ΔΟΚΟΥΣΛΗ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ ΑΕΜ: 5358 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Πρακτική εργασία «Έλεγχος ετεροζυγωτίας β Μεσογειακής αναιμίας και αιμοσφαρινοπαθειών» ΔΟΚΟΥΣΛΗ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ ΑΕΜ: 5358

Μεσογειακή αναιμία Ομάδα κληρονομικών παθήσεων, που κληρονομούνται με τον αυτοσωματικό υπολειπόμενο τρόπο. Τα κύρια χαρακτηριστικά των νοσημάτων αυτών είναι βαριά αναιμία που οφείλεται στην παραγωγή παθολογικής αιμοσφαιρίνης. Έχουν χαρακτηριστεί με τον όρο Μεσογειακά νοσήματα λόγω της αυξημένης συχνότητας εμφάνισης στις χώρες της Μεσογείου. Η συχνότητα της β Μεσογειακής αναιμίας στην Ελλάδα αγγίζει το 8%. Η έγκαιρη αναγνώριση των ετερόζυγων ατόμων της Μεσογειακής αναιμίας έχει μεγάλη σημασία γιατί είναι ο μόνος τρόπος που μπορεί να προλάβει την γέννηση παιδιών με την μείζον μορφή της νόσου.

Στόχος εργασίας : Είναι η μελέτη της διάγνωσης ετερόζυγων ατόμων της Μεσογειακής αναιμίας καθώς και του καθορισμού των κριτηρίων και της διεξαγωγής των κατάλληλων μεθόδων που θα επιτρέψουν την σωστή διάγνωση. Η εργασία αυτή υλοποιήθηκε στα πλαίσια της δίμηνης πρακτικής άσκησης στο Γενικό Νοσοκομείο Σερρών και πιο συγκεκριμένα, στην μονάδα πρόληψης και ελέγχου για Μεσογειακή αναιμία.

Δομή και λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Aιμοσφαιρίνη βασικός μεταφορέας του 02 στα ερυθροκύτταρα των σπονδυλωτών. Το μόριο της είναι 4μερές και κάθε υπομονάδα αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα, την σφαιρίνη, καθώς και από μια προσθετική ομάδα, την αίμη(σιδηροχρωστική που συνδέεται με το οξυγόνο και προσδίδει στο μόριο την ικανότητα μεταφοράς του.) Το μόριο της αποτελείται από 2 ζεύγη 2 διαφορετικών τύπων πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Εικόνα1.1: Δομή μορίου αιμοσφαιρίνης

Αιμοσφαιρίνες και στάδια ανθρώπινης ανάπτυξης Η κύρια αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων είναι η HbA. Η HbF είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη καθ’ όλη την διάρκεια της εμβρυικής ζωής( 70%, κατά μέσο όρο της συνολικής αιμοσφαιρίνης κατά την γέννηση). Στην ενήλικη ζωή λιγότερο από 1% του συνόλου της αιμοσφαιρίνης. Περιορίζεται σε λίγα κύτταρα της ερυθράς σειράς,τα κύτταρα F με αναλογία της HbF 10%. Η HbA2 εμφανίζεται στα ενήλικα άτομα, (2% της συνολικής αιμοσφαιρίνης) Πίνακας 1.1.: Αιμοσφαιρίνες και στάδια ανάπτυξης Εμβρυϊκή περίοδος (κάτω των 8 εβδομάδων) Εμβρυϊκή περίοδος (άνω των 8 εβδομάδων) Ενήλικη περίοδος Hb Gower 1 (ζ2ε2) HbF (α2γ2) HbA (α2β2) Hb Gower 2 (α2ε2 HbA2(α2δ2) Hb Portland (ζ2γ2)

