Acizii nucleici

Obiectivele: Tipurile de acizi nucleici, funcţiile şi repartizarea lor în celulă. Constituienţii acizilor nucleici; bazele azotate, pentozele, acidul fosforic. Nucleozidele şi nucleotidele. 3, 5- cAMP Structura primară, secundară şi terţiară a acizilor dezoxiribonucleici Cromatina. Nucleosomul. Structura acizilor ribonucleici (tRNA, mRNA, rRNA). Denaturarea şi hibridizarea acizilor nucleici.

Acizi nucleici Acizi nucleici –sunt polinucleotide, alcătuite din mononucleotide, unite prin legături 3’, 5’-fosfodiesterice. ADN - acidul dezoxiribonucleic; ARN - acidul ribonucleic.

ADN Localizarea: 97-99% - concentrat în nucleu 1-3% - situat în mitocondrii. Rolul: păstrează şi transmite informaţia genetică de la ADN parental la ADN fiică sau ARN.

ARN Localizarea: 11% - în nucleu 15% -în mitocondrii 50% - în ribosomi 24% - în hialoplasmă Deosebim:i: ARN mesager ARN ribozomal ARN de transport ARN cromosomial ARN nuclear

ARN mesager (mARN) constituie 25% din totalul ARN-lui. Localizat -în nucleu şi citozol. Prezintă copia sectorului de ADN şi conţine informaţia despre structura catenei polipeptidice a proteinei. Rolul:Transmite informaţia de la ADN spre ribozomi, sediul de sinteză a proteinei. ARN ribozomal (rARN) constituie 60% din totalul ARN-ului. Localizat- în ribozomii citoplasmei. Rolul - formează scheletul ribozomilor. Joacă un rol auxiliar în procesul de asamblare a proteinelor.

ARN de transport (tARN) constituie 15% din totalul ARN-lui. Localizat: în citoplasmă, ribosomi, mitocondrii. Rolul: participă la activarea şi transportul AA spre ribozomi şi asamblarea lor în polipeptide. ARN cromosomial – activarea genelor ADN ARN nuclear – formarea scheletelor particulei proteice care transportă ARN din nucleu în citoplasmă

Structura chimică a AN La hidroliză AN degradează în mononucleotide, care la rândul lor, la hidroliza completă degradează în BA, pentoze şi acid fosforic. ADN----A; G; C; T+dR+H2PO3 ARN----A; G; C; U+ R+H2PO3

Bazele azotate a. BA se clasifică în : majore: purinice: A, G şi pirimidinice: C,T,U minore:purinice (2metil A; 1 metilG) şi pirimidinice (5 metil C;5 hidroximetil C) b. Sunt slab solubile în H2O c. Prezintă fenomenul de tautomerie (forme lactim-lactam) d. Sunt responsabile de informaţia genetică e. BA purinice- au structură plană; cele pirimidinice- aproape plană, puţin plată j. Max capacităţii de absorbţie în ultraviolet este între 260-280 nm

Bazele purinice

Bazele pirimidinice

C1 Nucleic Acid Structure-1 Molecular Biology C1 Nucleic Acid Structure-1 Bases Bicyclic Purines: Monocyclic pyrimidine: Thymine (T) is a 5-methyluracil (U)

Structura BA minore

C1 Nucleic Acid Structure-2 Molecular Biology C1 Nucleic Acid Structure-2 Nucleosides The structures of pentose sugar

Nucleozidul constă dintr-o BA ( purinică sau Pirimidinică) + o pentoză (riboza sau dezoxiriboza) atomul C-1 al pentozei este unit cu N-9 al purinei sau N-1 al pirimidinei - leg. N glicozidică. În funcţie de pentoză: dezoxi şi ribonucleozide BA purinice +R(dR) --- ozin (adenozin, guanozin sau dezoxiadenozin, dezoxiguanozin) BA pirimidinice +R (dR) --- idin (citidin, timidin, uridin sau dezoxicitidin) Unite între ele prin legătura N glucozidică

Nucleozidele Proprietăţile: Mai solubile în H2O decât BA Mai stabile în soluţii alcaline Uşor se hidrolizează la încălzire cu acid

NUCLEOTIDE - compuşi alcătuiţi din nucleozide şi rest de acid fosforic Nucleozid mono-; di-; trifosfafat Nucleozid Rest al acidului fosforic

Nucleotide - Rolul Element structural al AN Intermediari energetici (ATP- purtătorul energiei chimice în organism) Intră în componenţa Co Servesc ca activatori ai unor molecule (UDP-Gl; CDP-colina) Servesc ca mesageri secunzi intracelulari ai hormonilor (AMPc; GMPc)

Nucleotides C1 Nucleic Acid Structure-3 Molecular Biology C1 Nucleic Acid Structure-3 Nucleotides A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups bound covalently to the 3’-, 5’, or ( in ribonucleotides only) the 2’-position. In the case of 5’-position, up to three phosphates may be attached. Phosphate ester bonds Deoxyribonucleotides (containing deoxyribose) Ribonucleotides (containing ribose)

Structura chimică

Structura primară a AN Reprezintă secvenţa mononucleotidelor în lanţul polinucleotidic liniar, legate între ele prin legăturile 3' - 5' fosfodiesterice Catenele au două capete: 5‘ – nucleozid tri fosfatul; 3‘ – gr. OH liberă

Structura secundară a ADN Watson şi Crick (1953) au postulat modelul structural al moleculei de DNA - dublul helix (spirală dublă) Caracteristicile dublei spirale: 2 lanţuri polidezoxiribonucleotidice se răsucesc helicoidal în jurul unui ax comun, formând o dublă helice cu orientare spre dreapta; Cilindrul ce încadrează dublul helix are d=2nm

Structura secundară a ADN 3. lanţurile sunt antiparalele (unul are direcţia 5’3’, altul 3’5’) 4. complimentaritatea (A îi corespunde T; iar G-C). 5. Stabilitatea dublului helix este asigurată atât de interacţiunile hidrofobe dintre BA, cât şi de legăturile de hidrogen între BA (A=T formează 2 legături de hidrogen, iar G ≡C trei legături). 6. BA hidrofobe sunt situate în interiorul spiralei duble şi aranjate sub formă de stive, pe cînd complexul pentozofosfat este situat la exteriorul spiralei duble, bine interacţionează cu apa, de aceia molecula gigantă de DNA se dizolva în apă. 7. Spirală este regulată (fiecare spiră cuprinde 10 nucleotide). Distanţa dintre BA învecinate este de 0,34 nm, perioada de identitate (pasul) – 3,4 nm. 8. La pH=7 grupele fosfat sunt ionizate, poarta sarcini negative, deaceia DNA prezintă acid puternic. 9. Dublul helix este de tip plectonemical, dar nu paranemical

