DIAGNOSTICUL DE LABORATOR PRIN METODE IMUNOLOGICE

Definitii IMUNITATE = rezistenta = modalitate de aparare fata de variati agenti patogeni IMUNITATE SPECIFICA vs IMUNITATE NESPECIFICA Apararea adaptativa raspunde inalt specific unui anumit agent patogen, intalnirea repetata cu acesta ducand la imbunatatirea raspunsului  specificitate  memorie ANTIGEN (Ag)- substanta endogena sau exogena capabila sa induca un raspuns imun care consta in stimularea si proliferarea limfocitelor si in sinteza unor molecule de recunoastere – anticorpi (Ac) sau receptori celulari ce se combina specific in vivo sau in vitro cu Ag declansator. DETERMINANT ANTIGENIC = EPITOP – parte a Ag ce reactioneaza specific cu Ac sau cu R T-celular

ANTICORPI MONOCLONALI – Ac inalt specifici pt un singur epitop ANTICORP (Ac) - proteina sintetizata ca parte a raspunsului imun la o substanta straina (Ag) si care se leaga specific la Ag ANTICORPI MONOCLONALI – Ac inalt specifici pt un singur epitop aplicatii diagnostice: determinare toxine E coli, Shigella, Clostridium difficile, identificare hormoni, grupe ABO, etc. aplicatii terapeutice: multiple (ex:Ac anti-IgE) SERURI POLICLONALE – seruri ce contin Ac generati de raspunsul la un Ag care este obisnuit un mozaic de determinanti antigenici REACTIA AG-AC: reactia intre epitop (Ag) si paratop (Ac) realizata prin legaturi electrostatice, hidrofobe, de hidrogen si Van der Waals guvernata de legea masei: antigenul liber [Ag] si anticorpii liberi [Ac] interactioneaza reversibil pentru a forma complexe [Ag-Ac] relatia intre antigenul liber si cel legat in complexe cu anticorpi este determinata de constanta de echilibru sau de afinitate Ka care este egala cu raportul intre constantele de asociere K1 si disociere K2 conform formulei: [Ag] + [Ac] K1↔K2 [Ag-Ac] Ka = K1/K2 = [Ag-Ac]/ [Ag] [Ac]

ANTIGENE CELULARE CU IMPORTANTA IMUNOLOGICA HLA – ag de histocompatibilitate = proteine Ag de suprafata prezente pe suprafata celulelor nucleate ce provoaca un raspuns imun daca sunt transferate unui individ genetic diferit (transplant) AUTOANTIGENE – situatie in care proteinele-self nu mai sunt recunoscuta ce proprii AG DE GRUP SANGUIN

Tipuri de reactii imunologice in vitro In functie de modul de evidentiere a rezultatului: CITIRE DIRECTA IMUNOMARCARE: fluorocrom – imunofluorescenta izotopi – dozare radioimunologica enzime – dozare imunoenzimatica In functie de rezultatul final cuantificat: Reactiile primare – teste de evidentiere a recunoasterii specifice a Ag de catre Ac. Teste cantitative includ imunofluorescenta, RIA, alte metode imunoenzimatice. In general aceste metode necesita fie antigen purificat, fie marcarea cu radioizotopi, fluorescenta sau enzimatica a anticorpului, sau implica o metoda de separare a complexelor Ag-Ac de Ag, Ac liberi din solutie. Reactiile secundare – includ reactiile de precipitare in solutie sau gel, aglutinarea directa sau hemaglutinarea si fixarea complementului. Reactiile tertiare – includ opsonizarea, fagocitoza, chemotaxia, aderenta imuna, degradarea celulara.

Factori ce influenteaza masurarea reactiilor antigen-anticorp sunt: afinitatea – cu cat este mai mare afinitatea anticorpului pentru antigen, cu atat este mai stabila reactia; aviditatea – reactia intre antigene multivalente si anticorpi multivalenti este mult mai stabila si mai usor de detectat; raportul Ag-Ac - marimea complexelor Ag-Ac este corelata cu concentratia de Ag si de Ac; forma fizica a Ag – un Ag particulat va fi depistat prin reactii de aglutinare, un Ag solubil va fi depistat prin reactii de precipitare. Reactiile Ag-Ac sunt specifice si reversibile. Reversibilitatea: complexul Ag-Ac poate fi disociat de caldura, acidifierea mediului (pH<3) sau aportul de ioni in cantitate mare. Specificitatea: Ag este capacitatea acestuia de a reactiona specific numai cu receptorii solubili (Ac) sau membranari a caror productie a fost indusa de stimulul antigenic. Cunoasterea unuia dintre reactanti (Ag sau Ac ) permite identificarea celuilalt.

