Απομόνωση και Tαυτοποίηση Ανοσοποιητικού Συστήματος Άσκηση 3 Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος Ρ. Τσιτσιλώνη Κ. Ιωάννου, Π. Σαμαρά

κοινό αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (μυελός των οστών) Έμμορφα στοιχεία του αίματος μυελική σειρά κοινό αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (μυελός των οστών) μονοβλαστική σειρά λεμφική σειρά

Προέλευση εμμόρφων στοιχείων του αίματος Θύμος ?

Απομόνωση μονοπύρηνων αίματος Επιστίβαση πλάσμα PBMC Ficoll-Paque

Μέτρηση μονοπύρηνων αίματος Ανάμειξη PBMC με Trypan blue

Αιμοκυτταρομέτρο (πλάκα Neubauer) (1/5x1/5x1/10) 1x1x1/10

Προέλευση εμμόρφων στοιχείων του αίματος ?

Mορφολογία μακροφάγων

Φαγοκυτταρική ικανότητα μακροφάγων Σινική μελάνη

Δ1: Απομόνωση λεμφοκυττάρων Σε γυάλινο σωληνάριο βάζουμε: 3 ml Ficoll-Paque Επιστιβάζουμε προσεκτικά 4 ml αίματος αραιωμένου 1:1 με διάλυμα αλάτων Φυγοκέντρηση: 1800 στροφές, 20 λεπτά Αφαιρούμε προσεκτικά το πλάσμα με πιπέττα Pasteur (πετάμε) Συλλέγουμε τη στιβάδα των λεμφοκυττάρων με την ίδια Pasteur Μεταφέρουμε τα λεμφοκύτταρα σε πλαστικό σωληνάριο Προσθέτουμε 5 ml διάλυμα αλάτων Φυγοκέντρηση: 1400 στροφές, 10 λεπτά (ξέπλυμα Ficoll) Διαλυτοποιούμε προσεκτικά το ίζημα των λεμφοκυττάρων Επαναιωρούμε σε 1 ml διαλύματος αλάτων

Δ2: Προσδιορισμός νεκρών-ζωντανών λεμφοκ. Στο γυάλινο σωληνάριο (λεμφοκύτταρα) αναμειγνύουμε: 0,45 ml εναιωρήματος λεμφοκυττάρων 0,05 ml χρωστικής Trypan blue (γραφείο) Τοποθετούμε μικρό δείγμα σε πλάκα Neubauer (και στις δύο θέσεις μέτρησης) Στις περιοχές μέτρησης λευκοκυττάρων (τουλάχιστον σε 2/4): μετρούμε τα ζωντανά λεμφοκύτταρα (άχρωμα) μετρούμε τα νεκρά λεμφοκύτταρα (βαμμένα μπλε)

Δ3: Φαγοκυτταρική ικανότητα μακροφάγων περιτοναϊκής κοιλότητας Θα απομονώσουμε μακροφάγα: Ενίουμε 10 ml φυσιολογικού ορού στην περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού Αναρρόφηση υγρού, συλλογή σε γυάλινο σωληνάκι Φυγοκέντρηση: 1300 rpm για 5 min Επαναδιάλυση σε 0,5-1 ml φυσιολογικό ορό και μέτρηση Θα προσθέσουμε σε αντικειμενοφόρο πλάκα: 1 σταγόνα εναιωρήματος μακροφάγων στο κέντρο 1 σταγόνα διαλύματος σινικής μελάνης, ανάδευση Παρατήρηση στο μικροσκόπιο-εστίαση σε ένα πεδίο-παρατήρηση ανά 15 min Χρόνος χρωματισμού μακροφάγου ~ 1-5 sec Χρόνος αποχρωματισμού μακροφάγου ???

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (Ι) Δ1: αριθμός λεμφοκυττάρων ανά mm3 και ανά ml αρχικού αίματος για την ομάδα σας θεωρητικός υπολογισμός αναλυτικά Δ2: αριθμός ζωντανών λεμφοκυττάρων αριθμός νεκρών λεμφοκυττάρων % αναλογία ζωντανών-νεκρών για την ομάδα σας Δ3: σχεδιασμός μακροφάγου πριν και μετά τη χορήγηση χρωστικής χρόνος αποχρωματισμού για την ομάδα σας

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙ) Για το φυλλάδιό σας Άσκηση: Πόσα λεμφοκύτταρα θα έπρεπε θεωρητικά να έχετε μετρήσει στο ένα τετράγωνο (0,1 mm3) της πλάκας Neubauer? Λεμφοκύτταρα ανά mm3 και ανά ml αρχικού αίματος όπως τα μετρήσατε στο δείγμα σας % αναλογία ζωντανών και νεκρών λεμφοκυττάρων στο δείγμα σας Σχεδιασμός μακροφάγου πριν και μετά τη χορήγηση σινικής μελάνης 5. Χρόνος αποχρωματισμού (ή ποσοστό περίπου) του μακροφάγου

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙΙ) Θεωρητική άσκηση: Έχω 4 ml αίμα προβάτου αραιωμένου 1:1 με διάλυμα αλάτων Διαχωρίζω επιστοιβάζοντας σε 3 ml Ficoll-Paque Ξεπλένω (φυγοκέντρηση) με 5 ml διάλυμα αλάτων Επαναιωρώ σε 1 ml διάλυμα αλάτων Παίρνω 0,45 ml εναιώρημα λεμφοκυττάρων + 50 μl χρωστικής Trypan blue Mετρώ σε 1 πλευρικό τετράγωνο (0,1 mm3) της Neubauer Αν δεν έχω απώλειες, πόσα λεμφοκύτταρα θα μετρήσω ???? Ξέρουμε ότι: το πρόβατο έχει 12.000 WBC / mm3 το 40 % από τα WBC είναι λεμφοκύτταρα