Legităţile lui Chargaff Conţinutul adeninei este egal cu al timinei, iar al guaninei cu al citozinei (A=T, iar G=C) În orice preparat de DNA independent de specie suma bazelor purinice este egală cu cea a bazelor pirimidinice (A+G=T+C) Preparatele de DNA separate din diferite ţesuturi a uneia şi aceeiaş specie de organisme sunt absolut identice privind componenţa nucleotidică. Componenţa nucleotidică a DNA la aceeaşi specie nu se modifică odată cu vârstă, nu depinde de regimul alimentar şi modificările mediului. dacă A+T este mai mare decît G+T avem DNA de tip AT dacă G+T este mai mare decît A+T avem DNA de tip GT t de topire este mai mica cînd predomină perechile A-T t de topire este mai mare cînd predomină perechile G-C la eucariote DNA mitocondrial este circular

Există diferite forme de DNA care sunt determinate de gradul de dehidratare a acizilor nucleici: A,B şi Z. Modificările în dublul helix sunt dependente de anturajul extern ai moleculei de DNA. Dublul helix posedă dinamism. forma A: conţine 11 resturi la o spiră, este răsucită spre dreapta. forma clasica B: conţine 10 mononucleotide la o spiră. - 10 nucleotide ocupă 34 A (3,4 nm). - o nucleotidă cuprinde 3,4A (0,34 nm).• conformatia Z spre deosebire de A şi B este răsucită spre stînga.

Structura terţiară Reprezintă superspiralizarea dublului helix la care participă proteinele histonice şi formează cromatina Unitatea structurală a cromatinei este nucleosomul Nucleosomul – este un octamer histonic (2H2A; 2H2b; 2H3; 2H4) înfăşurat de aproximativ de 2 ori de dublul helix cu o lungime de 146 perechi de nucleotide. Între 2 nucleosmi se conţin porţiuni de ADN alcătuit din 20-60 perechi de nucleotide asociate cu H1 Lanţul polinucleosomic formează un superhelix (solenoid), fiecare spiră are 10 nucleosomi, d=30nm şi pasul de 10nm

Compactizarea cromatinei DNA Firul de cromatină? ~ 1,000 30 nm Solenoid ~40 / 50 Nucleosoma = оctamer de histone H2a, H2b, H3, H4 146 / 200 bp DNA Compactizare ~10 ori Cromosoma metafazică/ cromatina interfazică ~ 10,000

Structura secundară şi terţiară a ARNm ARNm – fiecărei gene îi corespunde molecula sa de ARNm, de aceea el este foarte heterogen Elementul de codificare al ARNm este tripletul nucleotidic – numit codon. Fiecare codon corespunde unui anumit AA Structura secundară a ARNm – o catenă curbată Structura terţiară – se aseamănă cu un fir înfăşurat pe bobină, rolul căreia îl îndeplineşte o proteină de transport numită informer

Structura secundară a t-RNA are infăţişarea unei "frunze de trifoi" - se formează în urma imperecherii complementare intracatenare a nucleotidelor anumitor sectoare. Sectoarele, care nu sunt încadrate în formarea legăturilor de H formează lanţuri sau bucle Sectorul de acceptare (4 nucleotide, 3 din care au aceeaşi succesiune- CCA cu hidroxilul 3’OH liber la care se fixează grupa COOH al AA. Bucla anticodonică - formată din 7 nucleotide. Conţine un triplet nucleotidic specific pentru fiecare t-RNA numit anticodon. Anticodonul t-RNA după principiul complementaritătii se împerechează cu codonul respectiv din RNAm. Interacţiunea codon-anticodon determină ordinea aranjării aminoacizilor în catena polipeptidică. Bucla pseudouridilică - constă din 7 nucleotide (restul acidului pseudouridilic este obligatoriu), participă la interacţiunea cu ribozomii. Bucla dihidrouridinică - constă din 8-12 resturi nucleotidice ( resturi de dihidrouridină ), interactiunează cu E- aminoacil-RNAt-sintetaza, care contribuie la recunoaşterea de către aminoacid a ARN-t specific.

Structura terţiară a tRNA Are forma L Include 2 segmente de dublu helix situate perpendicular (fiecare helix-10 perechi de baze) În afara spiralei bazele formează legături de hidrogen. Interacţiuni apar între bazele necomplementare (A-A; A-C).Multe baze sunt aranjate în stive (hidrofobe)

Structura terţiară a tRNA Are forma L Include 2 segmente de dublu helix situate perpendicular (fiecare helix-10 perechi de baze) În afara spiralei bazele formează legături de hidrogen. Interacţiuni apar între bazele necomplementare (A-A; A-C).Multe baze sunt aranjate în stive (hidrofobe)

ARNr Structura secundară – e prezentată prin sectoare spiralate unite între ele cu ajutorul unei catene curbate Structura terţiară – prezintă scheletul ribosomului. Are forma unui bastonaş sau ghem pe suprafaţa căruia sunt înfăşurate proteinele ribosomului.

Proprietăţile fizico-chimice ale acizilor nucleici - masa moleculară mare. proprietatile coloidale si osmotice, tipice pentru toţi compuşii macromoleculari. Proprietăţile lor hidrofile depind de fosfaţi. viscozitatea şi densitatea înaltă a soluţiilor, capacitatea de denaturare. la pH fiziologic toti AN sunt polianioni (-)

Denaturarea şi renaturarea Denaturarea –sub acţiunea temperaturii, mediului PH, substanţelor chimice are loc ruperea legăturilor de hidrogen şi forţelor hidrofobe ce stabilizează structura secundară şi terţiară a DNA. La denaturare DNA îşi pierde proprietăţile biologice. Ex. încălzirea DNA-duce la desfacerea spiralei duble în două catene ( are loc transformarea „spirală - ghem“). Degradarea unei jumătăţi de structură de ADN are loc la temperatura de topire. ADN bogat în C şi G au o t mai înaltă decît cele bogate în A şi T. La răcirea treptată catenele din nou se reunesc după principiul complementaritătii, formînd spirala dublă nativă. Acest fenomen se numeşte renaturare (atunci cînd t e mai mică decît cea de topire). La racirea bruscă renaturarea nu are loc. Denaturarea şi renaturarea acizilor nucieici este însoţită de schimbarea activitătii lor optice.

Hibridizarea AN Pe capacitatea de renaturare a AN este bazată metoda de determinare a gradului de înrudire a AN, care poartă denumirea de hibridizare moleculară. La baza ei stă împerecherea complementară a sectoarelor unicatenare ale AN cu formarea unui heteroduplex Hibridizarea se efectuează în felul următor: AN se denaturează separat; se incubează împreună ambele tipuri de DNA (ori DNA şi RNA). În condiţiile unui grad relativ crescut de complementaritate a acestora se formează moleculele hibride (DNA-DNA sau DNA-RNA). Aceste molecule constau din sectoare spiralate şi nespiralate. Cu cît gradul de înrudire este mai înalt, cu atît hibridizarea este mai complectă.

Această metodă a permis descoperirea particularităţilor structurii primare a DNA. S-a stabilit, că în componenţa DNA a animalelor se află sectoare cu o succesiune nucleotidică identică, care de multe ori se repetă. Hibridizarea decurge foarte repede. Restul DNA este prezentat printr-o succesiune unicală a nucleotidelor, care nu se dublează.