Afinitatea este intensitatea reactiei intre un singur determinant antigenic si un singur situs combinativ al unui anticorp. Este rezultatul sumei intre toate fortele de atractie si de respingere ce exista intre determinantul antigenic si situsul combinativ.   Aviditatea este termenul utilizat pentru descrierea intensitatii legaturilor in totalitate intre un antigen cu multiplii determinanti antigenici si anticorpi multivalenti. Deci afinitatea se refera la intensitatea legaturii intre un determinant antigenic si un situs combinativ al unui anticorp, in timp ce aviditatea se refera in general la intensitatea legaturilor intre antigene si anticorpi multivalenti.

Crossreactivitatea se refera la capacitatea unor anticorpi de a se combina cu mai mult de un determinant antigenic sau la capacitatea unei populatii de anticorpi de a reactiona cu mai mult de un antigen. Crossreactivitatea apare deoarece antigenul crossreactiv are epitopi comuni cu antigenul imunizant sau pentru ca are epitopi cu structura asemanatoare unui antigen imunizant (plurispecificitate).

Reactii de aglutinare Aglutinare = aglomerare de particule (Er, bacterii, latex) = reactie imunochimica specifica de agregare a unor particule acoperite de Ac sau Ag aglutinina este folosit pentru a descrie anticorpii care aglutineaza antigenele particulate, non-solubile Anticorpii completi sunt cei de tip IgM care se leaga la determinantii antigenici ca pentamer si induc aglutinarea acestor antigene. Anticorpii incompleti sunt de tip IgG, se leaga la determinanti antigenici dar nu pot determina aglutinarea. Cand Ag utilizat este un eritrocit vorbim despre hemaglutinare Toti Ac pot teoretic aglutina Ag, cei mai eficienti sunt cei de tip IgM, pt IgG este necesar un adjuvant de tipul albuminei in reactie, al carui rol este sa reduca distanta intre celulele rosii, permitand anticorpilor de tip IgG sa lege punti intre celule

Aglutinarea = rezultatul formarii unei retele de Ag si Ac intr-un numar suficient de mare care sa permita vizualizarea cu ochiul liber. Reactiile de aglutinare sunt sensibile, pot detecta cantitati mici de Ac. Nu sunt metode cantitative, procedand insa la efectuarea de dilutii, se poate realiza dozarea semicantitativa. Hemaglutinare – particulele implicate sunt Er, aglutininele se numesc hemaglutinine Leucoaglutinare – particulele aglutinate sunt leucocite

Clasificare: Teste directe sau active – particulele de reactie sunt purtatoare ale Ag specific (hematii, leucocite, trombocite, bacterii, etc). Teste indirecte sau pasive – particule de reactie incarcate cu un determinant Ag artificial fixat pe suprafata particulei (hematii, particule latex, microcristale de colesterol).

Aglutinarea directa particulele purtatoare ale determinantului Ag sunt puse in contact cu Ac specifici in mediu lichid salin. Ac se combina cu Ag si formeaza o retea de aglutinare. Reactia se poate desfasura in tuburi de reactie sau pe placi de sticla sau de opalin. Aplicatii practice ale aglutinarii directe sunt: o Determinarea grupelor sanguine o Identificarea aglutininelor la rece o Diagnosticul mononucleozei infectioase o Diagnosticul salmonelozei

Aglutinarea indirecta Ag solubil este fixat pe particule variabile, suspensia de particule este pusa in contact cu serul de cercetat la fel ca in cazul aglutinarii directe. Aplicatii practice: o Diagnosticul sifilisului – Ag cardiolipinic fixat pe microcristale de colesterol in suspensie coloidala – reactie pe lama. o Diagnosticul sifilisului prin testul de hemaglutinare a Treponemei pallidum (TPHA) – Ag treponemic este fixat pe hematii o Diagnosticul tiroiditei autoimune- Ac anti-tiroglobulina: tiroglobulina este fixata pe hematii o Identificare factor reumatoid – IgG sau IgM modificati; reactia Waaler-Rose sau latex-aglutinarea

