sunt unite prin punţi de hidrogen.

Structura secundara a proteinelor Legătura de hidrogen este o interacţiune slabă necovalentă între hidrogenul unei molecule şi atomul mai electronegativ al unei molecule acceptoare.

Structura secundara a proteinelor Stabilitatea α-helixului este dată de numărul mare al legăturilor de hidrogen realizate intralanţ Acestea se extind ascendent între două spire consecutive ale helixului, paralel cu axa lui longitudinală Datorită acestei particularităţi structurale, toate legăturile peptidice din lanţul polipeptidic (cu excepţia primei şi a ultimei) participă la formarea legăturilor de hidrogen intralanţ Considerate individual, legăturile de hidrogen sunt slabe, dar considerate global, conferă stabilitate helixului.

Structura secundara a proteinelor Numărul de aminoacizi per spiră Fiecare spiră a unui α-helix conţine un număr mediu de 3,6 aminoacizi. Resturile de aminoacizi separate de 3 sau 4 aminoacizi în cadrul secvenţei primare, ajung în stare de proximitate spaţială după plierea în structura α-helixului Stereochimia grupării peptidice, unghiurile de legătura, distanţele interatomice, coliniaritatea punţilor de hidrogen, apartenenţa aminoacizilor helixului seriei optice (seria L) determină o anumită geometrie a α-elicei:

Structura secundara a proteinelor - cu fiecare rest aminoacidic se avansează pe verticală cu 1,47 Å; - pasul elicei, distanta între două puncte echivalente pe verticală este de 5,21Å şi cuprinde 3,6 resturi aminoacidice ; - diametrul elicei, diametrul suprafeţei cilindrice în care se află atomii Cα este de 10,1 Å; - sensul răsucirii lanţului polipeptidic este de la stânga la dreapta (helix spre dreapta); - radicalii R ai tuturor aminoacizilor sunt orientaţi spre exteriorul elicei, configuratia atomilor Cα este aceeaşi pentru toţi aminoacizii; - toate gruparile NH şi C=O formează punţi de hidrogen.

Structura secundara a proteinelor Aminoacizii care destabilizează α-helixul Lungimea şi repartizarea segmentelor de α- helix în cuprinsul moleculei este diferită de la o proteină la alta, în funcţie de distribuţia factorilor stabilizatori şi destabilizatori ai elicei în structura primară Structura secundară se referă la forma şi la lungimea lanţurilor polipeptidice, proprietăţi induse de legăturile de hidrogen.

Structura secundara a proteinelor Cele mai întîlnite tipuri de structuri secundare sunt: alpha helixul şi lanţurile beta Helixul α se formează prin rotaţia unui lanţ polipeptidic în jurul propriei axe Alte helixuri cum ar fi helixul 310 şi helixul π sunt, din punct de vedere energetic, favorabile formării legăturilor de hidrogen, dar sunt rareori observate în proteinele naturale exceptînd părţile terminale ale helixului α în timpul formării scheletului proteic (de obicei centrul helixului).

Structura secundara a proteinelor Aminoacizii care destabilizează α-helixul Aminoacizii au un comportament diferit vis-a-vis de posibilitatea formării structurii secundare Prolina şi glicina sunt cunoscuți ca "helix breakers" (spărgători de helix), deoarece afectează configurația scheletului proteic; ambii aminoacizi au abilităţi conformaţionale neobişnuite şi, de regulă, se găsesc în colţurile scheletului proteic.  

Structura secundara a proteinelor Aminoacizii care preferă să adopte conformaţia helixului proteic fac parte din aşa numita serie MALEK (codurile formate din prima literă a aminoacizilor: metionină, alanină, leucină, acid glutamic şi lizina); în schimb, aminoacizii aromatici precum triptofanul, tirozina şi fenilalanina, dar şi aminoacizii cu legare prin carbonul beta (izoleucina, valina și treonina), adoptă configurația β.

Structura secundara a proteinelor Prolina destabilizează α-helixul deoarece gruparea amino secundară a acesteia nu este compatibilă din punct de vedere geometric cu spirala dextrogiră a α-helixului. Ea crează o deformare a lanţului polipeptidic ce perturbă structura helicoidală netedă a acestuia. Resturile prolil, prin geometria lor particulară, împiedică răsucirea helicodală a lanţurilor polipeptidice. La nivelul unui rest de Pro, lanţul se îndoaie cu un unghi de 130 grade.

Structura secundara a proteinelor Prezenţa unui număr mare de aminoacizi ionizaţi (glutamat, aspartat, histidină, lizină sau arginină) produce o discontinuitate a α-helixului din cauza apariţiei legăturilor ionice sau a forţelor de respingere electrostatică între aceşti aminoacizi Aminoacizii care au catene laterale voluminoase precum triptofanul sau aminoacizii cum ar fi valina sau izoleucina, treonina, care se ramifică la nivelul Cβ ( primul carbon al radicalului R, legat de carbonul α ) pot perturba formarea α-helixului dacă sunt prezenţi în număr crescut, şi dacă aceste R ajung adiacente in elice.

Structura secundara a proteinelor Resturile glicil, fără catenă laterală, conferă lanţurilor polipeptidice flexibilitate şi adesea, la nivelul resturilor Gly, structura secundară α este întreruptă, lanţul schimbându-şi uşor direcţia Serina, prin capacitatea de a forma punţi de hidrogen la nivelul grupării alcoolice destabilizează elicea Resturile de cisteină când formează punţi disulfurice leagă covalent, rigid, porţiuni ale lanţului polipeptidic şi în vecinătatea acestor regiuni răsucirea helicoidală nu mai poate avea loc.  

Structura secundara a proteinelor Structura α- helicoidală a lanţurilor polipeptidice postulată de Pauling si Corey a fost găsită, în proporţie mai mare sau mai mică, în diverse proteine.   Proteina % helix α Mioglobina Insulina Ovalbumina Serumalbumina Pepsina Ribonucleaza Chimotripsina 70 38 31 46 16 15

Structura secundara a proteinelor Stuctura secundară α se întâlneşte în diverse proporţii atât în proteinele fibrilare cât şi în cele globulare O proteină fibrilară cu structură secundară α în proporţie de aproximativ 100٪ este keratina, proteină abundentă în păr, piele, unghii Este alcatuită din lanţuri polipeptidice lungi cu structură de α-helix, asociate câte două şi superâncolăcite . Prin asocierea acestor dimeri se realizează fibrile şi fibre rezistente

Structura secundara a proteinelor În aceste fibrile, grupările R pot interacţiona prin valenţe secundare în cele mai bune condiţii. În plus, structura superhelicoidală este stabilizată şi prin punţi disulfurice intercatenare, keratina avand un conţinut ridicat în cisteină Mioglobulina şi hemoglobina au un procent mare (70٪) de structură secundară α . În aceste cazuri, segmentele de α- helix sunt scurte, ele fiind întrerupte de porţiuni nehelicoidale. La nivelul acestora din urmă, lanţul polipeptidic işi schimbă direcţia sub diverse unghiuri, permiţând realizarea unei structuri compacte. .

Structura secundara a proteinelor O altă structură secundară a lanţurilor polipeptidice în care se realizează potenţialul maxim de legare prin punţi de hidrogen a grupărilor C=O şi NH ale legăturii peptidice este structura β sau structura în foaie pliată În acest caz punţile de hidrogen sunt intercatenare, lanţurile polipeptidice se aşează în foi. Cea mai stabilă interacţiune se obţine dacă lanţurile evoluează unul de la capatul N–terminal spre cel C-terminal şi celălalt în sens invers.

Structura secundara a proteinelor Spre deosebire de α-helixuri, foile β sunt alcătuite din două sau mai multe lanţuri peptidice (lanţurile β) sau din segmente de lanţuri polipeptidice, care sunt aproape complet întinse Legăturile de hidrogen sunt perpendiculare pe scheletul polipeptidic. Datorită rigidităţii legăturii peptidice şi coplanarităţii grupului ― CH ― NH ― CO ― CH ― se realizează structuri asemănătoare unei foi plisate. Radicalii R mari sunt orientaţi alternativ, de o parte şi de alta.