Obiectivele: Dogma centrală a geneticii moleculare. Concepţia: o genă - un polipeptid. Replicarea ADN- mecanismul, substratele, matricea, enzimele şi factori proteici, etapele biosintezei ADN. Telomeraza. Rolul şi structura.. Reparaţia ADN. Transcripţia sau biosinteza ARN: matricea, substratele, enzimele, mecanismul Trsanscripţia inversă. Biosinteza ARN pe matrice de ARN Modificările posttranscripţionale (processing) Inhibitorii sintezei acizilor nucleici. Ingeneria genetică şi semnificaţia ei practică. Sinteza anticorpilor

Dogma centrală a geneticei moleculare Postulatul de bază a geneticei moleculare a fost formulat de Watson şi Crick (Meselson, Stahl): este transmiterea informaţiei genetice de la ADN la proteină. Sînt încluse trei procese: replicarea; transcripţia; translaţia. Primele două procese au loc în nucleu, iar al treilea – în citozol. Procesul de transcripţie este reversibil. Enzima care catalizează transcripţia inversă se numeşte revertaza (reverstranscriptaza) şi a fost descoperită la oncoviruşi. Sinteza ARN-ului pe baza ARN se numeşte replicarea ARN, ea are loc la viruşi, care nu au ADN. Procesul de translaţie este ireversibil şi se numeşte biosinteza proteinei.

Dogma centrală a geneticii moleculare DNA RNA Proteină

Structura genelor- dimensiuni, GS; GR Gene- porţiunile ADN ce conţin informaţia genetică cu privire la sinteza unei proteine Fiecărei gene îi corespunde un lanţ polipeptidic- de aici şi conceptul: o genă –un lanţ polipeptidic GS- genele ce codează polipeptide şi ARN. Porţiunile GS ce conţin informaţie (transductibile) –exoni; iar secvenţele ce nu sunt traduse în ARNm – introni GR – segmente de ADN, repetabile, relativ mici ce au un rol reglator. Rolul lor: Pot fi semnale ce ne arată începutul şi sfârşitul GS Participă în iniţierea şi terminarea transcripţiei GS Dimensiunile genelor – f. variabile. Ex. Proteina ce conţine 350 AA--- 350X3=1050 nucleotide. Ştiind că BA sunt localizate la 0,34 nm_---- 0,34 nm X 1050=357 nm =0,36μm

Replicarea Replicarea – transmiterea informaţiei genetice de la ADN parental la ADN fiică. Caracteristicile: Se petrece în nucleu Proces semiconservativ se desfăşoară în trei etape : iniţiere, elongare, terminare prezenţa praimerului este obligatorie replicarea este cuplată cu desfăşurarea DNA parental (necesită energie) replicarea decurge în ambele direcţii cu aceeaşi viteză. Pe catena întîrziată se sintetizează fragmentele Okazaki. Este bazată pe împachetarea complementară a BA Catena-fiică este antiparalelă cu catena parentală dar nu identică după secvenţa nucleotidică Forţa motrice a procesului este hidroliza pirofosfatului angajeaza simultan intregul cromozom.

Componentele necesare replicării: Matriţă - ADN bicatenar Substrat: dATP, dTTP, dGTP, dCTP; ATP, GTP, CTP, UTP prezenţa ionilor de Mg, Mn; Zn Sistemul multienzimatic complex: Helicaza-desfacerea dublului helix, treptat, pe porţiuni mici. Cele 2 catene rămân separate ca urmare a intervenţiei proteinelor de stabilizare (SSB). Topoizomerazele I şi II – înlătură supertorsiunile ADN, rezolvă problemele topologice apărute în cursul desfacerii lui. (I – introduce supertorsiuni negative; II – scindează o leg. fosfodiesterică pe una din catene şi permite celor 2 catene să se rotească una faţă de alta) ARN primază - sintetizează primerul în direcţia 5'- 3‘ .

d. ADN polimeraza ( ADNp I, II, III)- sinteza catenei fiice în direcţia 5'→3' . – acţiune polimerazică (5'- 3‘) - sintetizează în direcţia 5‘- 3' lanţul polidezoxiribonucleotidic, preluînd instrucţii de la ADN-matriţă, - acţiune exonucleazică (3'- 5‘) ADN pII - rol neclar. ADN pI - posedă activitate 5'- 3‘ exonucleazică, înlătură primerul şi-l înlocuieşte cu fragmente de ADN e. ADN ligaza- uneşte fragmentele Okazaki de pe catena întîrziată. Catalizează formarea unei legături fosfat diesterice între 3'-OH a unui fragment de ADN şi extremitatea 5' monofosfat al altuia.

Mecanismul replicării 3 etape: iniţierea, elongarea, terminarea Originea replicării este reprezentată de o secvenţă specifică de nucleotide – secvenţa ori. Replisoma (complex proteic) recunoaşte punctul de origine. Iniţierea parcurge două etape: Formarea furcii de replicaţie- ataşarea replisomului la punctul de origine al replicării şi sub acţiunea helicazelor are loc desfacerea duplexului parental pe anumite porţiuni – replicatori (la scindarea leg. de H dintre BA - se utilizează min 2 mol. de ATP). La desfacerea duplexului parental apar regiuni superhelicoidale, care se reglează cu ajutorul girazei (topoizomerazei). Topoizomeraza efectuează rupturi monocatenare apoi sudează legătura fosfodiesterică şi favorizează relaxarea structurii DNA

b. Sinteza primerului - sub acţiunea primazei se sintetizează o porţiune mică de ARN în direcţia 5'- 3'. Primerul este format din 5-10 ribonucleotide. Cruparea 3‘OH – e un iniţiator al sintezei de ADN.

Elongarea ADN polimeraza III unindu-se la capătul 3' OH al primerului începe sinteza ADN fiică. Reacţia decurge prin atacul nucleofil al grupei 3' OH al primerului asupra unui dRNTP complementar catenei de ADN matriţă. Se formează legătura fosfodiesterică şi se eliberează PP; hidroliza PP determină polimerizarea propriu zisă. Elongarea decurge în direcţia 5'→ 3‘, şi parcurge cu aceeaşi viteză pe ambele catene Catena de bază se va sintetiza continuu, iar cea întîrziată - discontinuu: va fi formată din fragmente Okazaki (dimensiuni de 1000 – 2000 nucleotide la procariote şi 150-200 la eucariote). ADN polimeraza I exclude primerii şi sintetizează complementar ADN. Fragmentele sînt unite cu enzima ADN ligaza (necesită ATP la eucariote şi NAD la procariote).

Terminarea Terminarea replicării are loc atunci, cînd cele două bifurcaţii de replicare se întîlnesc într-o regiune opusă regiunii "ori". Proteinele speciale semnalizează oprirea repilcării prevenind acţiunea helicazelor.