Aglutinarea artificiala – consta in utilizarea unui artificiu tehnic pt a provoca aglutinarea (cel mai adesea directa) a Ag particulate, de catre Ac ce nu pot aglutina spontan. o Utilizarea de medii macromoleculare – albumina bovina, ser uman sau dextran. o Incubarea hematiilor cu enzime proteolitice o Adaugarea unei antiglobuline – test Coombs Aglutinarea inversa – identificare antigene si nu anticorpi – Ac specifici sunt fixati pe hematii.

Hemaglutinarea pasiva Testul de aglutinare lucreaza numai cu Ag particulate. Cu toate acestea, este posibila acoperirea Er cu un Ag solubil (ex: viral, polizaharid, haptena) si apoi sa se foloseasca Er acoperite de Ag solubil pentru a testa/determina prezenta de Ac specifici, anti-antigen solubil (vezi figura de mai jos). Acest test se numeste hemaglutinare pasiva, se lucreaza exact ca testele de aglutinare. Este util pentru detectia Ac anti-Ag solubile si pt detectia Ac anti-virali.

Aglutinarea cu latex Ac sunt atasati pe suport de latex ce serveste ca marker pentru detectarea reactiei Ag-Ac. Fiecare particula de latex cu dimensiune de aproximativ 1 micron, poate fi incarcata cu mii de molecule de Ac. Particulele de latex-Ac formeaza o suspensie laptoasa si in contact cu proba de cercetat ce contine antigenul cautat, se formeaza agregate vizibile de complexe Ag-Ac. Figura de mai jos ilustreaza evenimentele asociate reactiei de aglutinare asociate cu particulele de latex. In laboratoarele clinice testul este folosit pentru detectarea de Ag microbiene solubile direct in ser sau lichidul cefalorahidian sau pentru identificarea unor Ag bacteriene din culturi.

Testul antiglobulinic – testul Coomb’s Testul Coomb’s direct – Ac ce se leaga la Er nu determina intotdeauna aglutinare datorita excesului de Ag sau de Ac sau in cazul modificarilor electrice la nivelul Er ce impiedica reactiile de legare. Acesti Ac care se leaga la Er dar nu determina aglutinare se numesc Ac incompleti – definitie functionala si nu una care sa sugereze structura diferita a Ac. Pt a fi detectati Ac non-aglutinanti de pe suprafata Er se adauga un al doilea Ac indreptat impotriva Ac de pe Er. Ac anti-imunoglobulina poate cross-linka Er si determina aglutinarea = test Coomb’s direct.

2. Testul Coomb’s indirect – detecteaza prezenta de Ac antir-Er prezenti in ser. Presupune incubarea Er cu probe de ser, spalarea lor pt indepartarea Ac nelegati si apoi adaugarea unui al doilea Ac anti-imunoglobulina care va depista Ac legati pe suprafata Er si va cross-linka celulele

Inhibitia hemaglutinarii Testul de aglutinare poate fi modificat pt a fi folosit la masurarea Ag solubile. este numit test de inhibitie a hemaglutinarii – masoara capacitatea unui Ag solubil de a inhiba aglutinarea unor Er acoperite cu Ag, de catre Ac. o cantitate fixa de Ac fata de un Ag este amestecata cu o cantitate fixa de Er acoperite cu Ag. se adauga cantitati variabile din serul de cercetat care este investigat pt detectarea prezentei Ag. daca proba contine Ag, Ag solubil va competitiona cu Ag de pe suprafata Er impiedicand aglutinarea. Prin dilutii seriate se masoara cantitatea de Ag in proba necunoscuta prin titrare. Cuantifica in general Ag solubile. Metoda este larg utilizata in clinica pentru a determina daca un pacient a fost expus la o anumita infectie virala (ex: rubeola) sau nu sau pentru teste de sarcina (HCG, Ac anti HCG).