Γονίδια αιμοσφαιρινών Τα συμπλέγματα γονιδίων της α-σφαιρίνης και της β- σφαιρίνης βρίσκονται στα χρωματοσώματα 16 και 11 αντίστοιχα. Τα συμπλέγματα αυτά, περιέχουν γονίδια που κωδικεύουν συγγενείς αλυσίδες σφαιρίνης, καθε μία από τις οποίες εκφράζεται σε διαφορετικό αναπτυξιακό στάδιο, ξεκινώντας απο την εμβρυακή ηλικία και καταλήγωντας στην ενήλικη ζωή. Η οικογένεια των α- τύπου γονιδίων εδράζεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 16, σε τμήμα DNA 26Kb. Η θέση της είναι 16p13.3. Περιλαμβάνει τα: α1 και α2 γονίδια Το πρωτοεμβρυικό ζ2 3 ψευδογονίδια, τα ψζ1, ψα1, ψα2 θ1 (μη καθορισμένη λειτουργία)

Γονίδια αιμοσφαιρινών Η οικογένεια των β τύπου γονιδίων βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 11, στη ζώνη 11p15.4 σε μια περιοχή 70Kb. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει τα εξής γονίδια: Το πρωτοεμβρυϊκό γονίδιο ε Τα εμβρυϊκά γονίδια Gγ και Αγ Τα γονίδια του ενήλικου δ και β Το ψευτογονίδιο ψβ Εικόνα 1.2: . Οργάνωση των ανθρώπινων γονιδίων των σφαιρινών.

Γενετικές διαταραχές της αιμοσφαιρίνης Α) Δομικά παραλλάγματα Στην περίπτωση αυτή έχουμε τροποποίηση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της σφαιρίνης, χωρίς να επηρεάζεται ο ρυθμός σύνθεσης. Β) Θαλασσαιμίες Εδώ έχουμε μείωση σύνθεσης μίας ή περισσότερων σφαιρινικών αλυσίδων. Γ) Κληρονομική διατήρηση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HPFH)

Θαλασσαιμίες Aνισορροπία της σύνθεσης των σφαιρινικών αλυσίδων. Αποτελούν την συνηθέστερη ανθρώπινη μονογονιδιακή διαταραχή. Μεταλλάξεις οδηγούν σε ελάττωση των επιπέδων σύνθεσης είτε της α είτε της β αλυσίδας. H αλυσίδα που παράγεται σε φυσιολογικά επίπεδα βρίσκεται σε περίσσεια και απουσία της συμπληρωματικής αλυσίδας με την οποία θα σχηματίζε τετραμερές, καθιζάνει στο εσωτερικό του κυττάρου.

Πίνακας 1.2 : Κλινική εικόνα γονοτύπων της α θαλασσαιμίας Α Θαλασσαιμίες Διαταραχή στην σύνθεση των α αλυσίδων, οπότε επηρεάζεται άρρηκτα ο σχηματισμός των αιμοσφαιρινών τόσο του εμβρύου όσο και των ενηλίκων. Οι συχνότερες μορφές α θαλλασαιμίας οφείλονται σε ελλείμματα ενός από τα δύο γονίδια α σφαιρίνης σε ένα χρωματόσωμα. Πίνακας 1.2 : Κλινική εικόνα γονοτύπων της α θαλασσαιμίας ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΓΟΝΟΤΥΠΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΛΥΣΙΔΩΝ Α Φυσιολογική 4 αα / αα 100% Σιωπηλός φορέας 3 αα / α _ 75% Στίγμα α ΜΑ 2 αα / _ _ 50% Νόσος HbH 1 α_ / _ _ 25% Εμβρυϊκός ύδρωπας (Hb Bart’s) _ _ / _ _ 0%