Structura secundara a proteinelor Foile paralele şi antiparalele Aranjamentul β poate fi alcătuit din două sau mai multe lanţuri polipeptidice separate sau din segmente de lanţuri polipeptidice orientate paralel (lanţurile se desfăşoară în aceeaşi direcţie) sau antiparalel (lanţurile se desfăşoară în direcţii opuse) Legăturile de hidrogen formate între scheletele axiale ale celor două lanţuri polipeptidice sunt denumite intercatenare. Aranjamentul β poate fi constiruit şi dintr-un singur lanţ polipeptidic retropliat, legăturile de hidrogen fiind intracatenare în acest caz.

Structura secundara a proteinelor Structura secundară β în foaie pliată este întâlnită în proporţie de aproape 100٪ în proteina din mătase, fibroina Lanţurile polipeptidice antiparalele sunt întinse şi asociate prin legături de hidrogen, dând naştere unei foi pliate. Aceste foi se aşează în straturi, iar între straturi se stabilesc numeroase legături între grupările R, care proemină de o parte şi de alta a fiecării foi Datorită unei structuri primare speciale cu multe resturi Gly şi Ala alternante, distanţele dintre foi sunt mici (3,5Å si 5,7Å alternativ). Această structură conferă fibroinei rezistenţă la întindere şi flexibilitate.

Structura secundara a proteinelor Structurile β sunt motive structurale întâlnite frecvent în proteinele globulare. Cel mai simplu element din structura β constă dintr-un lanţ polipeptidic îndoit care realizează două segmente antiparalele, denumit β-turn :

Structura secundara a proteinelor În cazul proteinelor globulare, foile β prezintă întotdeauna o torsiune sau o răsucire dextrogiră faţă de scheletul polipeptidic cu 180º, contribuind la apariţia formei globulare Structura buclei este stabilizată prin formarea unei legături de hidrogen între primul şi al treilea aminoacid Secvenţa aminoacizilor care formează acest tip de structură cuprinde de obicei resturi de glicină şi prolină.

Structura secundara a proteinelor Glicina, datorită volumului său mic, este cel mai uşor adaptabilă la modificările sterice Prolina, care are atomul de azot peptidic prins în structura sa ciclică, favorizează modificarea direcţiei axului catenei polipeptidice Frecvent, foile β răsucite constituie nucleul structural al proteinelor globulare Mai multe catene polipeptidice, de regulă 6 dar şi mai multe pot adopta structura β cu foi pliate Domeniile structurale ale imunoglobulinelor ş ale proteinelor din aceeaşi superfamilie cuprind un motiv structural major β.

Structura secundara a proteinelor Structurile secundare nerepetitive Aproximativ jumătate din masa unei proteine globulare este organizată sub formă de structuri repetitive, de tip α-helix şi/sau foi pliate β Restul lanţului polipeptidic prezintă o conformaţie curbată sau spiralată Aceste structuri secundare nerepetitive nu sunt deloc întâmplătoare, ci doar prezintă o conformaţie mai puţin regulată comparativ cu structurile descrise anterior.

Structurile suprasecundare Proteinele globulare sunt combinaţii de elemente structurale secundare ( α-helixuri, foi β, secvenţe nerepetitive) care formează în principal regiunea centrală sau interiorul moleculei Aceste structuri sunt interconectate prin porţiuni curbate (de exemplu, lanţurile β) la suprafaţa proteinelor Structurile suprasecundare apar prin compactarea catenelor laterale ale elementelor structurale secundare adiacente. Proteinele care se leagă de ADN conţin unul sau mai multe tipuri bine definite de mozaicuri

Structurile suprasecundare Mozaicul în deget de zinc este frecvent întâlnit în structura proteinelor care au rol de factori de transcripţie În proteinele „zinc finger” aminoacizii (cel mai frecvent cisteina şi histidina) se dispun în deget de mânuşă la baza cărora se fixează un ion de zinc

Structurile suprasecundare Proteinele helix-buclă-helix prezintă un domeniu de fixare la ADN ce conţine un motiv structural format din două α-helixuri separate printr-o buclă scurtă Acest model structural este întâlnit la factorii de transcriere care stimulează sinteza de imunoglobuline.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Structura terţiară a proteinelor reprezintă un nivel superior de organizare ce înglobează structura secundară şi care se referă la modul în care sunt asamblate α-helixul şi foaia pliată β Structura primară a unui lanţ polipeptidic determină structura terţiară a acestuia Adjectivul „terţiar” se referă atât la plierea domeniilor (unităţile structurale şi funcţionale de bază) cât şi la aranjamentul final al domeniilor în structura unui polipeptid.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Interacţiunile dintre radicalii R distanţaţi în secvenţa liniară determină o anumită conformaţie a lanţului polipeptidic Structura tridimensională a unei proteine native în mediul său fiziologic este accea pentru care energia liberă a sistemului este minimă În soluţie apoasă, structura proteinelor globulare este compactă, cu o densitate mare de atomi în centrul moleculei.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Catenele laterale hidrofobe sunt dispuse în interiorul moleculei, în timp ce grupările hidrofile sunt dispuse în general, pe suprafaţa moleculei Interacţiunile necovalente sunt factori decisivi ai structurii terţiare Indiferent de structura secundară (α sau β) căreia îi aparţin resturile R din structuira lanţului polipeptidic, aceştia, prin interacţiunile pe care le stabilesc, participă la edificarea structurii terţiare

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Structura terţiară a proteinelor globulare este stabilizată prin următoarele patru tipuri de interacţiuni: legătura peptidică; legătura ionică; punţi de hidrogen; interacţiuni hidrofobe; punţi disulfidice

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Legăturile disulfidice sunt legături de tip covalent între grupările sulfhidril (-SH) ale resturilor de cisteină cu formarea unui rest de cistină Cele două molecule de cisteină pot fi separate prin mai mulţi aminoacizi din structura primră a polipeptidului sau pot fi localizate pe cele două lanţuri polipeptidice diferite Plierea lanţurilor polipeptidice apropie resturile de cisteină şi facilitează formarea unei legături covalente între catenele laterale ale ale acestora.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Legăturile disulfidice conferă stabilitate structurii tridimensioanale a moleculei proteice prevenind denaturarea acesteia în mediul extracelular Imunoglobulinele secretate de celulele sangvine sunt proteine care conţin un număr crescut de legături disulfidice.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Interacţiunile hidrofobe Aminoacizii cu catene laterale nepolare tind să se localizeze în interiorul moleculei polipeptidice, unde se asociază cu alţi aminoacizi hidrofobi În schimb, aminoacizii care conţin catene laterale polare sau ionizate tind să se localizeze la suprafaţa moleculei, în contact cu solventul polar.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Legăturile de hidrogen Catenele laterale ale aminoacizilor care conţin legături oxigen-hidrogen sau azot-hidrogen, cum ar fi radicalii alcool ai serinei şi ai treoninei, pot forma legături de hidrogen cu atomii bogaţi în electroni- atomul de oxigen al grupării carboxil sau carbonil din componenţa unei legături peptidice Formarea legăturilor de hidrogen între radicalii polari de pe suprafaţa proteinelor şi solventul apos determină creşterea solubilităţii proteinelor.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Interacţiunile ionice Radicalii încărcaţi negativ cum ar fi gruparea carboxil din catena laterală a aspartatului sau a glutamatului, pot interacţiona cu radicalii încărcaţi pozitiv, cum ar fi gruparea amino din catena laterală a lizinei.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Plierea proteinelor Interacţiunile dintre catenele laterale ale aminoacizilor influenţează modul de pliere a lanţului polipeptidic în forma tridimensională specifică proteinei funcţionale Plierea proteinelor, care se desfăşoară în decurs de secunde sau minute în interiorul celulelor se realizează prin atragerea sau respingerea catenelor laterale ale aminoacizilor în funcţie de proprietăţile chimice ale acestora