Tipizarea grupelor sanguine Grupele sanguine sunt definite de prezenta Ag de grup, A, B AB la nivelul Er Reactivii pt tipizare contin Ac anti-A si B Mixare sange grup necunoscut cu ser Ac cunoscut  identificare prin reactie de aglutinare = tipizare sanguina directa 2 ml sange recoltat pe anticoagulant, testare imediata sau pastrare la 2-8 grade Interpretare rezultate: Aglutinare=reactie Ag-Ac Aglutinare cu serul antiA = grup A Aglutinare cu ser antiB = grup B Aglutinare cu ambele = grup AB Lipsa aglutinare = gup 0

Aglomerare vizibila secundar formarii cx Ag-Ac prin interactiunea cu un Ag particulat cum ar fi particulele de latex Depinde de crosslinkarea Ac polivalenti tip aglutinina (IgM) -asigura o modalitate de detectare a unor variate Ag bacteriene folosind Ac tipici -test de rutina pt tipizarea sangelui inainte de transfuzie + (control) Demonstrarea hemaglutinarii folosind Ac anti Er oaie

-Test de sarcina clasic: inhibitia hemaglutinarii - hapten inhibition – determina prezenta sau absenta beta-HCG (human chorionic gonadotropin) - Actual – test Elisa - De asemenea de folos pt depistare substante ilegale in sange, Ac antivirali (ex: rubeola)

FIXAREA COMPLEMENTULUI: Testul de fixare a C’ (CFT) introdus in 1909 de catre Wasserman, a fost extensiv folosit in diagnosticul sifilisului Complementul - proteina prezenta in mod normal in ser Proteinele complement sunt termolabile, sunt distruse prin incalzire la 56°C pt 20 – 30 min Complementul se leaga la complexele Ag-Ac Cand Ag este un Er, acesta va fi lizat Ag Y Patient’s serum No Ag

Principiu Complementul este absorbit pe suprafata complexului Ag-Ac – proprietate folosita in testul de fixare a complementului bpt identificarea unui Ac specific Sistemul hemolitic continand Er oaie si Ac corespunzatori este folosit ca martor pentru utilizarea si disponibilitatea complementului Daca se fixeaza complementul atunci Er oaie nu vor fi lizate = test pozitiv Daca exista complement disponibil atunci apare hemoliza ce denota test negativ

Componente CFT Sistemul de analizat Antigen: solubil sau particulat Anticorpi: serul uman de cercetat, poate sa aiba sau nu Ac cautati Complement: ser obtinut de la porcusori de Guinea Sistemul indicator (Sistem hemolitic) Eritrocite: de oaie Receptor: Ac iepure anti-Er oaie preparati prin inocularea Er de oaie la iepure dupa un protocol standardizat de imunizare

Test pozitiv 37°C Etapa 1: Etapa 2: Antigen + Anticorp + Complement se fixeaza complementul (din ser) 1 ora Etapa 2: Sistemul Ag-Ac-C + sistemul hemolitic(Er-Ac anti Er) absenta hemolizei = TEST POZITIV

Test NEGATIV 37°C Etapa 1: Etapa 2: Antigen + Anticorp + Complement NU se fixeaza complementul (ABSENT in ser) 1 ora Etapa 2: Sistemul Ag-Ac-C + sistemul hemolitic(Er-Ac anti Er) hemoliza prezenta = TEST NEGATIV

Rezultate si interpretare: Hemoliza absenta= test pozitiv Hemoliza a Er = test negativ 1 2 3 4 A B Hemoliza placa microtitrare (godeu A3, A4 si B4) si non-hemoliza (godeu A1, 2, B1,2 3)

Reactiile de precipitare se folosesc pentru a masura concentratii de Ac sau Ag Precipitarea implica interactiunea antigenelor solubile cu anticorpii in proportie corecta, rezultatul fiind obtinerea unui precipitat vizibil Antigenele solubile = solutii de molecule de natura proteica sau carbohidrati Anticorpii care agrega Ag solubile se numesc precipitine, pot sa fie monoclonali sau policlonali Reactiile de precipitare se pot desfasura in: mediu lichid (turbidimetrie, nefelometrie) solid (imunodifuzie radiala, imunoelectroforeza).