Β Θαλασσαιμίες Εδώ παρατηρείται μειωμένη παραγωγή β- σφαιρίνης. Η αλυσίδα β είναι σημαντική μόνο κατα την μεταγεννητική περίοδο, οπότε τότε γίνονται αντιληπτά τα συμπτώματα της β- θαλασσαιμίας. Σαν κύριο σύμπτωμα είναι η μειωμένη σύνθεση της κύριας αιμοσφαιρίνης HbA. Όμως, επειδή το γονίδιο δ παραμένει άθικτο, η HbA2 συντίθεται κανονικά, και μάλιστα, παρατηρείται αύξηση στα επίπεδα της. Το επίπεδο της HbF αυξάνεται επίσης λόγω επιλεκτικής επιβίωσης. Οι φορείς ενός μόνο αλληλόμορφου β θαλασσαιμίας είναι κλινικά υγιείς και έχουν ελάσσονα θαλασσαιμία. Αυτά τα άτομα έχουν υποχρωματικά, μικροκυταρικά ερυθροκύτταρα ίσως και ήπια αναιμία. Τα άτομα που πάσχουν από ομόζυγη β- θαλασσαιμία εμφανίζουν αναιμία μόλις αρχίσει να μειώνεται η μεταγεννητική παργωγή της HbF.Η βαριά αιμολυτική αναιμία, με Hb<5gm/L, προκαλεί: Αναστολή της αυξήσεως, ίκτερο, ηπατοσπληνομεγαλία και επέκταση του μυελού των οστών που προκαλεί ευδιάκριτες σκελετικές αλλαγές. Διαμορφώνεται το τυπικό προσωπείο με έντονα ζυγωματικά και προεξοχή της άνω σιαγόνας. Τα ερυθροκύτταρα του περιφερικού αίματος είναι όλα έντονα υποχρωματικά με ποικίλο σχήμα και μέγεθος.

Μοριακή βάση της Β Θαλασσαιμίας Σχεδόν κάθε τύπος ανωμαλίας που μπορεί να μειώσει την σύνθεση ενός mRNA ή μιας πρωτείνης μπορεί να χαρακτηριστεί ως αίτιο β θαλασσαιμίας. Υπάρχει μεγάλη διασπορά των σημειακών μεταλλάξεων κατά μήκος του γονιδίου και προσβάλλουν σχεδόν κάθε διαδικασία που απαιτείται για την παραγωγή φυσιολογικής β σφαιρίνης. Εικόνα 1.3 : Σημειακές μεταλλάξεις που προκαλούν β θαλασσαιμία.

Πίνακας 1.3: Η μοριακή βάση της β θαλασσαιμίας ΤΥΠΟΣ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΠΡΟΣΒΕΒΛΗΜΕΝΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ Ελλείμματα Πρωτεϊνες από συγχώνευση γονιδίων Hb Lepore→ πρωτεϊνη από συγχώνευση δβ β0, βLepore Ιταλοί Ελλείμματα γονιδίου β σφαιρίνης Έλλειμμα 619 ζευγών βάσεων β0 Ινδοί Ελαττωματική σύνθεση mRNA Ατέλειες κατά την συναρμολόγηση του mRNA Ανώμαλη θέση δέκτη του ιντρονίου 1: AG GG Μαύροι Μεταλλάγματα υποκινητές Μεταλλάξεις στην αλληλουχία ΑΤΑ : ΑΤΑΑ => GTAA β+ Ιάπωνες Ανώμαλη θέση καλύματος mRNA Μεταστροφή Α->C στην θέση καλύμματος του mRNA Ασιάτες Ατέλειες στο σήμα πολυαδενυλίωσης AATAAA => AACAAA Μη λειτουργικό mRNA Μη νοηματικές μεταλλάξεις Το κωδικόνιο 39 gln μετατρέπεται σε κωδικόνιο λήξης (UAG) Μεσογειακοί Πλαισιοτροποποιητικές μεταλλάξεις Αλλαγή πλαισίου που οδηγεί σε πρόωρη λήξη πρωτεϊνοσύνθεσης Μεταλλάξεις κωδικεύουσας περιοχής Ουδέτερες μεταλλάξεις gly=>gly (κωδικόνιο 24) Παρανοηματικές μεταλλάξεις glu=>lys (κωδικόνιο 26, ΗbE) β+, βε (HbA 60%, HbE 40%) ΝΑ Ασία