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Radicalii încărcaţi pozitiv vor fi atraşi de cei încărcaţi negativ, catenele încărcate cu acelaşi tip de ionizare se resping Procesul de pliere depinde şi de legăturile de hidrogen, interacţiunile hidrofobe şi legăturile disulfidice O proteină pliată corect prezintă în- cărcătură electrică redusă, fenomenele de atracţie fiind predominante.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Rolul chaperonelor în plierea proteinelor Prin convenţie, se acceptă că informaţia necesară unei plieri corecte se găseşte în structura primară a polipeptidelor. Este dificil de explicat faptul că proteinele denaturate nu revin automat la conformaţia nativă în condiţii de mediu adecvate Plierea nu are loc la finalul sintezei unui lanţ proteic, ci etapizat. Acest fenomen limitează configuraţiile alternative de pliere a lanţurilor peptidice mari. În plus, o clasă specială de proteine, denumite „chaperone” are rolul de a asigura plierea corectă a multor alte clase de proteine

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Configurarea spaţială a proteinelor este controlată de proteine chaperon, heat shock proteins

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE „Chaperonele” denumite şi proteine de „ şoc termic” ( heat shock proteins) a căror sinteză este crescută când temperatura creşte sau în alte stări de stress celular (variaţii de pH sau osmolaritate) sau proteine însoţitoare interacţionează cu polipeptidele în diverse etape ale procesului de pliere

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Unele dintre chaperone au rolul de a stabiliza configuraţia nepliată a proteinelor până la finalizarea sintezei acesteia sau pot avea rol de catalizator prin accelerarea etapelor finale ale procesului de pliere Alte chaperone protejează proteinele în cursul plierii, prevenind blocarea regiunilor vulnerabile ale acestora în legături neproductive.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE În mod curent, se utilizează denumirea prescurtată Hsp la care se adaugă o cifră corespunzătoare masei moleculare exprimată în kDa (exemplu Hsp- 70) O altă categorie de proteine de stress este reprezentată de „glucose-regulated proteins” (GRP) a căror sinteză creşte în condiţiile privării de glucoză sau aminoacizi a celulei

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Un exemplu de chaperonă care intervine în definitivarea structurii unei proteine celulare este GRP 70= BIP (binding immunoglobulin protein) Lanţurile H şi L ale imunoglobulinelor sunt sintetizate şi apoi fixate de BIP şi în lumenul reticulului endoplasmic sunt asamblate cu ajutorul BIP sub formă oligomerică H2L2.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Domeniile proteice sunt unităţi funcţionale şi structurale tridimensionale fundamentale ale polipeptidelor Lanţurile polipeptidice cu un număr mai mare de 200 aminoacizi conţin două sau mai multe domenii Centrul unui domeniu este alcătuit din combinaţii de elemente structurale suprasecundare (mozaicuri)

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Plierea lanţului polipeptidic la nivelul unui domeniu se desfăşoară independent de plierea care are loc la nivelul altor domenii Fiecare domeniu are caracteristicile unei proteine globulare mici, compacte, care din punct de vedere structural este independentă de restul domeniilor unui lanţ polipeptidic.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Denaturarea proteinelor Este un proces care determină deplierea şi dezorganizarea structurilor secundară şi terţiară ale acestora, procese care nu se însoţesc de hidroliza legăturilor peptidice Exemple de agenţi denaturanţi sunt: căldura, solvenţii organici, acizii şi bazele tari, detergenţii şi ionii metalelor grele, cum ar plumbul şi mercurul

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Denaturarea proteinelor Denaturarea poate fi reversibilă (în condiţii ideale) situaţie în care proteina se repliază pentru a ajunge în forma sa nativă, biologic activă, după îndepărtarea agentului denaturant Cu toate acestea, majoritatea proteinelor, odată denaturate, rămân definitiv depliate. Proteinele denaturate sunt frecvent insolubile, precipitând în soluţie.

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Solubilitatea proteinelor Proteinele globulare sunt solubile în apă, iar cele fibrilare nu sunt. Soluţiile unor săruri ale metalelor uşoare influenţează solubilitatea proteinelor (NaCl, Na2SO4, MgCl2, (NH4)2SO4 Soluţiile saline diluate enumerate anterior sunt favorabile dizolvării globulinelor. La concentraţii mari ale sărurilor din soluţie poate avea loc precipitarea globulinelor

STRUCTURA TERŢIARĂ A PROTEINELOR GLOBULARE Solubilitatea proteinelor Un exemplu clasic şi utilizat în laboratoarele clinice este cel al salifierii (reacţia cu sulfat de amoniu) albuminelor şi globulinelor Globulinele precipită când soluţia este semiaturată cu sulfat de amoniu, iar albuminele când soluţia este aproape saturată.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Reprezintă nivelul cel mai înalt de organizare structurală şi apare la proteinele alcătuite din mai multe lanţuri polipeptidice, de regulă un număr mic şi par. Se formează o unitate de sine stătătoare numită proteină oligomeră, cu o structură spaţială bine definită Subunităţile (lanţurile polipeptidice individuale) sunt denumite protomeri şi sunt asamblate prin legături slabe, necovalente de tip van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni hidrofobe şi în mai mică măsură prin legături ionice.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Protomerii pot fi identici sau diferiţi, fiecare având propria structură primară, secundară, terţiară. Protomerii separaţi nu au funcţiile specifice ale proteinei oligomere din care fac parte. Asocierea subunităţilor este o trăsătură comună pentru organizarea macromoleculară în biologie Structura cuaternară se referă la modul în care se unesc subunităţile proteice. Enzimele care catalizează asamblarea acestor subunităţi poartă denumirea de holoenzime, în care o parte poartă denumirea de subunităţi reglatoare şi subunităţi catalitice.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Vedere 3 D a hemoglobinei. Cele 4 subunităţi: roşu şi galben, iar unitatea hemică: verde Numele de hemoglobină provine de la hem şi globină, denumire ce denotă faptul că hemoglobina are la bază proteine globulare cuplate cu o grupare hem .

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Subunităţile pot funcţiona independent sau pot coopera ca în cazul hemoglobinei când ataşarea unui atom de oxigen la una dintre subunităţile tetramerului induce creşterea afinităţii pentru oxigen a celorlate subunităţi

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Proteine care au structură cuaternară sunt: hemoglobina, ADN polimeraza, canalele ionice, dar şi nucleosomii şi nanotubulii, care sunt complexe multiproteice Fragmentele proteice pot suferi transformări în structura cuaternară care se reflectă fie în structurile individuale fie în reorientările subunităţilor proteice Numărul subunităţilor din proteinele oligomere sunt denumite prin adăugarea sufix-ului -mer (grecescul pentru subunitate), precedat de numele subunităţii.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Multe enzime intracelulare sunt oligomeri şi pot hetero-sau homomultimerice (tubulina este un dimer, hemoglobina este un tetramer) Proteina Numărul de subunităţi Alcool dehidrogenaza 2 Imunoglobulina 4 Superoxid dismutaza Triozofosfat izomeraza Glicogen fosforilaza Fosfataza alcalină Glutation reductaza

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Proteine oligomere Proteina Numărul de subunităţi Lactat dehidrogenaza 4 Piruvat kinaza Hemoglobina 2 + 2 Insulina 6 Ceruloplasmina 8 Glutamin sintetaza 12 Apoferitina 24