Reactii de precipitare in solutie Mixarea Ac si Ag in forma solubila in eprubeta poate evolua in doua directii: Raman in forma solubila Formeaza precipitat Prin adaugarea de cantitati crescande de Ag la o cantitate fixa de Ac se construieste curba de precipitare Heidelberger care poate fi impartita in trei zone: exces Ac - complexe solubile Ac-Ag zona de echivalenta - complexe insolubile Ag-Ac, precipitat Exces de Ag – complexe solubile

PRECIPITARE IN MEDIU LICHID Testul inelului – metoda simpla de evidentiere a reactiei Ag-Ac intr-un tub, prin punerea in contact a unei solutii de Ag cu imunoserul corespunzator. La interfata apare in cateva minute un inel sau un disc albicios ce corespunde precipitatului Ag-Ac.

Reactia Heidelberger si Kendall – posibilitate de cuantificare a reactiei Ag-Ac prin interactiunea in mai multe tuburi de reactie a unei cantitati constante de Ac cu concentratii crescute de Ag intr-un volum dat. Apare precipitat, posibil inca din primele tuburi, creste cantitatea de precipitat in tuburile urmatoare pt ca apoi sa se reduca in conditiile excesului de Ag (zone Ag-Ac). Turbidimetria- Un Ag este plasat intr-o cuva si interactioneaza cu Ac corespunzator aflat in exces. Se formeaza complexe solubile ce tulbura proba de cercetat. Se masoara fotometric formarea de complexe Nefelometria – are acelasi principiu ca si turbidimetria, ca metoda de cuantificare a rezultatului se foloseste insa o lumina laser ce va fi reflectata de complexele Ag-Ac si preluata/ focusata de niste lentile speciale intr-un fotometru . Concentratia de Ag din proba studiata este determinate cu ajutorul unor curbe standard. Necesita aparatura mai complicata, este insa de folos in determinarea in medii biologice a moleculelor de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgE), fractiuni de complement C1q, C3, C4, etc.

PRECIPITARE IN MEDIU SOLID Imunodifuzia radiala Mancini – o cantitate constanta de Ac este incorporata omogen in gel de agar inainte de solidificarea gelului si in godeuri facute in gel se plaseaza dilutii de Ag. Pe masura ce Ag difuzeaza in gel, reactioneaza cu Ac si cand se atinge punctul de echivalenta apare un inel de precipitare Diametrul inelului este proportional cu logaritmul concentratiei de Ag din moment ce concentratia de Ac este constanta. Daca apare mai mult de un inel inseamna ca au aparut mai multe reactii Ag-Ac. Acest lucru se intampla cand se lucreaza cu o mixtura de Ac si de Ag de folos in determinarea IgG, IgA, IgM, fractiuni de complement C3, alfa-1-antitripsina, etc.

Imunodifuzia radiala dubla Ouchterlony – in cadrul acestei metode Ag este plasat intr-un godeu, Ac monospecific in alt godeu, difuzeaza unul catre celalalt in gel de agar si apar arce de precipitare vizibile la locul de intalnire. Aceasta metoda calitativa permite analizarea sistemului Ag-Ac gratie reactiei de identitate. foloseste pentru evidentierea proteinei C reactive, proteinelor Bence-Jones, beta-2-microglobulina, alfa-fetoproteina, produsi de degradare a fibrinogenului rezultatele sunt exprimate semicantitativ: +, ++, +++.

Aspecte ale precipitarii: Reactia de identitate – daca doua Ag sunt identice sau au epitopi asemanatori, liniile lor de precipitare cu Ac vor avea continuitate. Reactia de nonidentitate – 2 Ag diferite ce se combina cu 2 Ac, arcele de precipitare se intersecteaza Reactia de identitate partiala – daca cele doua Ag au un epitop comun si un epitop specific doar uneia dintre antigene, se va forma un arc de cerc continuu si va aparea atasat un brat secundar epitopului diferit.

Regiunea de echivalenta reprezentare shematica imunodifuzie radiala si dubla reactiile de precipitare in gel determina aparitia de linii de precipitare vizibile fara precipitate vizibile in regiunea de exces Ag sau Ac in mediu semisolid ce contine Ac Regiunea de echivalenta -> Aria este proportionala cu conc. Ag.

