Eksperimentalni pristupi i postavka eksperimenta u imunološkim istraživanjima

RAZLIČITI PRISTUPI

IN VITRO -„u čaši“,van živog organizma -kontrolisani uslovi -mana: ne mogu se postići tačni uslovi prirodnog okruženja organizma (složene interakcije unutar organizma)

IN VIVO -„unutar živog“ -studije na laboratorijskim životinjama i klinička ispitivanja - različiti model sistemi -sveobuhvatni efekti na živi organizam

IN SILICO - računarske simulacije procesa koji se dešavaju u živom organizmu - novi način ispitivanja (Miramontesa, 1989. godine) - veliki broj tehnika (bakterijsko sekvenciranje, molekulsko modelovanje, ćelijske simulacije)

KULTURA ĆELIJA Postupak gajenja ćelija u strogo kontrolisanim uslovima ►Zašto se koriste ćelijske kulture? ►izolacija ćelija iz tkiva i organa ►ćelije imunskog sistema: limfni organi (primarni i sekundarni),periferna krv,telesne duplje, periferna tkiva (pluća,koža, jetra, reproduktivni i interstinalni sistem...) ►uzgajanje ćelija u medijumu za kultivaciju

Izolacija ćelija iz različitih tkiva/organa... Zavisno od tipa tkiva primenjuju se i kombinuju različite tehnike njihovog izdvajanja: mehaničko istiskivanje, enzimska digestija, selektivno izdvajanje...

+ serum,glukoza (ili drugi šećeri),antibiotici i antimikotici HRANLJIVI MEDIJUM Smeša neorganskih soli (sulfati,hloridi,fosfati), vitamina i aminokiselina + serum,glukoza (ili drugi šećeri),antibiotici i antimikotici ► vrsta medijuma i suplementi zavise od tipa ćelija koje se kultivišu

Različite vrste medijuma za kultivaciju 1.MEM 2. DMEM 3. RPMI-1640 (sa ili bez indikatora pH) 3. HAM 4. BME

►Medijumi sa i/ili bez kalcijuma ►Izvor i kvaltet seruma od velike važnosti za uspeh kulture i kvalitet kultivisanih ćelija (Fetalni Teleći Serum, FTS), serum mora biti prethodno inaktivisan (56 oC, 30 min) ►Medijum i serum ne smeju sadržati endotoksine (utiču na aktivnost ćelija)

STERILAN RAD 1. Posebne prostorija i mere opreza 2. Ultravioletne lampe 3. CO2 inkubator (oC,vlažnost, CO2)

Podela ćelijskih kultura 1. PRIMARNA ĆELIJSKA KULTURA SEKUNDARNA ĆELIJSKA KULTURA 2. ĆELIJSKE LINIJE

Primarne ćelijske kulture 1. Vode poreklo direktno iz organa ili tkiva 2. Ograničenog životnog veka 3. Imaju sve karakteristike organa/tkiva iz kojih su izolovane 4.Mogu se koristiti za izolaciju određenog ćelijskog tipa (fenotipska i funkcionalna karakterizacija)

Sekudarne ćelijske kulture ● Subkultivacija primarne ćelijske kulture ● Ćelije primarne kulture se prebacuju u novi sud, menja se hranljivi medijum i razdvajaju se ćelije koje su se grupisale (najčešće enzimskim tretmanom) ● Na ovaj način se ćelijama obezbeđuju optimali uslovi za normalan dalji rast (obnavljanje nutritijenata)

Ćelijske linije Omogućavaju proučavanje živih ćelija i njihovog odgovora u određenim uslovima i na tretman različitim molekulima ► Od izuzetnog značaja: informacije o biologiji ćelija, razvoj novih strategija u tretmanu patoloških stanja, razvoj novih farmakoloških agenasa (posebno antitumorskih) ● Ćelijske linije poreklom od normalnog tkiva i/ili tumora ● Ćelijske linije sa insertovanim ili utišanim genom od interesa ● Ćelijske populacije začete od jedne ćelije (klonalna ćelijska linija) ● Banke ćelijskih linija

TUMORSKE ĆELIJSKE LINIJE ● Kontinuirano se umnožavaju in vitro ● Model sistem tumora kod ljudi ● Antitumorska efikasnost novih terapeutika,signalni putevi značajni za opstanak tumorskih ćelija, proliferacija,imunomodulacija...