Replicarea la eucariote Particularităţi: ADN polimerazele: αβγδ α- implicată în replicarea ADN nuclear- responsabilă de sinteza catenei întârziată – sinteza primerilor δ – răspunde de sinteza catenei lider. Ea manifestă acţiune exonucleazică β – implicată în reparaţia ADN γ - implicat în replicarea ADN mitocondrial, acţiune exonucleazică Bifurcaţia replicii este de 3000 baze pe minut comparativ cu 16.000 la procariote Pe o moleculă de ADN există mai multe origini de replicare (3X104 - 3X105 separate prin perechi de baze). În aceste origini multiple de replicare se organizează bifurcaţii- ce se deplasează biderecţional pe cromosomul eucariot în curs de replicare. Fragmentele Okazaki 150-200 nucleotide

Telomer Telomeraza Replicarea capetelor 5’ ale catenelor este incompletă (teoria lui Olovnicov, 1971), deoarece după înlăturarea primerului ultimului fragment Okazaki, ADN p I nu e e capabilă să completeze aceste goluri. Astfel la fiecare replicare, capetele ADN se scurtează. Aceasta nu afectează informaţia genetică deoarece catenele conţin fragmente repetitive neinformative – telomere. Telomerele sunt replicate de o E specifică – telomeraza Telomeraza - reprezintă o ribonucleoproteidă: ARN şi proteină Subunitatea proteică TRT (telomeraze revers transcriptase) posedă activitate catalitică

Telomeraza – fiind o revertază (ADN polimeraza ARN dependentă) foloseşte ca matriţă propria coenzimă – un fragment de ARN. I etapă – are loc asocierea telomerazei la capătul 3’ al catenei lider din regiunea telomerică- TTAGGG II – E extinde catena, utilizând ca matriţă ARN telomeric (se repetă) III – Catena complementară a ADN telomeric e sintetizată după principiul catenei întârziate de ADNp

Mecanismul elongării capetelor cromozomului la eucariote

Mecanismul elongării capetelor cromozomului la eucariote cromozoma GGGTTAG 3’ AUCCCAAUC 5’ Fixarea telomerei TTAGGG elongarea GGGTTAGGGTTAG 5’ AUCCCAAUC translocarea GGGTTAGGGTTAG 5’ AUCCCAAUC

Structura şi funcţia RNA telomerazice. Structura primară: la majoritatea RNA telomerice, regiunea matricială se află la depărtarea de 50 nucleotide de la capătul 5’, şi are următoarea succesiune de nucleotide 5’-CUAACCCUA-3’. Structura secundară e compusă din 4 bucle şi un fragment unicatenar, ce conţine matriţa pentru sinteza DNA telomerice.

Inhibitorii telomerazei oligonucleotidele modificate, complementare regiunii matrice a RNA – telomerazice. Aşa nucleotide specific se fixează de matriţa RNA –telo a omului, inhibînd activitatea telomerazică in vitro. In vivo apare problema transportului inhibitorilor prin membrana celulară şi mişcarea dirijată în nucleul celular. Ca inhibitori au fost testaţi şi inhibitorii reverstranscriptazelor – azidotimidina, didezoxiguanozina.

La om telomeraza e activă numai în celulele embrionale, în epiteliul intestinului, spermatozoizi şi celule canceroase.

Numărul telomerilor determină durata vieţii fiecărei celule şi condiţionează reducerea critică a numărului lor, induce moartea programată a celulei deci pierderea motivelor telomerice este cauza imbătrînirii (telomera conţine mii de motive TTAGGG). lungimea telomerei este marcherul biologic al îmbătrînirii.

Reparaţia ADN Erorile în timpul replicării sunt reduse la minimum datorită DNA polimerazei ce posedă funcţie endonucleazică Tipuri de deteriorări: Formarea de breşe Modificarea BA Pierderea de BA Formarea dimerilor de pirimidină sub acţiunea razelor ultraviolete

Reparaţia ADN Incizia dimerului sub acţiunea endonucleazelor Peticirea – sub acţiunea ADN polimerazei I Excizia fragmentului lezat sub acţiunea exonucleazei Sudarea – sub acţiunea ADN ligazei

Reparaţia prin excizia dimerului

Reparaţie prin fotoreactivare

Reparaţie prin recombinare

Transcripţia biosinteza ARN pe matriţă de ADN Particularităţi: Matriţă - DNA dublu helicoidal (prezenţa catenei anticodogene de ADN) (catena+), Substrat - ribonucleozidtrifosfaţi (ATP, GTP, CTP, UTP) Sinteza are loc în direcţia 5’3’ Este asimetrică – copierea catenei necodificătoare Este incompletă –are loc copierea doar a unei porţiuni de ADN (transcripton: promotor, operator, GS, terminator) Forţa motrice a procesului e hidroliza PP Enzima - ARN polimeraza

ARN polimeraza este o holoenzimă la procariote - este oligomer din 5 protomeri (2, ,  1 şi sigma ).  subunităţile – centre catalitice;  - fixează substratul;  1 – se leagă de ADN,  - are rol în recunoaşterea secvenţelor matriţei numit promotor, unde aderă enzima la eucariote: RNApI sintetizeaza RNA ribozomal (28S si 18S) RNApII sintetizeaza RNAm• RNApIII sintetizeaza RNAt, RNAr 5S şi molecule mai mici 3. Nu necesită prezenţa primerului 4. Nu posedă funcţie nucleazică, doar polimerazică 5. ADN polimeraza conţine Zn2+ şi necesită prezenţa în mediu a ionilir de Mg2+, Mn2+

Etapele transcripţiei Sinteza decurge în 3 etape: iniţierea, elongarea, terminarea. Iniţierea – începe în anumite secvenţe de ADN numite promotor (P – 40 nucleotide). Pe P deosebim 2 locusuri: de recunoaştere (depistat cu ajutorul sigmei) şi locusul de legare laxă a ARN polimerazei. Locusul de recunoaştere e situat la o distanţă de 25 nucleotide de locusul de legare şi 10 nucleotide de la punctul de iniţiere (+1) Toţi P bacterieni au 2 secvenţe consens situate pe catena codificătoare: Caseta Pribnow (-10) 5’ TATAAT 3’ –responsabilă de iniţierea denaturării locale a ADN Caseta -35 5’ TTGACA 3’ - la care are loc asocierea primară a ARN polimerazei  subunitatea recunoaşte caseta -35 şi se leagă la ea. E. alunecă de-a lungul ADN şi în jurul casetei -10 (Pribnow) deschide dublul helix – formând complexul deschis de iniţiere ARN p catalizează formarea primei leg. fosfodiesterice între nucleotidul +1 şi +2 - disociază, iar E-cor continuă sinteza.