Imunoelectroforeza – o mixtura complexa de Ag este plasata in godeuri in gel de agar si prin electroforeza Ag sunt separate pe seama incarcaturii lor electrice. dupa electroforeza sunt efectuate santuri in gel si se adauga Ac. Pe masura ce Ac difuzeaza in gel, apar arce de precipitare la zona de echivalenta. analiza cantitativa a mixturilor complexe de Ag, analiza componentelor din serul pacientului comparand serul pacientului cu serul normal, se poate identifica deficienta uneia sau mai multor componente serice in proba de cercetat. Se folosesc imunoseruri de origine animala specific pentru proteina din serul uman. tehnica permite analizarea proteinelor urinare sau a lichidului cefalorahidian. este o metoda calitativa, se poate constata aparitia sau nu a precipitarii in raport cu un martor.

Imunoelectroforeza.

Electroforeza contracurent (elctroimunodifuzia) – Ag este plasat in godeuri de agar, sunt supuse electroforezei atat Ag cat si Ac si apare linie de precipitare ca in figura de mai jos. Acest test poate fi utilizat numai daca Ac si Ag au incarcatura electrica opusa. Este un test calitativ desi se poate aprecia si cantitatea prin aprecierea grosimii benzii de precipitare. Avantajul sau major este rapiditatea testului.

Imunoelectroforeza in racheta electroforeza in gel ce contine anticorpi – Ag migreaza electroforetic catre anod prin gelul continator de Ac si apare precipitare sub forma de racheta ce poate fi vizualizata prin colorare. aceasta metoda permite cuantificarea unui Ag prin comparatia cu o proba standard.

Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) – RIA sunt metode bazate pe masurarea radioactivitatii generate de complexele Ag-Ac. Marcarea se face fie la nivelul Ag fie la Ac. Testele ELISA sunt cele bazate pe masurarea unei reactii enzimatice asociate cu formarea complexelor Ag-Ac. O reactie pozitiva duce la aparitia unui produs colorat ce poate fi masurat spectrofotometric. Se folosesc doua alternative de reactie: directa si indirecta. In metoda directa, proba de cercetat este adaugata peste placa in care sunt fixati Ac monoclonali in faza solida, se spala dupa incubare si este inlaturat materialul nelegat. un Ac secundar marcat reactioneaza cu Ag-ul legat de primul Ac. In metoda indirecta se adauga un Ac anti-Ag de cercetat si un al treilea Ac marcat enzimatic interactioneaza cu Ac secundar (Sandwich ELISA). La final se adauga substratul enzimei, atat in metoda directa cat si in cazul celei indirecte. Cantitatea de produs colorat final reprezinta echivalentul cantitatii de Ag prezent in proba clinica.

Radioimmuno Assay metoda sensibila de masurare hormoni, droguri, vitamine,etc la conc.<0.001 ㎍/㎖ principiu: legare competitiva a unui Ag radiomarcat si a unui Ag nemarcat la o cantitate limitata de Ac de inalta afinitate A solid-phase radioimmunoassay (RIA) to detect hepatitis B virus in blood samples & A standard curve to determine the conc. of HBsAg in unknown serum.

to detect Ab (HIV, HCV) ELISA to detect Ag Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to RIA except using an Enzyme (alkaline ⓟ, horseradish peroxidase, & β-galactosidase) : safer & less costly. to detect Ab (HIV, HCV) to detect Ag ELISA

Immunoblotting Western Blot – separare fractiuni proteice conform greutatii lor moleculare prin electroforeza in sistem sodium dodecil sulfat – gel poliacrilamida (SD-PAGE). Proteinele sunt apoi transferate si imobilizate pe o membrane de nitroceluloza unde pot sa fie identificate prin folosirea unui Ac specific. Unul din avantajele metodei este acela de a identifica un Ac specific dupa separarea proteinelor.

: separates the components according to their molecular weight. Western blotting : separates the components according to their molecular weight. : the proteins in the gel are transferred to the sheet of nitrocellulose or nylon by the passage of an electric current. : probed with Ab & then radiolabeled or enzyme-linked 2nd Ab. : a position is visualized by means of an ELISA reaction. FIGURE 6-12

Sensitivity of various immunoassays