Da bi tumorska ćelijska linija bila adekvatna ćelije moraju da zadrže sve karakteristike tumora iz koga su potekle Mogući problemi: kontaminacija mikroorganizmima, kontaminacija nekancerogenim ćelijama ili drugim ćelijskim linijama Veliki broj tumorskih ćelijskih linija koje se razlikuju po morfologiji i sposobnosti adhezije za površinu

PREMA NAČINU RASTA ĆELIJSKE KULTURE MOGU BITI: Adhezivne ćelijske linije Naziv Vrsta i tkivo porekla Morfologija MRC-5 Čovek, pluća Fibroblastna HeLa Čovek, cerviks Epitelna L929 Miš, vezivno tkivo HEK 293 Čovek, bubreg Hep G2 Čovek, jetra BAE-1 Govedo, aorta Endotelna SH-SY5Y Čovek, neuroblastom Neuroblastna Ćelijske linije u suspenziji Namalwa Čovek, limfom limfoblastoidna HL60 Čovek, leukemija YAC-1 Miš, limfom U 266B1 Čovek, mijelom PREMA NAČINU RASTA ĆELIJSKE KULTURE MOGU BITI: SUSPENZIONE (Ćelije rastu u suspensiji kao pojedinačne ili male slobodno plutajuće grudve) MONOSLOJNE (ćelije su adherirane za dno suda u kome se gaje) Način rasta odslikava tkivo iz kojeg je data ćelijska linija dobijena

ZADATAK 1: Priprema medijuma za kultivaciju ćelija Ćelijska linija karcinoma debelog creva (HCT116) se gaji u HEPES-om (20 mM) puferizovanom RPMI 1640 medijumu sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM L-glutamina i 1% rastvorom antibiotika/antimikotika. Napraviti 100ml medijuma za gajenje ovih ćelija. Na raspolaganju imate serum free RPMI 1640 medijum, inaktivisan fetalni goveđi serum, 1M HEPES, 2M L-glutamin, rastvore streptomicina i amfotercina u neograničenim količinama. .

ZADATAK 2: Priprema i postavljanje kulture ćelija Tokom eksperimenta ćelije se gaje u mikrotitarskim pločama sa 96 bunarića. Ukupna zapremina ćelijske kulture u svakom bunariću je 200μl od čega je 50μl stimulatora ( npr. LPS-a) ili medijuma (za kontrolu), 50μl test jedinjenja (odgovarajuće koncentracije) i u 100μl pripremljenog medijuma za kultivaciju su ćelije. Eksperiment sa kulturom ćelija se uvek radi u više ponavljanja najmanje triplikat, a sada će se u eksperimentu za ispitivanje aktivnosti test jedinjenja postaviti četvoroplikati. Na dole prikazanoj shemi mikrotitarske poloče je prikazan plan postavke eksperimenta za ispitivanje test jedinjenja A i B različitim koncentracijama (1-5 za test jedinjenje A. 1-6 za test jedinjenje B) u odsustvu (Ø) i prisustvu stimulatora. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Ø A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B C D E stimulator A1/s A2/s A3/s A4/s A5/s B1/s B2/s B3/s B4/s B5/s B6/s F G H

A) Na osnovu prethodno određenog broja ćelija (5x107 ćelija po ml suspenzije HCT 116 ćelija i 7x109 ćelija po ml suspenzije ćelija astrocitoma), napraviti razblaženu suspenziju ćelija tako da unošenjem 100 μl tako pripremljene suspenzije u svakom bunariću mikrotitarske ploče bude po 105ćelija (shema postavke eksperimenta gore prikazana). B) Koncentracija štok rastvora stimulatora je 1μg/ml.  Napraviti od štok rastvora stimulatora potrebnu zapreminu razblaženog rastvora tako da koncentracija stimulatora u svakom bunariću treba da bude 100ng/ml kulture. Napomena: stimulator se u bunarić unosi u zapremini od 50 μl i potrebno ga je dodati samo u bunariće polovine mikrotitarske ploče (označeno na shemi).

  C) Potrebno je ispitati imunomodulatorni efekat 0.01, 0.1, 1, 10 i 50 μM rastvora test jedinjenja A i efekat 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 i 50 μM rastvora test jedinjenja B. Ispitivane supstance su u prahu i koncentracija supstance A je 1093.1 g/mol, a supstance B 1119.9 g/mol. Od datih supstanci u prahu napraviti 10 ml 1mM štok rastvora test jedinjenja A i B i potom napraviti seriju radnih razblaženja kako bi se unošenjem 50 μ rastvora test jedinjenja u bunariće mikrotitarske ploče dobile gore zadate finalne koncentracije datih jedinjenja u kulturi ćelija.

Prvo odrediti minimalnu zapreminu svakog razlaženja koja nam je potrebna Serijska razblaženja.... 20XR 30.5 µl 5XR 10XR 10XR 10XR 55µl 55 µl 110 µl 50 µl 50 µM 10 µM 1 µM 0.1 µM 0.01 µM V= 610 µl V=550 µl V=550 µl V=550 µl V=500 µl 1 mM štok sustance A