Encimska kinetika Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti (substrati S) v produkte (P): S → P Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti (mol/s) V = -d(S)/dt = d(P)/dt Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za encimsko aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (SI sistem) = 1mol/s Specifična aktivnost encimskega pripravka: št. encimskih enot/mg roteina; enote za specifično aktivnost: μmol/min/mg A B Masa proteinov (vse kroglice) je večja v čaši A kot v čaši B Št. molekul encima je enako v obeh čašah – encimska aktivnost enaka v obeh čašah Encimska aktivnost, izražena na mg proteinov (specifična aktivnost) je večja v čaši A kot v čaši B

Koncentracija substrata vpliva na hitrost encimske reakcije S → P V = -d(S)/dt = d(P)/dt V0 = ΔP/Δt v času t=0 Koncentracija substrata se s časom spreminja → začetna hitrost V0 je hitrost v času t = 0 in je karakteristična za reakcijo v pogojih (S) >>> (E) ΔP Δt S4 > S3 > S2 > S1 → V04 > V03 > V02 > V01

Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost encimske reakcije V0=k[S]1 – 1. red reakcije V0=k[S]0 – 0. red reakcije maksimalna hitrost Vmax Reakcijski pogoji: (S) > > (E) (S) je konstantna v času meritve Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Michaelisova konstanta Km

Michaelis-Mentenova kinetika Leonor Michaelis, Maud Menten 1912 Ključnega pomena za encimsko katalizo je nastanek kompleksa ES predpostavke nastanek kompleksa ES je hitra reverzibilna stopnja razpad kompleksa ES je počasna reverzibilna stopnja → razpad ES določa hitrost celotne reakcije encim se nahaja v obliki kompleksa ES, nasičen s substratom → saturacijska kinetika 5. koncentracija kompleksa (ES) je konstantna – stanje dinamičnega ravnotežja – “steady state”

Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost encimske reakcije Opis krivulje V0 = V0(S) podaja Michaelis-Mentenova enačba Predpostavke pri izpeljavi V zečetku je koncentracija P zanemarljivo majhna, ni reakcije P → S (k-2 = 0) Razgradnja ES določa hitrost celotne reakcije V0 = k2[ES] Težko je izmeriti [ES] (V0 = V0([ES])), zato določimo Km in Vmax , s katerima okarakteriziramo encimsko aktivnost

nadaljevanje hitrost nastanka ES = hitrost razpada ES = hitrost nastanka ES = hitrost razpada ES Michaelisova konstanta Km Km = k2 + k-1/k1

Vmax = k2Et Michaelis-Mentenova enačba

Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost – grafična določitev konstant Km in Vmax pri [S] << Km pri [S] > > Km

Transformacija Michaelisove enačbe v dvojno recipročno enačbo (Lineweaver-Burk-ova /LB/ transformacija) MM enačba LB enačba MM diagram V0 vs. [S] LB dvojni recipročni diagram 1/V0 vs.1/[S] uporaben za določitev Vmax in Km

Vrednosti Km nekaterih encimov in substratov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Pomen encimske aktivnosti v fiziologiji primer: občutljivost Azijcev na alkohol Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci Reakcije razgradnje alkohola CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + H+ + NADH encim: alkoholna hehidrogenaza CH3CHO + NAD+ → CH3COOH + H+ + NADH encim: aldehidna dehidrogenaza Azijci nimajo izoencimske oblike encima aldehidne dehidrogenaze z nizko Km ; posledica: aldehid v krvi dolgo kroži po tekesu Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti encimov: različna molekulska masa (Mr), različna encimska aktivnost (V0), različna MM konstanta (Km),

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov Km kkat kkat/Km

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, Km Vmax , Km eksperimentalno določimo Km odraža fiziološke razmere - za mnoge encime velja: Km ≈ [S] Km je merilo za afiniteto E do s samo, če je Če je = = Kd Km, Michaelisova konstanta Kd, disociacijska konstanta kompleksa ES

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, kkat Sprostitev produktov je pogosto najpočasnejša stopnja določa hitrost celotne reakcije Vmax = k3Et] Vmax – maksimalna hitrost k3 – hitrostna konstanta Et] – celokupna konc. encima kkat = k3 kkat - pretvorbeno število: št. molekul substrata, ki se pretvori v produkt na eni molekuli encima v enoti časa (encim je nasičen s substratom)

Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število (turnover number), kkat Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Slabost: izražanje encimske učinkovitosti s Km ali kkat - ni upoštevana neencimska reakcija, ni informacije za koliko encim pospeši reakcijo

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov: kkat/Km Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Najboljši način za izražanje encimske aktivnosti - kkat/Km V0 = kkat/KmEt]S]

Na encimsko aktivnost vplivajo zunanji pogoji Vmax , Km – eksperimentalno določimo Vmax , Km – karakteristični za encim Vmax , Km – spreminjata se z zunanjimi pogoji - ionska moč - pH - temperatura Vpliv pH na encimsko aktivnost (V0) Vpliv T na encimsko aktivnost (V0) V0 pepsin glukoza-6-fosfataza

Encimsko katalizirane bisubstratne reakcije - mehanizem Encimske reakcije, ki vključujejo ternarni kompleks Encimske reakcije, pri katerih ne nastaja ternarni kompleks (ping-pong mehanizem) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer bisubstrante reakcije: Prenos –NH2 skupine z enega na drug substrat; encimi: amino transferaze 1 Povišana koncentracija transaminaz (glutamat/oksaloacetat transaminaza (GOT) in glutamat/piruvat transaminaza (GPT)) v serumu kaže na - poškodbo srca (srčni infarkt/ poškodovano tkivo) - okvara jeter (zastrupitev z industrijskimi topili, infekcija Koencim: piridoksal-fosfat H2N- + O= ↔ H2N- + O= ak, aminokislina kk, ketokislina ak1 + kk2 ↔ ak2 + kk1

Kako ugotoviti mehanizem bisubstratnih reakcij Kako ugotoviti mehanizem bisubstratnih reakcij? Kinetična analiza bisubstratnih reakcij Dvojni recipročni diagram potek reakcije preko ternarnega komleksa ping-pong mehanizem Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005