Αρχες Βιοτεχνολογίας Τροφίμων

Παρουσίαση με θέμα: "Αρχες Βιοτεχνολογίας Τροφίμων"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Αρχες Βιοτεχνολογίας Τροφίμων
Εργαστήριο Αρχες Βιοτεχνολογίας Τροφίμων

2 Σκοπός του εργαστηρίου
Η κάθε ομάδα εχει τη δική της υγρή καλλιέργεια μιας ζύμης, μετά από 3 μέρες επώαση και μετράει : γλυκόζη, πρωτεΐνη, Άζωτο

3 Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος
Γλυκόζη 40g/l Yeast extract 2g/l Peptone 2g/l (NH4)2SO4 4g/l KH2PO4 Na2HPO4

4 Υδρόφοβο βαμβάκι καλυμμένο με αλουμινόχαρτο
Σε κωνική φιάλη των 250ml βάζουμε 5Oml από το υγρό θρεπτικό και αποστειρώνουμε Υγρή αποστείρωση 121οC 20min Σε αερόβιες καλλιέργειες ο όγκος του θρεπτικού δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1/3 του όγκου της φιάλης Υδρόφοβο βαμβάκι καλυμμένο με αλουμινόχαρτο

5 Υγρή αποστείρωση (αυτόκαυστο)

6 Επώαση στους 30οC με ανάδευση170rpm

7 Παραλαβή δείγματος 1.5 ml υγρό καλλιέργειας μεταφερεται σε eppendrof και φυγοκεντρείται

8 Το δείγμα φυγοκεντρείται στις 9000rpm, 10min, 5oC
Α Α Β Β Μετά τη φυγοκέντρηση διαχωρίζουμε τις δύο φάσεις Α) το υπερκείμενο δε περιέχει κύτταρα ή κομμάτια τους και θα χρησιμοποιηθεί για μετρήσεις γλυκόζης, πρωτεϊνης κλπ Β) το ίζημα περιέχει τα κύτταρα τις καλλιέργειας (ζωντανά, νεκρά, ολόκληρα ή σπασμένα)

9 Προσδιορισμός συγκέντρωσης γλυκόζης με τη Μέθοδο προσδιορισμού αναγωγικών σακχάρων δινιτροσαλυκιλικού οξέος (DNS) Υδατάνθρακες οι οποίοι λέγονται και αναγωγικά σάκχαρα (ή ανάγοντα σάκχαρα). Τέτοια είναι όσα στην δομή τους περιέχουν αλδεϋδομάδα ή α-υδρόξυ-κετοομάδα. Η μέθοδος στηρίζεται στην αναγωγή του 3,5 δι-νιτροσαλικυλικού οξέος προς 3-αμινο-5-νιτροσαλικυλικό οξύ, παρουσία NaOH και την ταυτόχρονη οξείδωση της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ (Miller, 1959).

10 0.5ml δείγμα + 0.5ml DNS (ανάδευση) 100oC, 5min + 5 ml dH2O (ανάδευση)
Mέτρηση απορρόφησης στα 540nm

11 Πρότυπη καμπύλη γλυκόζης
Glc (g/l) A540 0,2 0,132 0,4 0,268 1 0,661 Α540 Glc (g/L)

12 Μέθοδος προσδιορισμού αζώτου αμινοξέων
FAN (Free Amino Nitrogen)

13 FAN (Free Amino Nitrogen) Διαδικασία:
1 ml Δείγμα + 0,5 ml διάλυμα νινυδρίνης 100oC 16min κρυώνουμε μεχρι θερμοκρασία δωματίου 2.5ml διάλυμα αραίωσης (DR) Α570

14 Υπολογισμός συγκέντρωσης Ν αμινομάδων
Γλυκίνη Το δείγμα σας είναι αραιωμένο τόσες φορές όσες και ο αριθμός της ομάδας σας FAN =A570 x D x2 / As570 FAN (mg/L) D= Συντελεστής αραίωσης 2 = συγκέντρωση πρότυπου Διαλ. Γλυκίνης (mg/l) Αs570 = Απορρόφηση πρότυπου διαλ. Γλυκίνης

15 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ BRADFORD

16 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ BRADFORD
0.8ml δείγματος + 0.2ml Διαλύματος Coomassie Brilliant Blue G-250 Ανάδευση (vortex) 5 min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) Μέτρηση απορρόφησης στα 595nm A595 = * μg BSA

17 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης
Πρωτεϊνη μg BSA A595 1 0.055 2 0.126 4 0.252 5 0.296 10 0.553 15 0.745 20 0.972 Αραιώστε το δείγμα σας 1/3 (δηλ. 1ml δειγμα και 2 ml H2O) και μετρήστε σε αυτό την πρωτεϊνη (< 20μg) Υπολογίστε την συγέντρωση του δειγματό σας (πριν την αραίωση) σε mg/l