ΓΗΡΑΝΣΗ – ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗ – ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ Δημήτριος Ι. Στραβοπόδης, M.Sc., Ph.D. Επίκουρος Καθηγητής, Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ Αθήνα, 2008

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Επιβίωση ατόμων (θεμελιώδης αρχή εξέλιξης) Αναπαραγωγή & μεγάλωμα νεογνών Διαδικασία γήρανσης (ageing) Αργή μείωση φυσιολογικών ρυθμών Προοδευτική απώλεια λειτουργικότητας οργανισμού Μειωμένη γονιμότητα Αυξημένη ευπάθεια στη πλειονότητα των ασθενειών Σημαντική θνησιμότητα ΠΑΡΑΤΗΡΕΙΤΑΙ ΣΕ: Όλα τα ζώα κατά την ενηλικίωση που αποκτούν ορισμένο μέγεθος Όλα τα μέλη ενός είδους, μετά την αναπαραγωγική ηλικία Όλα τα ζώα σε κατάσταση αιχμαλωσίας Τεχνητή κατάσταση λόγω βιοϊατρικής επανάστασης: ποτέ δεν θα έφταναν σε ηλικία γήρατος

ΒΙΟΓΕΡΟΝΤΟΛΟΓΙΑ Μελέτη μηχανισμών γήρανσης ΓΗΡΙΑΤΡΙΚΗ Μελέτη ασθενειών γήρατος: καρκίνος, καρδιαγγειακές νόσοι ΓΗΡΑΣ: Στοχαστική (ενδεχομένως) διαδικασία – σε αντίθεση με την ανάπτυξη Σημαντική ετερογένεια Ανακριβής προσδιορισμός χρονικής εξέλιξης φαινοτύπου γήρανσης Γενετικό υπόβαθρο Συσσώρευση επιγενετικών επιδράσεων περιβάλλοντος Συσσώρευση γενετικής αστάθειας Στρες ΜΟΝΟΔΙΑΣΤΑΤΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Νόσος Alzheimer ΤΜΗΜΑΤΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΠΡΩΪΜΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ

Εμφάνιση μεγάλου αριθμού μεταλλαγών Αύξηση αστάθειας γονιδιώματος Μεταβολές μεταβολισμού λιπών & σακχάρων ΣΥΝΔΡΟΜΟ Werner Ομοζυγωτία μιας μεταλλαγμένης ελικάσης της οικογένειας RecQ (Werner protein) Δράση εξωνουκλεάσης (5’-3’ & 3’-5’) Συμμετοχή σε: αντιγραφή, μεταγραφή, επιδιόρθωση & ανασυνδυασμό DNA Κύτταρα φορέων (ήδη από την 3η δεκαετία): Συσσώρευση σωματικών μεταλλαγών / Δερματική ατροφία Μειωμένη γονιμότητα / Τοπική ατροφία υποδόριων ιστών Μεταβολές στη φωνή / γκριζάρισμα μαλλιών 4η δεκαετία: καταρράκτης / αρτηριοσκλήρυνση / καρκίνος / οστεοπόρωση Τενοντίτιδες / διαβήτης τύπου ΙΙ / έμφραγμα μυοκαρδίου (47-48 ετών)

ΓΗΡΑΝΣΗ: Εξωκυττάριου περιβάλλοντος Μιτωτικών κυττάρων ινοβλάστες Δερματικοί Ινοβλάστες Ώριμοι Νευρώνες ΓΗΡΑΝΣΗ: Εξωκυττάριου περιβάλλοντος Μιτωτικών κυττάρων ινοβλάστες Μετα-μιτωτικών κυττάρων νευρώνες

ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ Αριθμός απογόνων Απόκριση στο οξειδωτικό στρες Απόκριση σε ορμονικά ερεθίσματα Ενεργότητα ογκο-κατασταλτικών γονιδίων Ενεργότητα γονιδίων μακροβιότητας Ενεργότητα τελομεράσης Μήκος (μείωση) τελομερών χρωμοσωμάτων Έκθεση σε οξύ στρες Χρόνια έκθεση σε στρες ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ Βιοψία δέρματος: Δερματικοί ινοβλάστες ~ 50 κύκλοι διαίρεσης (population doubling: PD) Βιώσιμη αναστολή κυτταρικού κύκλου Αριθμός κυτταρικών διαιρέσεων (άσχετη από τον ημερολογιακό χρόνο καλλιέργειας)

ANAΔΙΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΗ (ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗ) ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ: ΑΚΓ (Replicative Senescence) Μορφολογικές / Φυσιολογικές / Βιοχημικές / Μοριακές Αλλαγές Μεταβολικά ενεργά κύτταρα Αλλαγή κυτταρικού σχήματος από ατρακτοειδές σε πεπλατυσμένο Μόνιμη αναστολή κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 (Διακριτή από τη G0 φάση εφησύχανσης του κυτταρικού κύκλου [quiescent cells]) Μόνιμη απώλεια σύνθεσης DNA Μείωση μιτοχονδριακής λειτουργίας Αυξημένη οξείδωση Αλλαγές στη σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας Αντοχή στην επαγωγή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [απόπτωσης] Αλλοίωση του μεταγραφικού προφίλ έκφρασης διαφορετικών γονιδίων ΜΕΙΩΣΗ ΤΟΥ ΜΗΚΟΥΣ ΤΩΝ ΤΕΛΟΜΕΡΩΝ ΑΚΓ: ινοβλάστες / μεσοθηλιακά / Τ / Κερατινοκύτταρα / Επιθηλιακά / Γλοίας / Αμφιβληστροειδικού χρωμοφόρου επιθηλίου

ΕΞΑΝΤΛΗΣΗ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ Μείωση μήκους τελομερών Απουσία ενεργότητας τελομεράσης σταθεροποίηση μήκους τελομερών ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ (ΚΓ: cellular senescence) Μη-επιδιορθώσιμη αλλοίωση DNA Μεταβολές στη δομή της χρωματίνης Ογκογόνα / μιτογόνα σήματα Υπερ-έκφραση ογκοκατασταλτικών γονιδίων Τελική διαφοροποίηση Χρόνιο / οξύ στρες Συσσώρευση βλαβών στο πυρηνικό / μιτοχονδριακό DNA ΚΓ ~ ΑΚΓ (στρες) [ΑΚΓ: μοντέλο γενετικής βάσης της γήρανσης] ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗ ΕΝΖΥΜΟΥ SA-β-γαλακτοσιδάση (pH: 6.0) / ΙΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ

ΚΓ: ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ Καθορισμός αριθμού κυτταρικών διαιρέσεων Επιθεώρηση ακεραιότητας χρωμοσωμάτων Μείωση μήκους τελομερών Ελάττωση ενεργότητας τελομεράσης ΕΞΩΓΕΝΗΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ Ανεξάρτητος μήκους τελομερών Ρύθμιση από «στρες» / εξωγενείς παράγοντες Επαγωγή ενεργότητας ογκοκατασταλτικών γονιδίων: p53, CdkIs ΚΓ: p53 – p21Cip1 & p16INK4a: αναστολή Rb-φωσφορυλίωση ΚΓ: οξειδωτκό στρες: ελεύθερες ρίζες – RΟS – μεταβολικά παράγωγα μοριακού Ο2 / Μιτοχόνδρια: κατανάλωση Ο2 / αντιμετώπιση ROS Αντιμετώπιση ROS (αντιοξειδωτικά συστήματα): ΚΑΤΑΛΑΣΗ

ΥΠΟΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ROS ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΙΚΗ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΚΗ ΔΙΣΜΟΥΤΑΣΗ (Superoxide Dismutase: SOD) SOD: κατάλυση υπεροξειδικών ανιόντων σε Η2Ο2 & τελική παραγωγή Η2Ο μέσω ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ & ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΙΚΗΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΥΠΟΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ROS Απομάκρυνση οξειδωμένων πρωτεϊνών μέσω: Πρωτεασώματος Eιδικών πρωτεασών του μιτοχονδρίου Κυτταροπλασματικών καλπαϊνών Λυσοσωμικών ενζύμων Πρόκληση κυτταρικού θανάτου – απόπτωσης