Fig. 5.4

Etapele transcripţiei Sinteza decurge în 3 etape: iniţierea, elongarea, terminarea. Iniţierea – începe în anumite secvenţe de ADN numite promotor (P – 40 nucleotide). ARN – polimeraza recunoaşte cu ajutorul sigma Toţi P bacterieni au 2 secvenţe consens situate pe catena codificătoare: Caseta Pribnow 5’ TATAAT 3’ Caseta 35 5’ TTGACA 3’ P la eucariote: GC casete GGGCG CAAT casete CCAAT Caseta Hogness –TATAT/AT Primele 2 sunt responsabile de frecvenţa transcripţiei (când începe), a 3 - - implicată în iniţiere – semnal (unde). Toate sunt responsabile de exacitatea iniţierii Pe P deosebim 2 locusuri: de recunoaştere (depistat cu ajutorul sigmei) şi locusul de legare laxă a ARN polimerazei. Locusul de recunoaştere e situat la o distanţă de 25 nucleotide de locusul de legare şi 10 nucleotide de la punctul de iniţiere (+1)

Sigma subunitatea găseşte punctul de iniţiere şi: Activează identificarea secvenţelor de RNA polimerază Ia parte la desfacerea dublului helix de ADN Ia parte la formarea primei legături fosfosiesterice Astfel complexul de iniţiere este format, sigma subunitatea e disociată de la holoenzimă şi ia parte la iniţierea unui alt ciclu de transcriere.

Elongarea şi Terminarea Elongarea - alunecarea ARN polimerazei pe matrţa de ADN – sinteza transcriptului (50 nucleotide pe secundă) . RNAp nu controlează catena sintetizată – erorile sunt mai multe faţă de replicare. Pe măsură înaintării ARNp are loc desprinderea ARN de la ADN şi refacerea dublului helix Terminarea – RNAp recunoaşte secvenţele nucleotidice specifice de pe ADN, ce conţin un număr mare de G, C . Proteina ρ - se asociază la E şi se mişcă împreună cu ea, însă la identificarea semnalelor de terminare coboară de pe matriţă şi încetineşte acţiunea E,producând transcriptul cu folosirea energiei – ATP

Transcripţia la eucariote RNA p alcătuită din 9-11 subunităţi Folosesc mai multe tipuri de ARN p: ARN polimeraza I – ARNr (18S, 28S, 5,8S; 45S) –în nucleoli; ARN polimeraza II – ARNm; ARN polimeraza III –ARNt şi ARNr (5S) ARN polimeraza IV (mitocondrială)- toate tipurile de ARN mitocondrial P la eucariote: GC casete GGGCG (-90) CAAT casete – 5-GGCCAATCT -3 (-75) Caseta Hogness –TATAT/AT (-35) Primele 2 sunt responsabile de frecvenţa transcripţiei (când începe), a 3 - - implicată în iniţiere – semnal (unde). Toate sunt responsabile de exacitatea iniţierii Secvenţele alcătuite din 10-20 nucleotide “enhancers” şi “silencers” – cresc şi scad respectiv V transcrierii; pot fi situate la distanţe mari de gena transcrisă.

Procesingul Toţi precursorii de ARN în nucleu trec etapa de maturizare posttranscripţională. Pe parcursul procesingului - pre-ARN se transformă în ARN matur. Procesingul înclude: 1. Modificarea fragmentelor terminale 5’ şi 3’ ale ARN: a. “Cap”-area: la capătul 5’ -este adiţionată guanozina metilată (5’- 5’ trifosfat - protejarea mARN de atacul 5’-exonucleazelor şi pentru recunoaşterea de către ribosomi ca semnal de iniţiere); b. la capătul 3’ – se adaugă o secvenţă mare de poli A (200 A -coadă). Ea serveşte la exportul moleculelor de ARN din nucleu în citoplasmă.

Fig. 5.11

2. Splisingul - excizia intronilor şi sudarea exonilor 2.Splisingul - excizia intronilor şi sudarea exonilor. Aşa numitul splising are loc în nucleul celulei. a.ARN nuclear (ARN U) identifică secvenţele de baze la joncţiunea intron – exon, b. se fixează complementar la ele, buclează intronul, astfel apropiind capetele exonilor. c. Are loc scindarea legăturilor fosfodiesterice dintre exoni şi introni, capetele exonilor sunt juxtapuse, apoi sudate de RNA ligazele

Fig. 5.13

e.g., Fig. 5.13

Transcripţia inversă sinteza ADN pe catena de ARN Matriţa – ARN Substrat – dRNTP:dATP, dGTP, dCTP, TTP Enzima – revers transcriptaza Caracteristic viruşilor oncogeni Mecanismul: a. Revers transcriptaza sintetizează pe ARN viral catena de ADN- hibrid: ADN_ARN b. Scindarea ARN viral de o nuclează c. Autoreplicarea ADN – cu formarea unui duplex de ADN

Codul genetic Translaţia Reglarea sintezei proteinei

Obiectivele: Codul genetic. Proprietăţile. Ribozomii - sediul sintezei proteinelor, structura lor. Procesul de translare (sinteza proteinelor). Modificările posttranslaţionare ale proteinelor. Reglarea biosintezei proteinelor. Inducţia şi represia enzimelor. Inhibitorii sintezei proteice. Polimorfismul proteinelor (variantele hemoglobinei, enzimelor, grupelor sanguine). Bolile ereditare şi diagnosticul lor biochimic.

Codul genetic Informaţia genetică referitor la biosinteza proteinelor se transmite cu ajutorul codului genetic - dicţionar ce traduce secvenţa nucleotidelor din ADN în succesiunea AA din lanţul polipeptidic.

Proprietăţile codului genetic Este triplet -64 codoni: 3 nonsens:UAG; UGA; UAA; 61 – codifică AA corespunzători este degenerat - unui AA poate să-i corespunda mai mulţi codoni (Ex. Arg, Leu, Ser - codificate de 6 codoni; Met- şi Trp - un codon). Codonii unui aminoacid sint sinonime. Specificitatea codonului e determinată de primele două litere. Degenerarea se referă la nivelul nucleotidului 3 din codon sau 1 din anticodon care oscileaza. nu este ambiguu- acelaşi triplet nu semnifică 2 AA diferiţi Are o structură liniară (colinear) – o concordanţă liniară între genă şi proteina codificătoare Nu se suprapune (excepţie- viruşii)

Este universal – toate veţuitoarele utilizează acelaşi mecanism de traducere (abatere prezintă codul genetic al mitocondriilor); nu are virgule, semne de punctuatie - ce ar indica începutul şi sfîrşitul fiecarui codon. AUG - este codonul de initiere UAG, UAA,UGA - codoni stop (non sens) Toţi codonii cu U (în pozitia 2) codifica AA hidrofobi codonii cu A în pozitia -2 codifică AA polari Uracilul în poziţia 1 prezintă codonul nonsens dacă în anticodon în directia (5'->3') prima bază nucleotidică e: a) Citozina sau Adenina, el va citi un singur codon; b) Uracilul sau Guanina el va citi 2 codoni; c) inozina - respectiv va citi 3 codoni

Ribozomii Reprezintă sediul de traducere a ARNm şi sinteza proteinelor. Structura- complexe ribonucleoproteice şi sunt formaţi din două subunităţi de mărime inegală (mare şi mică) Structura ribozomilor procariotici: subunitatea 30 S – conţine ARNr 16S şi 21 proteine. subunitatea 50S – ARN r 5S, 23S şi 31 proteine. Sinteza ARNr şi formarea subunităţilor are loc în citoplasmă. Structura ribosomilor eucariotici: subunitatea 40S – ARNr 18S şi 33 proteine. subunitatea 60S – ARN r 5S, 5,8S, 28S şi 49 proteine. ARNr – se formează în nucleol. Ribozomul va avea constanta de sedimentare 70S la procariote si 80S la eucariote. S – este coeficientul de sedimentare Svedberg, care depinde de forma, densitatea şi dimensiunea particulelor.