Μοριακή βάση της Β Θαλασσαιμίας Η β μεσογειακή αναιμία χωρίζεται σε τρεις μεγάλες κατηγορίες ανάλογα με το τύπο της μετάλλαξης: Α) Ασυμπτωματική β μεσογειακή αναιμία Β) Ενδιάμεση β μεσογειακή αναιμία Γ) Μείζον β μεσογειακή αναιμία

Δρεπανοκυτταρική αναιμία Αλλαγή ενός μόνο από τα 146 αμινοξέα της β σφαιρίνης. Απλή υποκατάσταση του γλουταμινικού οξέος από βαλίνη, στην θέση 6 της πολυπεπτιδικής αλυσίδας( β 6 Glu Val). Η αιμοσφαιρίνη των δρεπανοκυττάρων (HbS), είναι η πρώτη ανώμαλη αιμοσφαιρίνη που ανιχνεύθηκε. Πίνακας 1. 4. Τύποι Δρεπανοκυτταρικής αναιμίας Κλινική κατάσταση Αιμοσφαιρίνη Σύσταση αιμοσφαιρίνης Γονότυπος Φυσιολογική HbA α2Αβ2Α aa/ aa β/β Ετερόζυγος φορέας HbA, HbS α2Αβ2S αα/ αα β/ βs Δρεπανοκυτταρική νόσος HbS aa/aa βs/ βs

Η δρεπάνωση και οι συνέπειες της Συνθήκες χαμηλής πίεσης οξυγόνου  μόρια της αιμοσφαιρίνης S συναθροίζονται σχηματίζοντας κυλινδρικά πολυμερή παραμορφώνουν τα ερυθροκύτταρα και τους δίνουν δρεπανοειδές σχήμα  Απόφραξη τριχοειδών αγγείων και πρόβλημα στην ροή του αίματος.

Η δρεπάνωση και οι συνέπειες της Εικόνα 1.4: Μορφή δρεπανοκυττάρων

Διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών: εκτίμηση αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων Α) Απαραίτητες εξετάσεις Μέτρηση αιμοσφαιρίνης, αιματοκρίτη, ερυθροκυτταρικών δεικτών Εκτίμηση μορφολογίας ερυθροκυττάρων Ωσμωτική αντίσταση ερυθροκυττάρων Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης Χρωματογραφία υψηλής πίεσης Β) Συμπληρωματικές εξετάσεις Έμβιος χρώση Μέτρηση HbF Δοκιμασία δρεπανώσεως

Διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών: εκτίμηση αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων Αιματοκρίτης Αντιστοιχεί στο ποσοστό του όγκου που καταλαμβάνουν τα ερυθροκύτταρα σε σχέση με τον συνολικό όγκο αίματος. Αριθμός ερυθροκυττάρων Αντιστοιχεί στον αριθμό των ερυθροκυττάρων που περιέχονται σε μια μονάδα όγκου ολικού αίματος. Μορφολογία ερυθροκυττάρων. Ερυθροκυτταρικοί δείκτες. Σε φυσιολογικές συνθήκες όλα τα ερυθροκύτταρα είναι όμοια μεταξύ τους(ίδιο μέγεθος και ίδια ποσότητα αιμοσφαιρίνης). Οι ερυθροκυτταρικοί δείκτες είναι: MCH: Μέση ποσότητα αιμοσφαιρίνης/ερυθροκύτταρο. MCV: Μέσος όγκος ερυθροκυττάρων MCHC: Μέση συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης στα ερυθροκύτταρα Αιμοσφαιρίνη Αντιστοιχεί στην ποσότητα της αιμοσφαιρίνης που εμπεριέχεται στα ερυθροκύτταρα ενός καθορισμένου όγκου ολικού αίματος(100ml).

Διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών: εκτίμηση αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων Πίνακας 1.5. Φυσιολογικές τιμές ερυθροκυτταρικών δεικτών Ερυθρά Αιμο-σφαιρίνη Αιμα-τοκρίτης MCV MCH MCHC Εύρος κατα-νομής ερυθρών RDW-CV 3-6 M/μL 13,3-17,5 g/dL 40,5-52,7% 80-97 fL 27-31,2 pg 31,8-36 p/dL 38-43 fL 11- 14,8%

Διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών: εκτίμηση αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων Ωσμωτική αντίσταση ερυθροκυττάρων Όταν το περιβάλλον γίνει υπότονο οι ομοιοστατικοί φυσιολογικοί μηχανισμοί των ερυθροκυττάρων για την διατήρηση του σχήματος πάουν να λειτουργούν. Έτσι, εισέρχεται νερό μέσα στα ερυθροκύτταρα με αποτέλεσμα να διογκώνονται και τελικώς, να ρήγνυνται, αφήνοντας την αιμοσφαιρίνη να διαχυθεί στο περιβάλλον, φαινόμενο που λέγεται αιμόλυση. Τα παθολογικά ερυθροκύτταρα εμφανίζουν αυξημένη ωσμωτική αντίσταση. Βιοχημική μελέτη της αιμοσφαιρίνης →Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης: Η αιμοσφαιρίνη αποκτά ένα ελάχιστο ηλεκτρικό φορτίο όταν βρεθεί σε όξινο ή αλκαλικό περιβάλλον.Έτσι, όταν τοποθετηθεί μια μικρή ποσότητα ιονισμένης αιμοσφαιρίνης σε ηλεκτρικό πεδίο, θα κινηθεί προς την άνοδο ή την κάθοδο με ταχύτητα ανάλογη με το φορτίο της. Με τον τρόπο αυτό βλέπουμε τον διαχωρισμό των διάφορων τύπων αιμοσφαιρίνης. →Χρωματογραφία: Διαδικασία παρόμοια με την ηλεκτροφόρηση. Τα ιονισμένα μόρια αιμοσφαιρίνης συνδέονται με κόκκους αντίθετα φορτισμένων ουσιών(ρητίνες) και εκλούονται προοδευτικά ανάλογα με το φορτίο τους. Με τον τρόπο αυτό γίνεται και ο ποσοτικός προσδιορισμός της HbA2 αιμοσφαιρίνης. →Μέτρηση εμβρυϊκης αιμοσφαιρίνης: Η μέτρηση της HbF σε αιμόλυμα μπορεί να γίνει μετά από διαχωρισμό και λήψη της με χρωματογραφία ή ηλεκτροφόρηση.

Διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών: εκτίμηση αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων Ενδοκυτταρικά έγκλειστα Σε περιπτώσεις θαλασσαιμιών εμφανίζονται κατακρημνίσματα από ενδοκυττάρια έγκλειστα. Πρόκειται για αδέσμευτες αλυσίδες αιμοσφαιρίνης. Μέτρηση σιδήρου ορού- φερριτίνης Η φερριτίνη είναι μια πρωτεϊνη που δεσμεύει τον σίδηρο και λειτουργεί στον οργανισμό σας αποθήκη σιδήρου. Γύρω στα 2/3 του αποθηκευμένου σιδήρου εμφανίζεται συνδεδεμένο με τη φερριτίνη, ενώ το υπόλοιπο 1/3 περιέχεται στην αιμοσιδηρίνη. Η πρώτη αντίδραση του οργανισμού στην μείωση των αποθεμάτων σιδήρου γίνεται με την πτώση της φερριτίνης στον ορό.

Εργαστηριακοί μέθοδοι Χρώση May- Grunwald- Giemsa Ωσμωτική αντίσταση ερυθρών Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης Χρωματογραφία υψηλής πίεσης Έγκλειστα Γενική εξέταση αίματος Μέτρηση σιδήρου ορού

Χρώση May-Grunwald- Giemsa: Υλικά και μέθοδοι ►Τεχνική Μονιμοποίηση των παρασκευασμάτων(αίμα ασθενούς) με μεθανόλη 5 min. Χρώση με την αναμεμιγμένη May-Grunwald επί 10 min. Απόρριψη χρωστικής. Χρώση με την αναμεμιγμένη Giemsa για 10 min. Απόρριψη, καλό ξέβγαλμα με νερό βρύσης. Στέγνωμα σε θερμοκρασία δωματίου.