Κύτταρα τρωκτικών: ενεργή τελομεράση (ΚΓ: εξωγενής μηχανισμός)

ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗ – ΟΡΙΟ HAYFLICK Μείωση μήκους ανθρώπινων τελομερών: Αύξηση αριθμού κυτταρικών διαιρέσεων Αύξηση ηλικίας δότη ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΑΚΓ: μόνιμη αναστολή αύξησης Μη πλήρης αντιγραφή χρωμοσωμικών άκρων ΟΡΙΟ HAYFLICK (Leonard Hayflick) ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ (ΑΚΓ) Μετά από πεπερασμένο αριθμό κυτταρικών διαιρέσεων ΜΕΙΩΣΗ ΜΗΚΟΥΣ ΤΕΛΟΜΕΡΩΝ / ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΙΡΕΣΗ: Δομή ανθρώπινων χρωμοσωμάτων Απουσία ενεργότητας τελομεράσης Πρόβλημα αντιγραφής τελομερικών άκρων από τις συμβατικές πολυμεράσες Σωματικά κύτταρα: 4-7 Kb, Εμβρυϊκά κύτταρα: 15-20 Kb (μήκος τελομερούς)

Άκρα: τελομερή (εξειδικευμένες δομές) Χρωμοσώματα Γραμμικό DNA Άκρα: τελομερή (εξειδικευμένες δομές) [ΤΤΑGGG]n: σειριακή επανάληψη (χιλιάδες φορές) εξαμερούς ακολουθίας ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΕΛΟΜΕΡΟΥΣ TRF1 (τελομερικός παράγοντας πρόσδεσης 1) TRF2 (τελομερικός παράγοντας πρόσδεσης 2) TIN2 (TRF1 αλληλεπιδρούσα πυρηνική πρωτεΐνη 2) Tankyrase hRap Ku ετεροδιμερές Προστασία από: ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ / ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟ / ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗ ΣΥΝΤΗΞΗ / Υποστήριξη αντίληψης για ΜΗ-ΣΠΑΣΙΜΟ DNA (π.χ. Χ-, γ-ακτινοβολία): ΑΠΟΦΥΓΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΑΥΞΗΣΗΣ & ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΚΟΝΤΑ ΤΕΛΟΜΕΡΗ: ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΥΞΗΣΗΣ: Άγνωστος Μηχανισμός

ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ ΤΕΛΟΜΕΡΙΚΩΝ ΑΚΡΩΝ Χρήση κοινών πολυμερασών Αδυναμία διπλασιασμού άκρων γραμμικών μορίων DNA Αρχικοί RNA εκκινητές DNA pol III Κομμάτια Okazaki Απομάκρυνση RNA εκκινητή (εξωνουκλεολυτική δράση DNA pol I) Πολυμερισμός μέσω DNA pol I Σύνδεση με λιγάση ΑΚΡΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΟΣ Αδυναμία πολυμερισμού υδρολυμένου RNA ακραίου τμήματος Okazaki Μετά από κάθε S-phase: αδυναμία διπλασιασμού μιας μικρής τελικής περιοχής τελομερούς Ανθρώπινοι δερματικοί ινοβλάστες: ΑΠΩΛΕΙΑ 50-100 bp/divison AΝΘΡΩΠΙΝΑ ΣΩΜΑΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ: ΑΠΟΥΣΙΑ ΕΝΕΡΓΟΥ ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗΣ

DNA polymerase switching and processing of an Okazaki fragment on the lagging strand. (A) as the DNA helicase promotes unwinding at the replication fork, DNA pol delta with RFC and PCNA synthesizes DNA on the leading strand. DNA pol alpha initiates synthesis on the lagging strand by generating an RNA primer (red segment) followed by a short segment of DNA. Then, RFC and PCNA load a second DNA polymerase (delta or epsilon) to continue synthesis of the Okazaki fragment. (B) as DNA pol delta approaches the downstream Okazaki fragment, cleavage by RNase H1 removes the initiator RNA primer leaving a single 5'-ribonucleotide. Then, FEN1/RTH1 removes the 5'-ribonucleotide. The resulting nick is sealed by DNA ligase. From:R. A. Bambara, R. S. Murante, and L. A. Henricksen (1997) Enzymes and reactions at the eukaryotic DNA replication fork. J. Biol. Chem. 272: 4647-4650.

ΑΘΑΝΑΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΡΩΚΤΙΚΩΝ Σχετικά υψηλή συχνότητα λόγω ενεργού τελομεράσης ΑΘΑΝΑΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Δεν έχει αναφερθεί τυχαία αθανατοποίηση λόγω απουσίας δράσης τελομεράσης Απαίτηση σταθεροποίησης (αύξησης) μήκους τελομερών Ενεργοποίηση ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗΣ Ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο: RNP Χαρακτηριστικά ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΑΣΗΣ Συνθέτει τις -TTAGGG- επαναλήψεις (ΤΕΛΟΜΕΡΙΚΟ DNA) ΧΡΗΣΗ RNA ΩΣ ΜΗΤΡΑ-ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ Διατήρηση σταθερού μήκους χρωμοσωμάτων RNP-ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗ hTERT: πρωτεϊνικό καταλυτικό τμήμα (telomere reverse transcriptase) hTR: RNA μήτρα (για την επιμήκυνση τελομερικού DNA)

ΡΥΘΜΙΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗΣ Μεταγραφικός έλεγχος γονιδίου hTERT (καταλυτικής υπομονάδας) hTERT mRNA: ελάχιστα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα ΠΛΗΡΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗΣ (ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα) (ακόμα και σε αυτά ανιχνεύεται σταδιακή μείωση μήκους τελομερών) Κύτταρα Γενετικής Σειράς (15-20 Kb) Διαιρέσεις ζυγωτού με πλήρους μήκους τελομερή Πρώιμα βλαστοκύτταρα & πρώιμα εμβρυϊκά κύτταρα (15-20 Kb) Θυλακοκύτταρα τριχών Διεγερμένα λεμφοκύτταρα Μικρή ενεργότητα και σε άλλους ιστούς Πλειονότητα καρκινικών κυττάρων (με λίγες εξαιρέσεις): φάρμακα αναστολής ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ: Σύνδρομα πρόωρου γήρατος / Βιολογικού ρολογιού Υπεραιωνόβιοι άνθρωποι / ευ-ζην / μηχανισμοί γήρατος / αντιμετώπιση καρκίνου

MHXANIΣΜΟΣ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΑΚΡΟΥ ΤΕΛΟΜΕΡΟΥΣ hTR-RNA αναγνώριση & σύνδεση στο 3΄-εξαμερές τελομερικό άκρο hTERT (αντίστροφη μεταγραφάση) χρησιμοποιεί το hTR ως καλούπι-υπόστρωμα για την προσθήκη των 6 βάσεων διαδοχικά TP1: πρόσδεση στην τελομεράση / άγνωστη λειτουργία TRF1: Σύνδεση στο ds-DNA Ρύθμιση μήκους τελομερούς Έλεγχος πρόσβασης τελομεράσης στο τελομερικό άκρο TRF2: Σταθεροποίηση άκρου Αποτροπή συγκόλλησης τελομερικών άκρων TBPA / TBPB: πρόσδεση σε ss-DNA Σταθεροποίηση 3΄-προεξέχοντος άκρου Ρύθμιση ενεργότητας τελομεράσης