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR Asocierea subunităţilor în structura cuaternară a proteinelor oligomere prezintă o serie de avantaje structurale şi funcţionale: 1. Economisirea materialului genetic şi eficienţa se referă la cantitatea de ADN care este utilizată pentru codificarea unei subunităţi constituente evident mai mică pentru o unitate decât pentru „ n” subunităţi necesară pentru o proteină homomultimerică. Informaţia genetică referitoare la legarea subunităţilor se află încsrisă tot în materialul genetic ce codifică monomerul.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR 2. Stabilitatea Organizarea proteinelor în structura cuaternară prin asocierea subunităţilor unui oligomer este favorabilă reducerii raportului suprafaţa proteinei/volum Interacţiunea suprafeţei unei proteine cu apa este deseori nefavorabilă energetic, ceea ce înseamnă că scăderea raportului suprafaţă proteină/volum este situaţia în care o proteină este mai stabilă.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR 3. Formarea situsului activ pentru unele enzime Unele enzime sunt proteine oligomere şi devin mai active numai atunci când subunităţile oligomerului se asociază Monomerii individuali sunt inactivi De exemplu triptofan sintaza este un tetramer de forma α2β2.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR In vitro, s-a demonstrat cu enzimă purificată că subunitatea α catalizează reacţia: Indol glicerol fosfat  indol + gliceraldehid 3- fosfat Subunitatea β catalizează reacţia: indol + serină  triptofan Produsul reacţiei catalizate de subunitatea α, devine reactant pentru subunitatea β, deci cele două subunităţi nu pot fi biologic active dacă nu sunt asociate în oligomer.

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR 4. Cooperativitatea Prin intermediul structurii cuaternare funcţionează mecanisme fine de reglare a activităţii proteinelor.

Erori de pliere a moleculelor Plierea moleculelor proteice constituie un proces complex bine controlat, dar supus erorilor care poate genera molecule proteice pliate incorect De obicei, proteinele cu erori de pliere sunt reperate şi distruse în interiorul celulei Totuşi, acest sistem de control calitativ nu este perfect, proteinele cu defecte de pliere acumulându-se intracelular sau extracelular odată cu înaintarea în vârstă Depozitele de proteine cu defecte de pliere se asociază unui număr important de afecţiuni, din care fac parte amiloidozele

Erori de pliere a moleculelor Erorile de pliere pot fi generate spontan sau pot fi rezultatul unei mutaţii la nivelul unei gene, mutaţie capabilă să conducă la sinteza unei proteine aberante În urma unei clivări proteolitice anormale, anumite proteine aparent normale dobândesc o conformaţie unică, urmată de apariţia unor structuri fibrilare lungi asamblate sub formă de foi pliate β

Erori de pliere a moleculelor Acumularea acestor agregate spontane de proteine, denumite amiloizi, este implicată în multe afecţiuni degenerative, boala neurodegenerativă Alzheimer. Componenta principală a plăcii amiloidice care se acumulează în maladia Alzheimer este reprezentată de amiloidul β (Aβ), un peptid alcătuit din 40-42 resturi de aminoacizi

Erori de pliere a moleculelor Cristalografia cu raze X şi spectroscopia în infraroşu certifică prezenţa unei conformaţii caracteristice de foi pliate β în fibrile neramificate Amiloidul este neurotoxic şi reprezinta evenimentul patogenic central care produce deficienţa cognitivă caracteristică maladiei Alzheimer

Erori de pliere a moleculelor Peptidele Aβ se agregă, generând amiloidul din parenchimul cerebral şi din jurul vaselor sangvine

Erori de pliere a moleculelor Un alt factor biologic implicat în patogenia maladiei Alzheimer constă în acumularea de complexe neurofibrilare în ţesutul cerebral Una dintre componentele principale ale complexelor fibrilare este o formă aberantă a proteinei τ (tau)

Erori de pliere a moleculelor Varianta normală a acestei proteine intervine în asamblarea structurilor microtubulare, fiind aparent blocată proteina τ aberantă Ghemurile neurofibrilare patologice din interiorul neuronilor sunt constituite din agregate de proteină "tau", datorită unui proces de hiperfosforilare

Erori de pliere a moleculelor Beta-amiloidul este o peptidă ce rezultă dintr-o proteină precursoare, Amyloid-Precursor-Protein (APP), inserată pe membrana celulară

Erori de pliere a moleculelor Beta-amiloidul, în formă oligomerică insolubilă, este citotoxic şi alterează homeostazia ionilor de calciu, inducând astfel procesul de apoptoză (moarte celulară programată) Acest peptid depozitat anormal în structurile cerebrale este un derivat format prin clivarea proteolitică a unui precursor amiloidic mai mare , o proteină transmembranară unică exprimată la suprafaţa celulelor cerebrale şi din alte ţesuturi.

Erori de pliere a moleculelor

Bolile prionice Denumirea de prioni provine de la „particula proteică infecţioasă” considerată a fi agentul infecţios în encefalopatiile transmisibile (TSE), de exemplu boala Creutzfeldt-Jakob, encefalopatia „scrapie” la ovine şi encefalopatia spongiformă a bovinelor Toate TSE sunt invarabil letale şi nu există tratament capabil să modifice evoluţia acestora Această proteină are o structură cu numeroase regiuni de tip α-helix şi este susceptibilă a fi degradată de proteinaza K

Bolile prionice Prionul normal poate fi convertit in vitro fără modificări de legături covalente, la o formă ce conţine numeroase porţiuni pliate de tip β şi care este rezistentă faţă de proteinaza K Una dintre încălcările dogmei centrale a geneticii o reprezintă, fără îndoială, modul de viață al particulelor infecţioase proteice, numite, generic, prioni (proteinaceous infectious particles).

Bolile prionice Aşa cum virusurile pot pătrunde în organismul gazdă, unde se multiplică şi determină alterarea acestuia, tot la fel şi aceste particule infectează organismele superioare Diferenţa majoră însă o constituie faptul că prionii nu au niciun fel de material genetic convențional (ADN sau ARN). Se presupune că informaţia lor genetică este stocată în structura terţiară a proteinei.

Bolile prionice Proteina infecţioasă denumită proteina prionică (PrP) este rezistentă la degradarea proteolitică, iar în forma infecţioasă tinde să formeze agregate fibrilare insolubile, similare acumulării de amiloid din alte afecţiuni cerebrale Forma neinfecţioasă a PrP care are aceeaşi secvenţă de aminoacizi şi aceleaşi secvenţe genice ca şi forma infecţioasă este prezentă în mod normal în ţesutul cerebral al mamiferelor, pe suprafaţa neuronilor şi a celulelor gliale. PrP reprezintă o proteină parazit.

Bolile prionice Între forma infecţioasă şi neinfecţioasă a PrP nu au fost identificate diferenţe ale structurii primare şi nici modificări posttranslaţionale PrP devine infecţioasă în urma modificării conformaţiei sale tridimensionale Mai multe α-helixuri din componenţa formei neinfecţioase a PrP sunt substituite prin foi β în forma infecţioasă, această particularitate conformaţională asigurând rezistenţă relativă la degradarea proteolitică a prionilor infecţioşi Agentul infecţios reprezintă o variantă aberantă a unei proteine normale

Bolile prionice Multiplicarea prionilor în organismul gazdă. Proteina prionică acţionează ca o matriţă după care proteina iniţială este reîmpachetată, printr-un proces facilitat de o altă moleculă proteică.

Bolile prionice În ceea ce priveşte multiplicarea prionilor în organismul gazdă, există multiple teorii, dintre care cea mai acceptată este aceea a transformării prin contact În mod obişnuit, în creierul mamiferelor, există proteina PrPc. Aceasta este o proteină membranară implicată în interacţiunea cu ioni metalici (Cu2+), în susţinerea activităţii sinaptice, în asigurarea neuroprotecţiei prin interacţiunea cu alte proteine membranare.

Bolile prionice Experimental, s-a constatat că şobolanii care nu prezintă această proteină în creier nu par să prezinte modificări patologice, însă nu manifestă şi nu transmit nicio boală prionică, în ciuda inoculării În urma infecţiei cu proteina prionică (PrPsc), proteina iniţială este alterată şi transformată în proteină prionică, aceasta având, la rândul său, capacitatea de a transforma altă proteină.