Centrele catalitice ale ribosomilor Situsul A - aminoacil – responsabil de unirea complexului aminoacil- ARNt Situsul P – peptidil – găzduieşte ARNt legat de un lanţ polipeptidic deja sintetizat Situsul E – e responsabil de eliminarea ARNt Procesul de sinteză proteică poate fi schiţat sumar prin interacţiunea celor 3 tipuri de ARN - informaţia din ARNm este citită in ribozom si transpusă în proteine, AA necesari fiind aduşi de ARNt. În starea complet nedisociată ribozomii sunt activi. Deplasarea lberă a ribozomilor în diferite sectoare ale celulei, sau combinarea lor în diferite locuri cu membranele reticulului endoplasmatic oferă posibilitatea de asamblare a proteinei în celulă.

Mai mulţi ribozomi pot citi simultan acelaş ARN mesager pe care il parcurg in acelaş sens. Se constituie astfel un poliribozom, structură ce permite accelerarea sintezei proteice.

Translaţia Translaţia sau biosinteza proteinelor propriu zisă. Bazele moleculare ale translaţiei: m-RNA ca matriţă genetică, programul căreia determină succesiunea AA în proteină; aminoacil – tRNA; ribozomii ca maşini moleculare pentru unirea succesivă a AA în catena polipeptidică conform programului mRNA; GTP ca sursă de energie; “factorii” proteici care vin în ajutor în diferite etape ale asamblării proteinei în ribozomi; unii ioni ca cofactori (Mg 2+, K+).

Etapele se realizeaza in 5 etape: Activarea AA. Iniţierea lanţului polipeptidic. Elongarea lanţului polipeptidic. Terminarea lanţului polipeptidic si eliberarea acestuia. Prelucrări post traducere ale proteinei sintetizate.

Activarea AA sunt ligazele, care au o specificitate absolută. are loc în citozol Sunt necesare: AA (procariote – Nformil-Met; la eucariote – Met) ARNt ATP, Mg, K E – aminoacil ARNt sintetaza (există nu mai puţin de 20 – indentificate 32 de tipuri de ARNt): Posedă 4 centre: pentru AA, ATP, ARNt, H2O Specificitatea E e determinată de structura ARNt Fidelitatea e asigurată de capacitatea de autocontrol Conţine grupări libere sulfhidrilice sunt ligazele, care au o specificitate absolută.

Activarea AA Se desfăşoară în două etape: ATP PPi 1. NH2-CH-COOH NH2-CH-CO –O-AMP I I R R Aminoacil Adenilat 2. NH2-CH-CO –O-AMP+ARNt NH2-CH-CO –O-RNAt +AMP I I R R Aminoacil RNAt I etapă - AA reacţionează cu ATP rezultând aminoacil-AMP. PP eliberat este hidrolizat şi in acest fel reacţia ireversibilă. II etapă - complexul cedează AA moleculei de ARNt, specifică acelui AA Aminoiacil ARNt sintetaza

Activarea AA Parcurge în 2 etape:

Activarea AA Esenţa procesului de activare este fixarea AA la ARNt propriu acestui AA, în zona acceptorie la 3' CCA –OH (sau 2' OH) al ribozei restului adenilic Enzima poate recunoaste daca un AA gresit s-a fixat pe ARNt, situatie in care il elimina si il inlocuieste cu AA corespunzator deoarece prezinta si un locus hidrolitic.

Activarea AA Activarea AA consumă 2 legături macroergice ARNt pe calea difuziunii simple transferă AA adiţionat la el - la ribozomi, unde are loc asamblarea proteinei din AA.

Translaţia propriu zisă Citirea ARNm se face în direcţia 5‘- 3' iar proteina se sintetizează de la capătul “N”terminal la “C” terminal se desting trei etape: Iniţierea Elongarea terminarea.

Ribosomul cu subunităţile disociate ARNt f-met (Met) GTP, Mg Iniţierea Necesar: ARNm (AUG) Ribosomul cu subunităţile disociate ARNt f-met (Met) GTP, Mg IF1, IF2, IF3 Scopul: formarea complexului de iniţiere

Formarea complexului de iniţiere: Subunitatea mică leagă IF3 şi previne reasocierea ribosomilor La subunitate adiţionează ARNm (AUG) – fixarea codonului e determinat de un fragment de pe ARNm compus din 6-8 resturi de A-G şi este complementar cu succesiunea OH al ARNr La complex adiţionează IF1, mai apoi IF2 legat de GTP şi formil Met-ARNt Îndată cum are loc fixarea anticodonului fMet-ARNt cu codonul AUG (ARNm), are loc hidroliza GTP, eliberarea FI şi unirea subunităţilor Formil Met-ARNt –e fixată în centrul P FI2 GDP Pi GTP FI3 30S AUGCCGGUAAUAAAGGGCCCAGG P 50S A UAC FI1 FMET

Elongarea Necesar: ARNm cu următorul codon ARNt cu următorul AA GTP FE: Tu, Ts, G Elongarea translaţiei include trei etape: Legarea aminoacil – ARNt; Transpeptidarea- formarea legăturii peptidice, Translocarea (deplasarea ARNm cu un codon).

1. Adaptarea (legarea)AA are loc după principiul codon- anticodon în centrul A a. Aminoacil-ARNt se fixează cu Tu+GTP – adiţionează la complexul de iniţiere. b. AA se fixează în centrul A. Simultan are loc hidroliza GTP în GDP şi P Tu-GDP+GTP-Ts------Tu-GTP

2. Transpeptidarea este formarea legăturii peptidice între doi aminoacizi. AA din centrul P sub acţiunea peptidiltransferazei trece în centrul A. Se formează dipeptida În centrul P rămîne ARNt liber

3. Translocarea deplasarea ARNm cu un triplet în direcţia 5‘- 3' . Dipeptida din centrul A trece în centrul P sub acţiunea factorului G (translocazei) şi GTP ARNt din P părăseşte ribosomul

Elongarea GTP GTP UAC CCA GDP P FMET GGC GTP Decurge în 3 etape :1 fixarea noului Aminoacil ARNt complexul: aminoacil-ARNt, factorul de elongare T (FE-T) şi GTP. se fixează pe situsul A, după ce are loc hidroliza GTP la GDP care se eliberează împreună cu FE-T. 2. formarea legăturii peptidice. Enzima peptidil-transferaza catalizează formarea legăturii peptidice între doi AA din situsul A şi P.Peptida rămîne ataşată de RNAt de pe situsul A. translocaţia ribozomul se deplasează la următorul codon de pe ARNm şi peptidil­ARNt trece de pe situsul A pe P această etapă necesită factorul de elongare G (FE-G) şi GTP (necesar pentru realizarea modificărilor conformaţionale care deplasează ribozomul). FE-G GTP 30S AUGCCGGUAAUAAAGGGC P 50S A GTP UAC VAl CCA GDP P FE-T FMET Pro GGC GTP E-PT FE-T

Terminarea are loc cînd sunt întîlniţi codonii UAA, UGA, UAG şi factorii proteici de terminare: R1, R2, S. Nici un tRNA nu se poate lega cu codonii de terminare. Factorii de terminare: eliberează lanţul polipeptidic Elimină ARNt din centrul P Disocierea ribosomului în subunităţile respective

La formarea unei legături peptidice se consumă patru legături macroergice: 2 în etapa de activare a AA (ATP) şi 2 în elongare: legare şi translocare - GTP.