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΚΛΩΝΟΙ Πανομοιότυπο γενετικό υλικό Μη-φυλετική αναπαραγωγή Πιστά αντίγραφα (φυτά) Τεχνητός ή φυσικός διαχωρισμός εμβρύου: 2-cell stage Μονοζυγωτικά δίδυμα Αρχικό ζυγωτό (προϊόν φυλετικής αναπαραγωγής): Προσφορά γενετικού υλικού & κυτταροπλασματικών καθοριστών ΤΕΧΝΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΠΥΡΗΝΑ (αφυλετική διαδικασία) ΚΑΡΥΟΠΛΑΣΤΗΣ (Κύτταρο-Δότης) Διπλοειδής πυρήνας (πυρηνικό γενετικό υλικό) ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΤΗΣ (Κύτταρο-Δέκτης) Καταστροφή ή αφαίρεση γενετικού υλικού Ώριμο ή μη-γονιμοποιημένο ωοκύτταρο

ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΤΗΣ ΙΔΙΟΥ ΑΤΟΜΟΥ: ΚΛΩΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΥ ΑΤΟΜΟΥ: ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΑΝΤΙΓΡΑΦΟ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΟΤΕΣ (για δημιουργία βιώσιμων εμβρύων): Νεαρά έμβρυα (σχετικά αδιαφοροποίητα κύτταρα) Σωματικά κύτταρα ώριμων ατόμων Αναπτυξιακή Πλαστικότητα ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΥΡΗΝΑ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΣΩΜΑΤΙΚΟΥ (ΔΙΠΛΟΕΙΔΟΥΣ) ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΣΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ ΩΡΙΜΟΥ ΩΟΚΥΤΤΑΡΟΥ («αποπυρηνομένου») Αλλαγές χρωματινικής δομής Επαναπρογραμματισμός γενετικού προγράμματος Επανακαθοδήγηση αναπτυξιακού προγράμματος εμβρύου

ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 1800: Wilhelm Roux Έμβρυο αμφιβίου 2-κυττάρων Καυτή βελόνα: θάνατος 1/2 κυττάρων: ανάπτυξη μόνο του ενός ήμισυ τμήματος Hans Driesch Έμβρυο αχινού Διαχωρισμός των 2 κυττάρων του εμβρύου (2-cell stage) Mορφολογικά φυσιολογικά έμβρυα Μικρότερο μέγεθος 1900: παρόμοιες παρατηρήσεις σε βάτραχο & σαλαμάνδρα ΟΛΟΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ: έκφραση όλης της γενετικής πληροφορίας ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ: δημιουργία αρκετών κυτταρικών φαινοτύπων ΜΟΝΟΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ: σχηματισμός ενός μόνο ιστικού τύπου 1920: Hans Spemann: κλωνοποίηση μέσω ωαρίων σαλαμάνδρας 1952: Briggs-King: απύρηνα ωάρια βατράχου: κλώνοι γυρίνων (δότης: μετα-βλαστοκυστικό εμβρυϊκό στάδιο) 1962: John Gurdon: βάτραχους (επιθήλιο εντέρου) & γυρίνους (κύτταρα δέρματος)

Αμφισβήτηση λόγω «μόλυνσης» με πρώιμα γενετικά κύτταρα (εντερική διέλευση) 1982: McGrath-Solter: δημιουργία ποντικών μέσω μεταφοράς πυρήνα ζυγωτού σε «από-πυρηνομένο» ωάριο 1986: Dean Willadsen: κλωνοποίηση προβάτου: έμβρυα 8-16 κυττάρων (πυρήνες): απαρχή κλωνοποίησης θηλαστικών ΠΥΡΗΝΑΣ ΕΜΒΡΥΪΚΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ (πρώιμο γαστρίδιο): ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΠΥΡΗΝΑ ΩΟΚΥΤΤΑΡΟΥ: ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ: ΟΛΟΔΥΝΑΜΟΣ ΠΥΡΗΝΑΣ ΑΔΥΝΑΜΙΑ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΠΥΡΗΝΩΝ ΝΑ ΕΚΦΡΑΣΟΥΝ ΟΛΟ ΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΤΟΥΣ ΥΛΙΚΟ Δεν διαθέτουν όλο το γενετικό πρόγραμμα του είδους Διαθέτουν όλο το γενετικό πρόγραμμα, αλλά δεν μπορεί να επαναπρογραμματισθεί 1997: Ιan Wilmut (Roslin Institute, Scotland, UK): Dolly: κλωνοποιημένο πρόβατο: μαστικά σωματικά κύτταρα ενήλικου προβάτου Φαινόμενο πρώιμης γήρανσης (ευθανασία 2003) ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ: Βοειδή, κατσίκες, γουρούνια, κουνέλια, γάτες