Ωσμωτική αντίσταση ερυθρών: Υλικά και μέθοδοι ►Tεχνική Ετοιμασία σωληναρίων με 4 κ.εκ. του διαλύματος 0.33% NaCl. Προσθήκη σε κάθε σωληνάριο μιας σταγόνας ολικού αίματος από τα υπό εξέταση δείγματα. Ανάμιξη. Αξιολόγηση αποτελεσμάτων μετά από 5 min. Αξιολογείται η διαφάνεια των μειγμάτων. ΑΡΝΗΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ: Πλήρης αιμόλυση (πλήρης διαφάνεια) ΘΕΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ: Μη αιμόλυση (θολερότητα)

Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης: Υλικα και μέθοδοι ►Τεχνική Χρησιμοποιούνται σαν ηλεκτροφορητικό μέσο ταινίες οξεΪκής κυτταρίνης. Οι ταινίες διατηρούνται σε μεθανόλη 30%. Παραμονή των ταινιών σε διάλυμα ηλεκτροφορήσεως για 15 min πριν την χρήση τους. Στέγνωμα της ταινίας με διηθητικό χαρτί. Τοποθέτηση του αιμολύματος από την θαμπή πλευρά της ταινίας προς την κάθοδο. Η τοποθέτηση γίνεται με λεπτή πιπέττα. Τοποθέτηση της ταινίας στην γέφυρα του λουτρού. Αναμονή για 5 min. Κάλυψη της συσκευής ηλεκτροφορήσεως. Ρευματοδότηση. Διαχωρισμός αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Η ηλεκτροφόρηση διαρκεί για 1h και 15min. Μετά ακολουθεί χρώση με την χρωστική για 3 min και στην συνέχεια διαδοχικές εκπλύσεις σε διάλυμα οξεϊκού οξέος 5% σε διαδοχικά δοχεία, μέχρι αποχρωματισμού των ταινιών. Όμως τα αιμοσφαιρινικά κλάσματα χρωματίζονται πράσινα και δεν αποχρωματίζονται.

Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης: Υλικά και μέθοδοι Ερμηνεια αποτελεσμάτων Στην ηλεκτροφόρηση ενός αιμολύματος με τις παραπάνω συνθήκες διακρίνουμε τα εξής κλάσματα: Αιμοσφαιρίνη Α, που αποτελεί το κύριο κλάμα και κινείται γρήγορα προς την άνοδο Αιμοσφαιρίνη Α2, που αποτελέι τα 2-% και κινείται αργά προς την άνοδο. Αιμοσφαιρίνη F, που όταν υπάρχει κινείται προς την άνοδο λίγο αργότερα από την αιμοσφαιρίνη Α. Σε περιπτώσεις αιμοσφαιρινοπαθειών: Οι αιμοσφαιρίνες S και Lepore κινούνται σε ίση απόσταση ανάμεσα στις HbA και ΗbA2 H αιμοσφαιρίνη Η κινείται ταχύτερα από όλες και βρίσκεται αρκετά μπροστά από την αιμοσφαιρίνη Α. Οι αιμοσφαιρίνες E, C, 0 κ.ο.κ. κινούνται ισόϋψως με την HbA2.