Prelucrările posttraducere Modificarea capătului N- şi C-terminal; capătul N se acetilează; Îndepărtarea secvenţei semnalizante cu ajutorul unei peptidaze; modificarea unor AA: hidroxilarea enzimatică a Pro, Lyz – obţinerea hidroxiprolinei, hidroxilizinei . Metilarea (Lyz în muşchi) Carboxilarea Glu - -carboxil-glutamatului (protrombină) oxidarea reziduuriilor de Cis - cistinei; iodurarea reziduurilor de Tir ale tireoglobulinei. ataşarea unor gr. funcţionale: fosfat, glicozil, metalelor pentru formarea fosfoproteinelor,glicoproteinelor, metaloproteinelor ş.a. Formarea punţilor disulfurice Proteina se autoasamblează – formând conformaţia nativă – structura tridimensională

Inhibitori ai sintezei proteinei la nivelul replicării: Mitomicina –împiedica separarea catenelor de ADN Acid nalidixic –inhiba ADN giraza la nivelul transcriptiei: - Actinomicina D - se fixeaza pe ADN – Rifampicina - inhiba ARN polimeraza

Inhibitorii sintezei proteinei la nivelul translatiei: Streptomicina –inhiba legarea ARNt initiator la subunitatea 30S Cloramfenicol -inhiba peptidil transferaza Tetraciclina - inhiba legarea ARNt la ribozomi Eritromicina,Azitromicina – blocheaza subunitatea 50S Puromicina – blocheaza elongarea inhibând competitiv ARNt Streptomicina - interferă cu legarea formil-Met-ARNt la locul de iniţiere. Neomicina, Kanamicină - erori în reproducerea codului genetic Toxina difterică - inhibă translocaza

Reglarea sintezei proteinelor Sinteza proteinelor nu e constantă – ea trebuie să se adapteze cerinţelor vitale Celulel dispun de 3 tipuri de enzime : Constitutive - se sintetizează în celulă cu o viteză constantă. Inductible - sunt E a căror concentraţie depinde de prezenţa sau absenţa din mediu a unui compus denumit inductor. Sunt implicate în căile catabolice, Represible - sunt E a căror concentraţie depinde de prezenţa sau absenţa din mediu a unui compus denumit corepresor. Sunt implicate în căile anabolice. În mod normal cantitatea de E inductibile în celule este foarte mică,dar ea poate creşte atunci cînd apare necesitatea utilizării substratului E respective ( S care se comportă ca inductor).

Teoria lac-operonului Schema reglării biosintezei proteinei la procariote a fost descrisă în 1961 de către Jacob şi Monod - poartă denumirea de teoria lac-operonului . Modelul e bazat pe studiul reglării mtabolismului lactozei în Escheria coli. Exprimarea GS (conţin informaţia cu privire la biosinteza E impicate în utilizarea lactozei:-galactozidaza, permeaza şi transacetilaza –1,2,3) e controlată de un fragment de ADN denumit genă reglatoare (GR) - codifică represorul (R). R se leagă de un fragment de ADN denumit operator (O). Legarea R la O blochează accesul ARN – polimerazei la promotor avînd ca rezultat suprimarea transcrierii GS.

Ce se întâmplă dacă bacteria dispune simultan de glucoză şi lactoză? Bacteria nu consumă energie pentru sinteza lac-operonului, atâta timp cât dispune de glucoză. Bacteria creşte pe seama glucozei - şi numai atunci când c% acesteea devine minimă începe să utilizeze lactoza. Metabolizarea simultană a glucozei şi lactozei sunt excluse. Cum se comută activitatea bacteriei pe utilizarea lactozei când c% glucozei scade?

Bacteria are ca sursă glucoza

Reglarea sintezei proteinei prin inducţie În prezenţa lactozei: Inductorul (în acest caz lactoza) se leagă specific la R, ca urmare are loc desprinderea acestuia de la operator. În această situaţie, ARN p se leagă la promotor, iniţiind transcrierea GS, adîcă a ARNm care codifică E implicate în catabolismul lactozei.

Bacteria are ca sursă lactoza

În lipsa glucozei se măreşte c% AMPc – ce reprezintă semnalul foamei la bacterii. Ca urmare, AMPc se leagă de o proteină receptoare specifică (proteina activatoare a genei catabolice – CAP) - formează complex (CAP- AMPc), apt să se lege de promotor (p-locus) Acest proces favorizează pătrunderea ARNp în locusul de reglare. Dacă lactoza este prezentă în mediu, operatorul este liber şi ARNp efectuează transcrierea genelor lac. CAP dispune de 2 centre: pentru AMPc şi pentru ADN

Reglarea lac-operonului într-un mediu ce conţine glucoză Cu cât c% glucozei e mai mare, c%AMPc – e mai mică. Lipseşte şi complexul CAP- AMPc. În final ARNp nu se leagă de P şi GS nu sunt transcrise, indiferent dacă există sau nu lactoză, indiferent de faptul dacă operatorul este sau nu ocupat de R.

Ilustrarea mecanismului de reglare a sintezei proteinei prin represie Teoria operonului explică şi represia prin produs final al biosintezei E Ex: sinteza His: la c% mari de His (corepresor) – se leagă de R, modificându-i conformaţia – activându-l – în rezultat favorizează legarea R la O. His – produs final, CoR- sistează transcrierea genelor ce codifică E implicate în propria sa sinteză

Ilustrarea mecanismului de reglare a sintezei proteinei prin represie

REZUMĂM: GR controlează exprimarea anumitor GS prin intermediul unei proteine – R Ra – suprimă sinteza de ARNm, deci de proteine; R inactivat – permite transcrierea GS şi sinteza proteinei E inductibile – Ra – nu are loc transcrierea. Când în mediul apare I – R se inactivează – are loc sinteza ARNm- proteinei E represibile – R este inactiv – are loc transcripţia şi translaţia. Când în mediu se acumulează produsul final al căii anabolice (CoR)- R se activează, formarea complexului R-CoR – şi sistarea transcripţiei şi translaţiei.