Nivele superioare de organizare structurală Se întâlnesc la enzime care se asociază alcătuind ansamble multimoleculare sau multienzimatice Complexul multienzimatic al piruvat dehidrogenazei (PDH), care produce decarboxilarea oxidativă a acidului piruvic Cuprinde 3 enzime: Piruvat-dehidrogenaza Lipoatacetiltransferaza dihidrolipoildehidrogenaza

Rezumat 1. Pentru a descifra structura proteinelor este necesară înţelegerea conceptului de conformaţie nativă care reprezintă structura complet pliată şi funcţională a unei proteine (enzimă activă sau o proteină structurală) 2. Structura tridimensională unică a conformaţiei native este determinată de structura primară a proteinei respective.

Structura proteinelor 3. Interacţiunile dintre catenele laterale ale aminoacizilor direcţionează plierea lanţului polipeptidic pentru a genera structurile secundară, terţiară şi cuaternară care conlucrează la stabilizarea conformaţiei native a unei proteine 4. În plus, o clasă specială de proteine denumite „chaperone”, intervine în plierea corectă a multor tipuri de proteine.

Structura proteinelor 4. Denaturarea proteinelor determină deplierea şi dezorganizarea structurilor proteice, dar nu produce hidroliza legăturilor peptidice. Denaturarea poate fi reversibilă sau, mult mai frecvent, ireversibilă 5. Disfuncţiile apar atunci o proteină aparent normală capătă o formă citotoxică, aşa cum se întâmplă în maladia Alzheimer şi în encefalopatiile spongiform transmisibile (TSE), inclusiv boala Creutzfeldt-Jakob

Structura proteinelor 6. În maladia Alzheimer, proteinele normale, după o procesare chimică aberantă, dobândesc o conformaţie unică ce permite constituirea unor agregate proteice neurotoxice, alcătuite din foi pliate β În TSE, agentul infecţios este reprezentat de varianta aberantă a unei proteine prionice normale, care acţionează asemeni unui „tipar” în sensul convertirii moleculelor de proteină normală în forma infecţioasă patogenă.

Proteine înrudite ce evidenţiază relaţia structură-funcţie HEMOPROTEINE

Proteine înrudite ce evidenţiază relaţia structură-funcţie

Proteine înrudite ce evidenţiază corelaţia Proteine globulare Proteine înrudite ce evidenţiază corelaţia structură-funcţie Hemoproteinele globulare constituie o clasă de proteine specializate care conţin hem- o grupare prostetică stabilă. Din această categorie fac parte: Mioglobina şi hemoglobina, proteine implicate în transportul şi depozitarea oxigenului; Citocromii, proteine transportoare de electroni, componenţi ai lanţului respirator mitocondrial şi din reticulul endoplasmic Unele oxidaze şi peroxidaze

Proteine globulare Rolul grupării hem este condiţionat de mediul pe care îl generează structura tridimensională a proteinei De exemplu, gruparea hem din structura unui citocrom funcţionează ca un transportor de electroni, care poate fi oxidat şi redus În schimb, hemul din catalaze este o componentă a porţiunii active a enzimei şi participă la descompunerea apei oxigenate În structura hemoglobinei şi a mioglobinei, două din cele mai frecvente hemoproteine întâlnite în organismul uman, hemul are rolul de a lega reversibil atomii de oxigen.

Structura şi funcţia Hb, Mb

Structura şi functia Hb Hemul reprezintă un complex biochimic constituit din protoporfina IX şi un ion de fier divalent (Fe 2+) Atomul de fier este menţinut în centrul moleculei hem prin intermediul unor legături cu toţi cei patru atomi de azot ai inelului porfirinic

In ce compusi gasim gruparea Hem?

Structura, functia si metabolismul Hb Pe lângă aceste patru legături fierul hemului poate forma două legături suplimentare de fiecare parte a inelului porfirinic care este un plan În structura mioglobinei şi a hemoglobinei una dintre aceste legături suplimentare se realizează cu catena laterală a unui rest de histidină din componenţa globinei, iar cealaltă legătură se face cu oxigenul.

Structura, functia si metabolismul Hb histidina distală (E7) nu interacţionează direct cu gruparea hem, dar contribuie direct la stabilizarea legăturii oxigenului cu Fe2+. histidina proximală (F8) se leagă direct de atomul de fier al hemului.

Structura şi functia Hb

Structura şi functia Hb

Structura şi functia Hb Protoporfirina IX are următorii substituienţi: 1, 3, 5, 8: grupări metil (M), -CH3 2, 4: grupări vinil (V), -CH=CH2 6, 7: grupări propionil (P), -CH2-CH2-COOH (P)

Structura şi functia Hb Hemoglobina se găseşte numai în hematii şi are rolul de a transporta oxigenul la nivel pulmonar în capilarele tisulare Hemoglobina A, tipul dominant al adultului, este constituită din patru lanţuri polipeptidice, două lanţuri α şi două β, unite prin legături necovalente Fiecare subunitate catenară conţine segmente α-helicale şi o unitate de legare a hemului similară celei descrise în cazul mioglobinei.

Structura şi functia Hb Cu toate acestea, molecula tetramerică a hemoglobinei este mult mai complexă decât mioglobina Hemoglobina poate transporta ionii H+ şi moleculele de CO2 de la ţesuturi la plămâni şi poate transporta patru molecule de oxigen de la plămâni la nivel celular Capacitatea hemoglobinei de a lega oxigenul este reglată de interacţiunea cu efectorii alosterici.

Structura şi functia Hb Obţinerea oxigenului direct din atmosferă, prin simplă difuziune este limitată Sistemele circulatorii înlătură acest neajuns fiind necesară prezenţa unor molecule cu rol trasnportor, de exemplu hemoglobina, deoarece solubilitatea oxigenului în soluţii apoase (precum sângele) este destul de redusă.

Structura şi functia Hb Structura cuaternară a hemoglobinei Tetramerul hemoglobinic poate fi imaginat ca o asociere a doi dimeri identici (αβ)1 şi (αβ)2 Cele două lanţuri polipeptidice din componenta fiecărui dimer stabilesc legături puternice în principal prin interacţiuni hidrofobe Resturile de aminoacizi hidrofobi sunt localizate nu numai în interiorul moleculei ci şi în regiuni specifice de pe suprafaţa fiecărei subunităţi.

Structura şi functia Hb Interacţiunile intercatenare de tip hidrofob constituie legături puternice între subunităţile α şi β ale dimerilor Legăturile ionice şi punţile de hidrogen se stabilesc şi între componentele fiecărui dimer în parte. Cei doi dimeri se pot mobiliza unul în raport cu celălalt deoarece sunt uniti în principal prin legături polare.

Structura şi functia Hb Legăturile slabe dintre aceşti dimeri mobili permit modificările poziţiei relative ale acestora în structura deoxihemoglobinei comparativ cu oxihemoglobina Legarea oxigenului la fierul hemului induce coborârea Fe2+ în planul grupării hem Deoarece atomul de fier este legat şi de histidina proximală (F8), se înregistrează o mişcare a lanţurilor globinei care modifică interfaţa dintre dimerii αβ.

Structura şi functia Hb Forma T. Deoxihemoglobina este denumită şi forma „T” sau forma întinsă, „tensionată” a hemoglobinei. Cei doi dimeri interacţionează prin intermediul unei reţele de legături ionice şi punţi de hidrogen care reduc mobilitatea lanţurilor polipeptidice. Forma T reprezintă varianta de hemoglobină cu afinitate redusă pentru oxigen.

Structura şi functia Hb Forma R. Legarea oxigenului la hemoglobină determină ruperea anumitor legături ionice şi punţi de hidrogen dintre dimerii αβ Apare o structură denumită forma „R” sau relaxată a hemoglobinei, în cadrul căreia lanţurile polipeptidice au o libertate de mobilizare mai mare. Forma R reprezintă varianta de hemoglobină cu afinitate crescută pentru oxigen.