Έγκλειστα: Υλικά και μέθοδοι ►α. Μέθοδος πριν από την επώαση Διαπίστωση ενδοκυττάριων ιζημάτων αιμοσφαιρίνης (χρώση έγκλειστων) Χρησιμεύει για την διάγνωση της ομόζυγης Β-ΜΑ, όπου οι αλυσίδες που βρίσκονται σε περίσσεια καθιζάνουν μέσα στα ερυθροκύτταρα. ►Τεχνική Μερικές σταγόνες αίματος προστίθενται σε ίσο όγκο αντιδραστηρίου σε μικρό σωληνάριο. Παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 30min. Από το εναιώρημα παρασκευάζονται επιστρώσεις σε αντικειμενοφόρο πλάκες, οι οποίες ξηραίνονται στον αέρα. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Όταν υπάρχουν έγκλειστα, φαίνονται σαν μικρά ή μεγάλα μωβ άμορφα κοκκία.

Έγκλειστα: Υλικά και μέθοδοι ►β. Μέθοδος με επώαση Κατακρίμνηση ασταθών αλύσων αιμοσφαιρίνης μέσα στα ευθροκύτταρα. Χρησιμεύει για διαπίστωση ασταθών αλύσων αιμοσφαιρίνης και αλυσίδων β.(αιμοσφαιρινοπάθεια Η και ετερόζυγη α Μεσογειακή αναιμία) ►Τεχνική Ο,5 ml αίματος επωάζεται με 0,1 ml αντιδραστηρίου, σε κωνικό σωληνάριο, για 30 min στος 370C. Αφαίρεση λίγο από το υπερκείμενο διάλυμα και τα ερυθροκύτταρα χρωματίζονται με ιώδες του μεθυλίου. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Τα έγκλειστα μοιάζουν με αδρά κοκκία ή έντονα μωβ χρωματισμένα.

Χρωματογραφία υψηλής πίεσης: Υλικά και μέθοδοι ►Τεχνική Αιμολύματα ασθενών (1ml) Τοποθέτηση στον αυτόματο αναλυτή HRLC και φωτομέτρηση στα 690 nm Αποτελέσματα για ποσότητες HbA2 και HbF.

Μέτρηση σιδήρου ορού Η μέτρηση του σιδήρου γίνεται μέσω ενός ειδικού μηχανήματος με τα ανάλογα αντιδραστήρια (COBAS INTEGRA). ►Συλλογή δείγματος και προετοιμασία Δείγματα που πρέπει να συλλέγονται το πρωί ώστε να αποφεύγονται χαμηλές τιμές λόγω της ημερήσιας μεταβλητότητας. Χρειάζεται ορός και πλάσμα που δεν παρουσιάζουν αιμόλυση και λιπαιμία. Ως αντιπηκτικό χρησιμοποιείται η ηπαρίνη. (EDTA, οξαλοξικό οξύ και κιτρικό οξύ δεν χρησιμοποιούνται ως αντιπηκτικά γιατί δεσμεύουν τον σίδητο και εμποδίζουν τις αντιδράσεις.) ►Τεχνική Το σύστημα του μηχανήματος υπολογίζει αυτόματα την συγκέντρωση του σιδήρου σε κάθε δείγμα. Οι τιμές αναφοράς για ποσότητα σιδήρου σε άντρες- και γυναίκες είναι: 11-28 μmol/L σε άντρες και 6,6-26 μmol/L σε γυναίκες.

Αποτελέσματα Μετά από εργαστηριακή εξέταση των δειγμάτων, συγκρίνονται τα αποτελέσματα με φυσιολογικούς δείκτες και βγαίνουν τα ανάλογα συμπεράσματα.

Πίνακας 1.6: Κυριότερα εργαστηριακά ευρήματα για μορφές της ΜΑ. (ΑΝΜΚ=ανομοιογενής κατανομή) Μορφολογικές αλλοιώσεις MCH (pg) MCV (fl) HbA2 (%) HbF (%) Κατανομή HbF Παθολογική Hb Δοκιμασία δρεπάνωσης Έγκλειστα Αντίσταση ερυθρών α:β β ΜΑ ετερόζ. + ↓ ↑ 1-5 ΑΝΜΚ - δβ ΜΑ 5-20 Hbθ/ Lepore 1,3-15 HbS/ HbA Φ β ΜΑ/ HbS 0,5-20 HbS/ HbS 2-25 a θαλασσαιμία 1 α θαλασσαιμία 2 +/- ↓ή Φ ↓ ή Φ