Reglarea sintezei la eucariote Atât la nivelul transcripţiei cât şi la nivelul translaţiei Reglarea hormonală (cortizol- sinteza E gluconeogenezei; estrogenii, androgenii, vitamina D – sinteză de proteine specifice) Reglarea exspresiei genetice prin moleculele proteice legate de ADN (histonele) – sinteza ARN pe ADN e inhibată prin adaosul de histone Reglarea proteinei la nivelul translaţiei – e posibilă prin acţiunea factorilor proteici, care contribuie iniţierea, elongarea, terminarea.

Ingineria genetică ştiinta, preocupată de crearea noilor fenotipuri prin transplantarea genei unui organism în genomul altuia în scop de a lichida defectele ereditare ale genomului, adică tratarea afectiunilor ereditare (gena întrodusă nu gurează în patrimoniul ereditar al genomului -gazdă) Se obtin molecule hibride (himerice) În linii marl procedura include etapele: 1. Căpătarea genei 2. Căpătarea ADN-ului recombinat 3.Clonarea ADN-ului recombinat Căpătarea genei:Stiind structura primară a proteinei în laborator se poate obline gena respectivă (se oblin gene pînă la 250 codoane)- mai greu e obtinerea genei din genomul celulei (genele se despart prin introni)- mai uşor e căpătarea genelor din virusuri cu enzima revertaza.

Căpătarea ADN-ului recombinat- gena necesară se întroduce în celulă pentru a se integra cu genomul acestuia. Pentru aceastaîn vitro gena se uneşte cu ADN-vector(plasmide ce conţin ADN inelar (cîteva gene). De regulă se foloseşte E Coli, ce contine un cromozom şi plasmide, ce plutesc în citozol (plasmida este de 1000 ori mai mica decît cromozomul). Plasmidele se replica independent de replicarea materialului genetic. Unele plasmide se pot include în cromozom şi apoi din nou să-l părăsească. Plasmidele pot trece dintr-o celulă în alta în procesul deconjugare. Plasmidele se separă din E.Coli şi li se înlătură o parte de ADN inelar cu ajutorulenzimelor restrictaze, care recunosc şi taiediferite sectoare. Folosind restrictaze diferite se poate de tăiat ADN în locusurile necesare. Inrezultat se formează capete lipicioase (sectoaremonocatenare, capabile de a uni nucleotide complimentare. La fel se procedează şi cu gena,care trebuie întrodusă (se formează capete lipicioase complimentare capetelor plasmidei). Dacă se amestecă gena şi plasmida ele se vor uni cu capetele lipicioase. Enzima ligaza va uni capetele şi se va căpăta molecula ADN inelara, care contine gena menită pentru transplantare.

3.Clonarea ADN-ului recombinat- obtinerea cantităţilor dorite de proteină codificată de gena eucariotă întrodusă în plasmid. Dacă în cultura E.Coli se întroduc plasmide recombinate, se formează bacterii recombinate. In celulă plasmidele se replică. Bacteriile înmulţindu-se formează celule, care conţin aceste plasmide. Acum din masa bacteriană se poate de capatat cantităti sufuciente de ADN recombine

Ranadamentul sintezei bacteriene. este impresionabil: Ex- 100 celule E Ranadamentul sintezei bacteriene este impresionabil: Ex- 100 celule E.Coli produc prin clonare 5 mg somatostatină (cantitate, ce se obţine prin prelucrarea a 100 tone de creier de bovine). Prin tehnica ingineriei genetice s-au obtinut cantităţi mari de insulinâ (Humulună), Interferon, vaccine. Diversitatea formelor în Iimita uneia şi aceaşi specie se datoreşte mutaţiilor şi într-o măsura mai mare recombinării genetice.

Mutaţiile. Modificările genomului organismului, care se păstrează şi se transmit prin ereditate se transmit apoi de la o generaţie la alta. Modificările pot interesa o pereche de baze (mutatii punctiforme) sau un grup de baze pe una sau pe ambele catene ale unei molecule de DNA.

Mutatiile punctiforme: pot decurge prin: l. substitutie (misens mutatii, unde deosebim 2 tipuri): a. Tranzitie - o BA purinică este înlocuită tot cu una purincă, una pirimidinică -tot cu una pirimidinică. b.Transversie - o pereche de baze purinice este înlocuită cu una pirimidinică sau invers. 2. Inserţie - acest mecanism constă în întroducerea unei perechi de baze suplimentare în catena de DNA. 3. Deleţia constă în excluderea unei perechi de baze în aşa mod ca ea nu mai poate fî complementară şi la replicare apare "golul" în ambele catene. Unele modificări în secventa nucleotidică pot duce la formarea codonului sinonim şi succesiunea aminoacizilor nu se va schimba (mutatii benigne). La afectarea segmentelor mari de genă apar mutatii întinse. In dependentă de consecinţele modificărilor deosebim mutaţie benignă, neutră, nocivă. Agenţii mutageni pot provoca mutaţiile spontane cît şi mutaţiile induse.

Anticorpii sunt constituiti din:- 2 lanturi polipeptidice grele identice (H­446 AA) Anticorpii sunt şi două uşoare (L-214AA), fiecare dintre ele contin cite o porţiune: varîabilă „V". şi una constantă „C"

Secvenţa de AA în porţiunea variabilă este diferită pentru fiecare anticorp. Lanţurile sunt unite între ele prin legături disulfidice. Genele ce corespund porţiunilor „V" şi „C“ ale unui anumit tip de lanţ uşor sunt foarte apropiate în ADN al imunocitelor care produc acest tip de lanţ uşor, dar se găsesc departe una de alta în ADN al celulelor ce produc alte tipuride anticorpi. De aici reiese, că în imunocit se selectează un anumit segment de ADN, ce codifică porţiunea variabilă a unui anumit lant uşor, care se transferă prin transpoziţie în vecinătatea secvenţei codificatoare a porţiunii constante a lantului uşor. Deci ADN ce codifică sectoarele „V" ale lanţurilor „H" şi "L" constă din cîteva gene de tip diferit care-şi pot schimba locurile proprii şi asocia cu formarea imenselor combinaţii.

Sinteza Anticorpilor Fiecare dintre milioanele de anticorpi produşi leagă unul dintre milioanele de antigene posibile. Este greu de crezut că organismul are în patrimoniul său genetic cîte o genă pentru fiecare anticorp pe care-l produce întrucât aceasta ar presupune o supradimensionare a genomului eucariot.

Gradul de diversificare în obţinerea lanţurilor „H" şi „L" este crescut prin faptul că o porţiune variabilă este rezultatul asamblării a 3 regiuni. Deci ADN ce determină porţiunea variabilă a anticorpului este constituită din: Porţiunea variabilă (V) constituită din - 400 de gene. Porţiunea de diversitate (D) ce cuprinde -12 gene Portiunea de articulare sau jonciune ţ(J) - 4 gene Asamblarea acestor gene în diferite combinaţii permite construirea a 20000 de sectoare V - fapt ce asigură extrema varietate a anticorpilor.