Structura şi functia Mb Mioglobina se găseşte în muşchiul cardiac şi striat, având rol de rezervor şi transportor de oxigen, asigurând rata de difuziune a oxigenului în fibra musculară Este o hemoproteină formată dintr-o globină specifică şi hem

Structura şi functia Mb Globina este un peptid cu un singur lanţ care conţine 153 aminoacizi şi care este asemănător din punct de vedere structural cu subunităţile polipeptidice catenare din molecula hemoglobinei Această omologie biochimică permite utilizarea mioglobinei ca model pentru interpretarea anumitor proprietăţi complexe ale hemoglobinei

Structura şi funcţia Mb Componenta α-helicală Mioglobina este o moleculă compactă al cărei lanţ polipeptidic este pliat în proporţie de 80%, în opt segmente α-helicale, marcate prin litere, A- H Acestea au la capătul terminal fie prolină, al cărei inel pentaatomic nu poate fi integrat într-o structură de tip α-helix, fie pliuri β şi spirale stabilizate prin punţi de hidrogen şi legături ionice.

Structura şi funcţia Mb Localizarea aminoacizilor polari şi nepolari Interiorul moleculei mioglobinice este alcătuit aproape în exclusivitate din aminoacizi nepolari Aceştia sunt asamblaţi compact şi constituie o structură stabilizată prin interacţiunile hidrofobe dintre aceste resturi compactate Aminoacizii polari sunt localizaţi aproape exclusiv la suprafaţa moleculei, unde pot forma punţi de hidrogen atât între ei cât şi cu moleculele de apă.

Structura şi funcţia Mb Legarea hemului Hemul mioglobinic este localizat într-o crevasă a moleculei delimitată de aminoacizi nepolari, cu excepţia a două resturi de histidină. Unul dintre acestea este histidina proximală (F8) care se leagă direct de atomul de fier al hemului Celălalt, histidina distală (E7) nu interacţionează direct cu gruparea hem, dar contribuie direct la stabilizarea legăturii oxigenului cu Fe2+

Structura şi funcţia Mb Legarea hemului Componenta globinică sau proteică a mioglobinei creează un mediu favorabil hemului care permite legarea reversibilă a unei molecule de oxigen, proces denumit oxigenare Cedarea simultană de electroni de către Fe2+, process denumit oxidare are loc foarte rar.

Legarea oxigenului la mioglobină şi hemoglobină Mioglobina poate lega o singură moleculă de oxigen deoarece conţine o singură grupare hem Hemoglobina poate lega patru molecule de oxigen, câte una la nivelul fiecăruia din cele patru grupări hem Gradul de saturaţie (Y) al acestor situsuri de legare a oxigenului din componenţa moleculelor de mioglobină sau hemoglobină poate varia între zero (situsuri goale în toatalitate) şi 100 % (situsuri ocupate în totalitate).

Legarea oxigenului la mioglobină şi hemoglobină Afinitatea pentru oxigen a mioglobinei comparativ cu hemoglobina este mult mai mare, la toate valorile pO2 Presiunea parţială a oxigenului necesară atingerii nivelului mediu de saturaţie la nivelul situsurilor de legare a oxigenului (P50) este de aproximativ 1 mmHg pentru mioglobină şi de 26 mmHg pentru hemoglobină Cu cât afinitatea pentru oxigen este mai mare (cu cât oxigenul este legat mai puternic) cu atât scade valoarea P50. 100% 50%

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Curba de saturare cu oxigen a mioglobinei are formă de hiperbolă Acest fapt reflectă faptul că mioglobina leagă reversibil o singură moleculă de oxigen Mb

Legarea oxigenului la Mb şi Hb În consecinţă, între mioglobina oxigenată (MbO2) şi deoxigenată (Mb) se stabileşte o relaţie de echilibru: Mb + O2  MbO2 Acest echilibru este deviat de o parte şi de alta în funcţie de în funcţie de adaosul sau extracţia de oxigenului din sistem. Mioglobina este special concepută să lege oxigenul eliberat de hemoglobină la valori reduse ale pO2 la nivel muscular. Pe de altă parte, mioglobina cedează oxigenul celulei musculare în condiţiile unui necesar crescut de oxigen.

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Curba de disociere a oxigenului în cazul hemoglobinei are formă sigmoidală, fapt care relevă cooperarea subunităţilor structurale în procesul de legare a oxigenului. Hb

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Legarea coactivă a oxigenului de către cele patru subunităţi ale Hb înseamnă că ataşarea unei molecule de oxigen la nivelul unei grupări hem induce o creştere a afinităţii pentru oxigen la nivelul celorlalte grupări hem din componenţa aceleiaşi molecule de hemoglobină Acest efect este denumit interacţiune hem-hem. Legarea primei molecule de oxigen la Hb este mai dificilă, legarea următoarelor molecule de oxigen decurgând cu o afinitate crescută în intervalul de 20-30 mmHg.

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Efecte alosterice. Reglarea transportului de O2 Capacitatea hemoglobinei de a lega reversibil oxigenul este influenţată de următorii efectori alosterici (cu tropism diferit): pO2 pH-ul mediului pCO2 2,3-DPG (bifosfoglicerat) disponibil

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Interacţiunea acestora cu un situs al moleculei de hemoglobină afectează procesul de legare a oxigenului la grupările hem cu localizare moleculară diferită Capacitatea de legare a oxigenului de mioglobină nu este influenţată de efectori alosterici.

Legarea oxigenului la Mb şi Hb 1. Interacţiunile hem-hem (Cooperativitatea) Aspectul sigmoidal al curbei de legare a O2 reflectă modificările structurale specifice iniţiate la nivelul unei grupări hem şi transmise succesiv şi celorlate grupări hem din componenţa tetramerului de hemoglobină Efectul net constă în faptul că afinitatea Hb pentru ultima moleculă de oxigen legată este de aproximativ 300 ori mai mare decât afinitatea pentru prima moleculă de oxigen legată

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Procesul de legare coactivă a O2 îi permite Hb să livreze ţesuturilor o cantitate mai mare de oxigen ca răspuns la modificări relativ reduse ale presiunii parţiale a oxigenului La nivel pulmonar, concentraţia oxigenului este crescută şi hemoglobin aeste saturată cu oxigen. În ţesuturile periferice, oxihemoglobina cedează cea mai mare parte a oxigenului, urmând ca acesta să fie utilizat în cadrul metabolismului oxidativ al ţesuturilor.

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Interpretarea aspectului sigmoidal al curbei de disociere a oxigenului Mb Hb Panta abruptă a curbei de disociere a oxigenului reflectă direct gradientul O2 între plămâni şi ţesuturi care facilitează transportul şi livrarea eficientă a O2 din medii cu pO2 crescut în medii cu pO2 scăzut O moleculă care prezintă o curbă de disociere a O2 cu aspect de hiperbolă, cum este Mb nu are aceeaşi capacitate de cedare a oxigenului în intervalul valoric al pO2 menţionat. În acest interval presional, afinitatea Mb pentru O2 ar fi maximală şi capacitatea de cedare a O2 către ţesuturi ar fi egală cu zero

Legarea oxigenului la Mb şi Hb 2. Efectul Bohr Afinitatea Hb pentru O2 scade în mediul acid (ţesuturile periferice) Efectul Haldane Afinitatea Hb pentru O2 scade atunci când CO2 creşte în ţesuturile periferice ţesuturi plămâni ţesuturi plămâni

Legarea oxigenului la Mb şi Hb Efect Bohr 2. Efectul Bohr Disocierea oxigenului de pe molecula de Hb este accelerată de scăderea pH-ului sau de creşterea PpCO2 În ambele situaţii are loc scăderea afinităţii Hb pentru oxigen cu devierea la dreapta a curbei de disociere a oxigenului, ambele efecte stabilizând forma T a hemoglobinei Această modificare a capacităţii de legare a oxigenului este denumită efect Bohr. Creşterea pH-ului sau scăderea concentraţiei CO2 determină creşterea afinităţii Hb pentru O2 cu devierea la stânga a curbei de disociere a oxiHb.