Αποτελέσματα υποχρωμία στοχοκυττάρωση βασιόφιλος στίξη ανισοκυττάρωση Κατά την μεσογειακή αναιμία παρατηρούνται επίσης μορφολογικές αλλαγές στα ερυθροκύτταρα περιφερικού αίματος. Οι μορφολογικές αλλοιώσεις είναι οι ακόλουθες: υποχρωμία στοχοκυττάρωση βασιόφιλος στίξη ανισοκυττάρωση ποικιλοκυττάρωση πολυχρωματοφιλία

Αποτελέσματα Εικόνα 1.5: Μορφολογία περιφερικού αίματος σε φυσιολογικό άτομο. Εικόνα 1.6: Ετερόζυγη β Μεσογειακή αναιμία (υποχρωμία, ανισοποικιλοκυττάρωση, βασιόφιλη στίξη)

Αποτελέσματα Εικόνα 1.7: Ομόζυγη β Μεσογειακή αναιμία (έντονη ανισοποικιλοκυττάρωση, στοχοκύτταρα, πολυχρωματοφιλία) Εικόνα 1.8: Ομόζυγη β Μεσογειακή αναιμία (βασιόφιλος στίξη, σταγονοειδή κύτταρα, ανισοποικιλοκυττάρωση, εμπύρηνη ερυθροβλάστη)

Αποτελέσματα Αποτελέσματα προκύπτουν και από την ηλεκτροφόρηση της αιμοσφαιρίνης, η οποία αποκαλύπτει, όπως αναφέρθηκε, την αυξημένη ή όχι παρουσία HbA2 ή ΗbF αλλά και την τυχόν ύπαρξη ανώμαλων κλασμάτων αιμοσφαιρίνης. Εικόνα 1.10: Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης (μεμβράνη κυτταρίνης) 2) HbS 72%, HbA2 6%, γονότυπος β0/βs 3) ΗbA 8%, HbS 86%, HbA2 6%, γονότυπος β+/βs 4) HbA 0%, HbF 4%, HbS 91%, HbA2 5%, γονότυπος β0/ βs 5) Φυσιολογικό άτομο

Αποτελέσματα Από την διαδικασία της χρωματογραφίας, παίρνουμε σημαντικές πληροφορίες για την ποσότητα της HbF και ΗbA2. Εικόνα 1.11: Χρωματογραφία υψηλής πίεσης όπου και στις 2 περιπτώσεις παρατηρείται αύξηση της HbA2.

Ευχαριστίες Στο τμήμα Βιολογίας για την ευκαιρία εκπόνησης της πρακτικής άσκησης. Στο Γενικό Νοσοκομείο Σερρών για την αποδοχή μου εκεί για την δίμηνη πρακτική άσκηση και πιο συγκεκριμένα, στην διευθύντρια του Μικροβιολογικού κ.Μάρκου. Ιδιαιτέρως στον κ. Μωραϊτη και τους συνεργάτες του, από το τμήμα πρόληψης και ελέγχου της Μεσογειακής αναιμίας,για την βοήθεια τους και την εκπαίδευση που μου παρείχαν αυτούς τους 2 μήνες.

Βιβλιογραφία Χαλεβελάκης Γεώργιος, Αιμοσφαιρινοπάθειες, Εκδόσεις Βιβλίων Χαλεβελάκη, Αθήνα 1991 Thompson & Thompson, Ιατρική γενετική, Πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 2001 Watson, Myers, Caudy, Witkowski, Το ανασυνδυασμένο DNA, Ακαδημαϊκές εκδόσεις Μπάσδρα, Αθήνα 2007 Καράμπαμπα Φ., Δομή των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης Τσάνταλη Χ., Μοριακή βάση της μεσογειακής αναιμίας