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΥΡΗΝΑ ΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Πυρήνες σωματικών κυττάρων Περιέχουν τις αρχικές πληροφορίες του γενετικού υλικού του ζυγωτού Επαναπρογραμματισμός του γενετικού υλικού του κυττάρου δότη Πολυδύναμα βλαστοκύτταρα ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΥΡΗΝΑ ΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΩΑΡΙΟ (αφαίρεση γενετικού υλικού): Μη-γονιμοποιημένο Γονιμοποιημένο-ενεργοποιημένο ΦΑΣΗΣ ΜΕΙΩΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΦΑΣΗΣ ΙΙ Εντόπιση συμπυκνωμένων χρωμοσωμάτων: ΕΠΑΝΩ ΑΠΟ ΤΗ ΘΕΣΗ ΤΟΥ ΠΟΛΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΙΟΥ (ως οδηγός) ΑΦΑΙΡΕΣΗ ME EIΔΙΚΕΣ ΜΙΚΡΟ-ΠΙΠΕΤΕΣ & ΜΙΚΡΟΧΕΙΡΙΣΤΗ: Αποπυρήνωση ωαρίου Σύντηξη κυττάρου ΔΟΤΗ με ΩΑΡΙΟ: (μεταφορά γενετικού υλικού στο ωάριο) Χρήση Ιών Εφαρμογή Ηλεκτρικού Πεδίου (Roslin Institute): ρεύμα σταθερού V & I: υπό γωνία στον άξονα επαφής / σε συνεργασία με Ca2+, ~ φυσιολογική γονιμοποίηση-ενεργοποίηση

TRANSGENIC TECHNOLOGY

Institute Roslin: Κλωνοποίηση Προβάτων Γονιμοποιημένο Ωάριο Αφαίρεση προ-πυρήνων (μητρικής & πατρικής προέλευσης) Σύντηξη με κύτταρο Δότη ΠΑΡΑΜΟΝΗ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΓΙΑ ΑΡΧΙΚΕΣ ΔΙΑΙΡΕΣΕΙΣ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ στη μήτρα θετής μητέρας (στάδιο-βλαστοκύστης) Institute Roslin: Κλωνοποίηση Προβάτων Κύτταρα βλαστοκύστης (9 ημερών): δημιουργία εμβρυϊκών κυττάρων με μορφολογία επιθηλιακών Απομόνωση πυρήνων: σχηματισμός κάποιων εμβρύων / απουσία πλήρους ανάπτυξης Ian Wilmut: Ανάπτυξη αυτών των κυττάρων ΑΠΟΥΣΙΑ ΟΡΟΥ από το μέσο καλλιέργειας Μετάπτωση κυττάρων σε φάση G0: γενικευμένη αδράνεια Τεχνική Μεταφοράς Πυρήνα: Megan & Morag (2 αρνάκια): φυσιολογική ανάπτυξη Αμφισβήτηση, λόγω πιθανής «μόλυνσης» με πολυδύναμα βλαστοκύτταρα ΠΟΛΛΑΠΛΟΙ ΚΛΩΝΟΙ ΑΠΟ ΕΜΒΡΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ (G0) Dolly: ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΑΣΤΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ (G0: εξάχρονη προβατίνα): 1ος ΚΛΩΝΟΣ ΘΗΛΑΣΤΙΚΟΥ ΑΠΟ ΣΩΜΑΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ-ΔΟΤΕΣ