Legarea oxigenului la Mb şi Hb 3. Acţiunea 2,3 DPG. Este un metabolit al glicolizei format în hematii, iar legarea de Hb determină, indirect eliberarea O2 la ţesuturi.

Legarea oxigenului la Mb şi Hb 3. Acţiunea 2,3 DPG. Se află în cantităţi semnificative în hematii (fosfatul anorganic), cantitatea de Hb şi 2,3DPG fiind echivalentă. Concentraţia este de aproximativ 4,5mM. Reduce afinitatea pt O2 a Hb legându-se la deoxiHb nu şi la oxiHb şi stabilizând forma T a Hb. HbO2 + 2,3 BPG Hb-2,3BPG + O2 oxiHb deoxiHb

3. Acţiunea 2,3 DPG Situsul de legare a 2,3 DPG O singură moleculă de 2,3 DPG se ataşează la nivelul unei nişe, constituită din două lanţuri beta globinice, chiar în tetramerul deoxiHb Această nişă conţine un nr de AA cu sarcină electrică pozitivă care formează legături ionice cu grupările fosfat electronegative din componenţa 2,3 DPG 2,3 DPG este îndepărtat în cursul procesului de oxigenare a Hb.

3. Acţiunea 2,3 DPG După decuplarea 2,3 DPG, Hb are o afinitate crescută pt O2 Prezenţa în hematie reduce semnificativ afinitatea Hb pentru O2 şi determină devierea la dreapta a curbei de disociere a O2 Afinitatea redusă permite disocierea eficientă a O2 de Hb la presiunea scăzută a O2 din ţesuturi

2,3 DPG În hipoxia cronică (BPOC sau altitudine), anemii cronice: [2,3 DPG] în hematii creşte Hb nu primeşte o cantitate suficientă de O2 Nr redus de hematii nu asigură necesarul de O2 Creşterea [2,3 DPG] induce scăderea afinităţii pt O2 a Hb şi permite cedarea unei cantităţi mai mari de oxigen în capilarele tisulare

2,3 DPG În cazul sângelui transfuzat, conservarea sg pe suport de citrat determină scăderea 2,3 DPG în hematii Sg prezintă o afinitate anormal de mare pt O2 si nu cedează eficient oxigenul către ţesuturi. Hb = “capcana” pt O2 Hematiile transfuzate îşi refac rezervele de 2,3 DPG în 24-48 ore HbF leagă slab 2,3BPG; afinitate crescută pt O2 a HbF ce favorizează transferul O2 spre eritrocitele fătului

2,3 DPG Statusul pacienţilor cu afecţiuni severe poate fi grav compromis în urma administrării unei cantităţi crescute de sânge spoliat de 2,3 DPG Scăderea concentraţiei de 2,3 DPG poate fi împiedicată prin adaosul unor substraturi speciale, inozina, în soluţia conservantă Inozina (hipoxantin-riboza) este o moleculă neionizată ce penetrează hematia eliberând miezul de riboză ce va fi fosforilat intrând în ciclul hexozomonofosfatului fiind convertit la 2,3 DPG.

Legarea oxigenului Mb şi Hb

Izoformele hemoglobinei La acelaşi individ sunt sintetizate în stadiile fetale şi embrionare diferite izoforme sau izoenzime ale unei proteine care pot fi prezente în diferite ţesuturi sau în localizări intracelulare specifice. Toate izoenzimele au aceeaşi funcţie Izoenzimele sunt enzime cu structură primară diferită care catalizează aceeaşi reacţie şi care sunt codificate de gene diferite. O parte dintre ele rezultă din splicing-ul alternativ al pre-mARN formând diferite mARN-uri. mARN este matriţa finală a acidului nucleic utilizată în sinteza proteică.

Izoformele Hb Izoformele hemoglobinei reprezintă un exemplu de modificare apărută în perioada embrionară şi fetală Hemoglobina fetală HbF este exprimată în ultimul trimestru de sarcină până la naştere când este înlocuită de HbA HbF este formată din două lanţuri polipeptidice α şi două γ în comparaţie cu HbA ce conţine două lanţuri α şi două β.

Izoformele Hb În stadiile de dezvoltare embrionară sunt produse lanţuri polipeptidice α ε şi ζ cu o compoziţie diferită în aminoacizi Diferenţele apar din cauza mutaţiei unei gene α duplicate, rezultând lanţul ζ Atât Hb fetală cât şi cea embrionară prezintă afinitate mai mare pentru O2 faţă de HbA, acest fapt fiind un avantaj în condiţiile unei presiuni mici a O2 la care este supus fătul. În diferite stadii de dezvoltare sunt exprimate şi traduse genele globinei specifice etapei

Izoformele Hb Pentru HbF, valoarea presiunii parţiale a oxigenului la care proteina este saturată în proporţie de 50%, P50 este de 19mmHg, în timp ce în cazul HbA este de aproximativ 26,8mmHg Ca urmare, curba de saturaţie în oxigen este orientată spre stânga în cazul HbF în comparaţie cu cea pentru HbA.

Diferenta dintre Mb, HbA si HbF

Izoformele Hb Tratamentul siclemiei După oprirea producţiei de HbF după naştere copiii încep să producă HbA La cei cu siclemie, începe producerea de HbS care modifică forma hematiilor care vor bloca vasele de sânge, cauzând episoade ocluzive dureroase specifice bolii.

Izoformele Hb Tratamentul siclemiei Dacă HbF rămâne forma predominantă de Hb după naştere, numărul episoadelor ocluzive se reduce la aceşti pacienţi Hidroxiurea stimulează producerea HbF şi poate fi utilizată în tratamentul siclemiei Reducerea severităţii bolii cu ajutorul HbF se explică prin capacitatea acesteia de a inhiba formarea agregatelor de Hb în celulele roşii care conţin şi HbS Tratamentul combinat hidroxiuree-eritropoietină recombinantă este mult mai eficient decât hidroxiureea, crescând nivelul de HbF şi favorizând dezvoltarea celulelor F conţinând HbF.

Liganzi ai Hb

Liganzi ai Hb 1) CO (carboxi-Hb) Afinitatea sa pentru hem este de 200 ori mai mare faţă de cea a oxigenului Deplasabil cu un amestec de 95%O2/ 5%CO2 2) CO2 (carbamino-Hb) Hb fixează CO2 pe un aminoacid al extremităţii C- terminale al unui lanţ , favorizând forma T 3) NO Moleculă vasodilatatoare cu o afinitate pentru Hb de 8000 ori mai mare faţă de cea a oxigenului.

Sistemul tampon al Hb Hematie

Sistemul tampon al Hb Hb este bogată în His (33/ moleculă) AA are un pKa de 7,3, foarte apropiat de pH plasmatic La pH fiziologic există 50% din fiecare formă a His Abundenţa de Hb din sânge şi nr mare de molecule de His = sistem tampon foarte eficace Globina Globina

Hemoglobinopatii Afecţiuni genetice cauzate de: 1. sinteza unor Hb anormale 2. sinteza de cantităţi insuficiente de Hb 3. ambele Anemia falciformă (HbS), hemoglobinopatia C (HbC) şi sindroamele talasemice sunt afecţiuni care pot avea evoluţie clinică gravă

Hemoglobinopatii Hemoglobinopatii: prin deficit calitativ- hemoglobine patologice (S, C) prin deficit cantitativ- talasemiile HbS: înlocuirea Glu cu Val, crize vasoocluzive HbC:Glu cu Lys, anemie hemolitica cronica; nu necesită tt specific Methemoglobinemiile: Hb nu leagă O2 (Fe3+); hipoxie tisulară (cefalee, anxietate, dispnee); tt cu albastru de metilen care este oxidat in paralel cu reducerea ionului de Fe 3+