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΟΝΤΙΚΩΝ 2000: Teruhiko Wakayama: κλωνοποίηση ποντικών: > 100 κλώνους / 6 γενεές κλώνων ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΟΝΤΙΚΩΝ Ωάρια δέκτη (μετάφαση 2ης μειωτικής διαίρεσης) Αφαίρεση χρωμοσωμάτων-ατράκτου (μικροπιπέτα) Πυρήνας σωματικού κυττάρου-δότη Ένεση πυρήνα στο ωάριο-δέκτη (εντός 5΄) Ενεργοποίηση ωαρίων σε μέσο καλλιέργειας παρουσία Sr2+: αύξηση [Ca2+] ωοκυττάρου Εμφύτευση σε θετή μητέρα: επιβίωση και ανάπτυξη εμβρύου ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΜΒΡΥΩΝ ΜΕΣΩ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ 1-4%: ποσοστό ανάπτυξης ωαρίου-κλώνου μέχρι τη γέννηση Αναποτελεσματικότητα τεχνικών κλωνοποίησης Συσσώρευση βλαβών στο αναπτυσσόμενο έμβρυο (Α). ΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ-ΔΟΤΗ: ΒΑΘΜΟΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ Υψηλή διαφοροποίηση: χαμηλή επιβίωση 22% (2-cells), 14% (4-cells), 8% (8-cells), 2-11% (πολυδύναμα βλαστοκύτταρα), 1-3% (σωματικά κύτταρα ενήλικα) / αδυναμία κλωνοποίησης από νευρικά κύτταρα ποντικού

(Β). ΦΑΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΩΑΡΙΟΥ & ΚΥΤΤΑΡΟΥ-ΔΟΤΗ Συμβατές & συγχρονισμένες Αποφυγή λανθασμένης «πλοϊδίας» γενετικού υλικού Καταστροφή DNA μέσω ασυντόνιστου διπλασιασμού Διατήρηση «πλοϊδίας» (ωάρια μειωτικής μετάφασης ΙΙ): Διπλασιασμένο DNA (πυρήνας κυττάρου-δότη): πρώιμη G1 ή G0 ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ Dolly: G0 πυρήνας δότη Μειωμένη μεταγραφική δραστηριότητα: απομάκρυνση μεταγραφικών παραγόντων από το DNA Σχετικά συμπυκνωμένη χρωματίνη Μέση G1 έως μέση G2 φάση: Μεταγραφικά ενεργά χρωμοσώματα: εσωτερικό πυρήνα «Σιωπηλά» χρωμοσώματα: προσκολλημένα στην πυρηνική μεμβράνη Όψιμη G2, Μίτωση & πρώιμη G1: DNA διασκορπισμένο σε όλο τον πυρήνα: προσπελάσιμο από μεταγραφικούς παράγοντες & λειτουργικά στοιχεία ανάπτυξης ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΚΛΩΝΩΝ: Κύτταρα-δότες όψιμης G2 ή Μετάφασης Μίτωσης ή γηρασμένα κύτταρα

(Γ). ΧΗΜΙΚΑ ΜΕΣΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ (Δ). ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΗ-ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΩΑΡΙΟΥ ΜΕΤΑ ΤΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΑ ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ-ΔΟΤΗ Ενεργοποίηση ωοκυττάρου: Χημικά μέσα > ηλεκτρικό ρεύμα (Ε). ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΕΜΒΡΥΟΥ Έμβρυα-κλώνοι: In vitro καλλιέργεια (7d για βοοειδή) Ικανοποιητική ανάπτυξη: εμφύτευση μήτρας θετής μητέρας Χορήγηση ορμονών: συμπτώματα ψευδοεγκυμοσύνης ΠΑΡΑΤΕΤΑΜΕΝΗ in vitro ΑΝΑΠΤΥΞΗ: Υψηλό ποσοστό αποβολών Μεγάλα ποσοστά θνησιμότητας (εντός του 1ου 24ώρου postnatal): αναπτυξιακές ανωμαλίες: αναπνευστικές & καρδιαγγειακές διαταραχές / δομικές αλλοιώσεις του εγκεφάλου Επιγενετικές αλλαγές (μεθυλίωση-ακετυλίωση) του κυττάρου-δότη: δεν κληρονομούνται στην επόμενη γενιά κλώνων: π.χ. απόγονοι Dolly (φυσιολογικοί), αυξημένο βάρος κλώνων-ποντικών (χαρακτηρίζει την 1η γενιά & δεν κληρονομείται στις επόμενες)

ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΟΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ – ΔΙΛΗΜΜΑΤΑ Εισαγωγή επιθυμητών γενετικών χαρακτηριστικών σε οργανισμούς οικονομικής σημασίας: ΓΑΛΑ ΜΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ (σε εξέλιξη) ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΟΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ Μικροένεση διαγονιδίου στο στάδιο του ζυγωτού Εμφύτευση στη θετή μητέρα 5 μήνες αναμονή για έλεγχο κλώνου (πρόβατα) Επιπλέον έλεγχος για έκφραση πρωτεΐνης Χαμηλά ποσοστά επιτυχίας Εισαγωγή ενός ΜΟΝΟ γονιδίου ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΜΩΣΑΪΚΙΣΜΟΥ (γονιδιωματική ενσωμάτωση ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟΥ στο στάδιο 2-4 κυττάρων) ΑΠΑΙΤΗΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟΥ ΣΤΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΕΙΡΑ ΤΕΧΝΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΠΥΡΗΝΑ: ΟΛΟΙ ΟΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΕΙΝΑΙ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΟΙ Δυσκολίες ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΤΗ να επαναπρογραμματίσει & συντονίσει τον σωματικό πυρήνα του ΚΑΡΥΟΠΛΑΣΤΗ Κατανόηση φαινομένων: ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ, ΓΗΡΑΝΣΗΣ & ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ

Είναι ηθικά & κοινωνικά αποδεκτή η κλωνοποίηση ανθρώπων; Κλωνοποιημένα βοοειδή από ΓΗΡΑΣΜΕΝΑ κύτταρα ΔΕΝ εμφάνισαν συμπτώματα πρόωρης γήρανσης ΔΕΝ ΥΠΑΡΧΕΙ ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΠΡΟΩΡΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ ΤΩΝ ΚΛΩΝΩΝ Επαναδιαφοροποίηση σωματικών κυτταρικών τύπων Δυνατότητα απομάκρυνσης ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ (εκφυλιστικές ασθένειες) Είναι ηθικά & κοινωνικά αποδεκτή η κλωνοποίηση ανθρώπων; Ατέρμονες και ατελείωτες συζητήσεις & στρογγυλές τράπεζες & ειδικές ημερίδες Εξαγγελίες ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΘΕΑΝΘΡΩΠΟΥ από δείγματα αίματος της «σινδόνης» ΔΕΝ ΛΥΝΕΙ per se, ΑΛΛΑ ΔΗΜΙΟΥΡΓΕΙ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ: Ηθικά Κοινωνικά Νομικά Καθοριστικός ρόλος «επιγενετικών» & «περιβαλλοντικών» επιδράσεων στην τελική διαμόρφωση & χαρακτήρα του ατόμου ΑΔΥΝΑΜΙΑ ΚΛΩΝΟΥ ΓΙΑ «ΚΑΤ΄ ΕΙΚΟΝΑ & ΟΜΟΙΩΣΗ» ΤΟΥ ΔΟΤΗ (περιβάλλον ανάπτυξης, παιδεία, εμπειρίες, κ.λπ.)

Animal Cloning Transgenic.MOVVideo Clip 1 2007

Animal Cloning Video Clip 2 2007