Hemoglobinopatii Talasemiile- afecţiuni hemolitice ereditare cauzate de un dezechilibru în sinteza lanţurilor de globină Beta-talasemiile (minora sau majora): deficit de sinteza a lanţului beta Lanţurile alfa nu pot forma stabili tetrameri şi precipită determinând moartea prematură a precursorilor eritrocitari. Tt: transfuzii, transplant medular Alfa-talasemiile- tetrameri beta ce nu stabilesc interactiuni hem-hem; curba cu aspect hiperbolic Anemie hemolitica de gravitate variabila

IMUNOGLOBULINELE Sunt proteine plasmatice din clasa gamma-globulinelor cu rol de anticorpi Sintetizate de limfocitele B activateca raspuns la prezenta unor Ag straine organismului sau care au suferit modificari Ac+Ag= complex imun Ag-Ac Grp chimice ce decl. sinteza unui Ac= determinanti antigenici 4 lanturi peptidice: - 2 l grele H (heavy) identice: δ,α, μ, δ, ε -5 clase: IgG, A, M, D, E - 2 l usoare L (light) identice: κ, λ

IMUNOGLOBULINELE Lanturile sunt legate prin punti disulfurice Ig sunt glicoproteine (2-12% continut glucidic) Tetrameri H2L2 cu doua regiuni: Variabile (V): capetele N-terminale ale l grele si usoare cu secventa de AA variabila; regiuni hipervariabile Constante (C) :secventa de AA este aproape ct pt fiecare clasa de Ig

IMUNOGLOBULINELE Între Ag si Ac au loc interactiuni: Hidrofobe Necovalente Legaturi de hidrogen cu grad inalt de specificitate

IMUNOGLOBULINELE 5 clase Ig: -IgA: plasma, secretii intestinale, lacrimi; prima linie de aparare; nu activeaza C -IgE: pe Le bazofile plasmatice si pe mastocitele din peretii vaselor; reactii alergice (secretia de histamina) -IgD: in plasma integrate in mb limfocitelor B -IgG: constituie fractiunea majora a Ig plasmatice; activeaza celulele fagocitare cat si C; in aparare infectioasa; RI secundar -IgM: RI primar; Ac infectiosi

Proteine fibrilare

COLAGENUL

COLAGENUL

COLAGENUL- distribuţia în ţesuturi

COLAGENUL- structura

COLAGENUL- structura

COLAGENUL- structura

COLAGENUL-biosinteza Formarea superhelixului de colagen. Etape: 1. Sinteza lanturilor alfa; Hyp si Hyl nu corespund codonilor din mARN transcrisi din AND 2. In prezenta enzimelor lizil-hidroxilaza si prolil-hidroxilaza, O2, Fe, acid ascorbic (activator) si alfa-cetoglutaric are loc hidroxilarea; se formeaza helixul poliprolinei 3. asocierea celor 3 lanturi pp-triplu helix= procolagen intact; glicozilarea in pozitia 5 a Hyl in prezenta transferazelor

COLAGENUL- formarea hidroxiprolinei

COLAGENUL-biosinteza Procolagenul intact contine la capetele N-si C-terminale extensii polipeptidice numite si telopeptide; la capatul C-terminal extensiile sunt unite prin punti disulfurice, care au rolul de a alinia lanturile alfa in vederea formarii superhelixului.

COLAGENUL- condensarea Allys

COLAGENUL-biosinteza 4. procolagenul format la nivelul RE ajunge in aparatul Golgi pe calea veziculelor de secretie la MC, iar prin exocitoza in spatiul extracelular 5. extracelular intervin procolagen-peptidazele N-si C-terminale care indeparteaza extensiile de la ambele capete rezultand tropocolagen (T), forma solubila a colagenului. 6.T se asambleaza si formeaza fibrilele de colagen; moleculele se aliniaza cap la coada si lateral; se suprapun ¾ din lungime, fiind decalate cu ¼ din L

Formarea microfibrilei de colagen

Formarea microfibrilei de colagen Aceste spatii sunt diferite la tesuturile dure (au exact volumul necesar pt a patrunde ionii de calciu si fosfat necesari mineralizarii) si cele moi (depunerea de ioni de calciu si fosfat nu e posibila, mineralizarea neavand loc). Schematic, biosinteza colagenului poate fi redata astfel:

Sinteza colagenului Prolil şi lizil hidroxilaze Transferaze Procolagen intact Tropocolagen Procolagen peptidaza Lizil oxidaza

Tipuri de colagen V. (alfa1V), alfa2- continut crescut de Hyl, in cantitati mici in tesuturi

COLAGENOZE

Alte boli ale colagenului

Alte boli ale colagenului

Keratina

Keratina-structura

Keratina-structura

Keratina-formarea micro-şi macrofibrilelor

Keratina

Elastina- structura şi rol

Elastina- structura şi rol Reticularea se realizeaza pe 2 cai: Prin oxidarea unor resturi de lizina si allizina sub actiunea unor oxidaze cu formarea de aldimine prin condensare cu gruparea ε a lizinei Condensarea a 3 resturi de allizina cu o grupare ε a lizinei nemodificate. Se formeaza desmozina, un nod molecular ce mentine in echilibru patru lanturi de elastina.

Rolul α1- antitripsinei în degradarea elastinei α1- antitripsina

Proteaze

Intrebari Femeie 30 ani, cu dispnee progresiva. Neaga consumul de tigarete. Antecedentele familiale releva o boala pulmonara necunoscuta la una din surorile pacientei. A. Deficit de prolil-hidroxilaza B. deficit de alfa1-antitripsina C. carenta alimentara de vitamina C D. scaderea activitatii elastazei E. cresterea activitatii colagenazei

Intrebari Deficitul de alfa1-antitripsina= afectiune genetica ce det. emfizem pulmonar in absenta fumatului. Activitatea elastazei creste; elstina din peretii alveolari se ditruge Deficitul de alfa1-antitripsina tb suspectat la pacientii cu BPOC < 45 ani, fara antecedente de bronsita cronica sau consum de tutun sau cand exista mai multi membri ai aceleiasi familii cu patologie pulmonara obstructiva cu debut la varsta tanara.

Intrebari 2. Care dintre urmatoarele afirmatii caracterizeaza regiunile alfa-helix proteice? A. Toate au aceeasi structura primara B. Sunt formate in principal prin legaturile de hidrogen dintre atomul de oxigen al gruparii carbonil al unei grupari peptidice si hidrogenul amidic al unei alte legaturi peptidice C. formate prin legaturile de hidrogen dintre atomul carbonil al unei legaturi si atomii de hidrogen ai radicalilor unui alt AA D. formate prin legaturile de hidrogen dintre 2 AA adjacenti ai structurii primare E. au un continut ridicat in prolina si glicina

Intrebari Care dintre urmatoarele afirmatii referitoare la proteinele globulare sunt adevarate? A.Aa hidrofili tind sa fie in interior B. AA hidrofobi sunt la exterior C. structura tertiara e formata prin interactiuni hidrofobe si electrostatice intre AA precum si din legaturi de H intre AA si intre AA si apa D. structura secundara rezulta in principal prin interactiunile hidrofobice dintre aa E. puntile disulfidice covalente

Intrebari O proteina prezinta un domeniu transmembranar compus in intregime dintr-o structura secundara tip alfa-helix. Care dintre urmatorii AA pot fi gasiti in acest domeniu? A. prolina B. Glutamat C. Lizina D. Leucina E. Arginina

Intrebari La autopsia unui pacient cu boala Alzheimer s-au evidentiat agregate proteice si placi in diferite regiuni ale creierului. Aceste placi necesita coloratia specifica amiloidului. Care dintre urmatoarele structuri sunt mai carateristice acestora? A. un continut ridicat in foia beta pliata B. un continut ridicat in alfa-helix C. un continut ridicat de bucle intamplatoare D. punti disulfidice intre lanturile polipeptidice E. conformatia nativa cu energie minima