Ispitivanje lipidnog statusa: uticaj preanalitičkih faktora

Osnovni parametri lipidnog statusa Ukupan holesterol LDL-holesterol HDL-holesterol Trigliceridi

Aterogeni indeksi Ukupan holesterol / HDL-holesterol LDL-holesterol / HDL-holesterol Trigliceridi / HDL-holesterol Non-HDL-holesterol (Ukupan holesterol – HDL-holesterol)

Ostala ispitivanja lipidnog statusa Apolipoprotein A-I Apolipoprotein B Lp(a) Elektroforeza lipoproteina

Zašto ispitujemo lipidni status? Procena rizika od kardiovaskularnih bolesti Dijagnoza primarnih/sekundarnih dislipidemija Praćenje terapije Cilj: Odrediti tipične vrednosti parametara lipidnog statusa !

Varijacije rezultata određivanja parametara lipidnog statusa Analitičke varijacije Biološke (preanalitičke) varijacije Intraindividualne (varijacije u rezultatima koji se dobijaju kod jedne osobe) Interindividualne (varijacije u rezultatima koji se dobijaju kod različitih osoba)

Intraindividualne varijacije parametara lipidnog statusa Odavno je utvrđeno da postoji velika varijabilnost u rezultatima ispitivanja lipidnog statusa. Ako se kod nekog pacijenta u više navrata određuje koncentracija serumskih lipida i lipoproteina, dobiće se vrednosti koje se međusobno razlikuju u prilično velikoj meri. Ove razlike između rezultata posledica su analitičkih i preanalitičkih intraindividualnih varijacija (ukupna intraindividualna varijacija + analitička varijacija + intraindividualna varijacija). Usavršavanjem analitičkih metoda za određivanje lipida i lipoproteina smanjuju se analitičke varijacije. Tako se naprimer preporučuje da metoda za određivanje holesterola ima KV do 3%, što u savremenoj laboratoriji nije teško postići. Intra-individualne varijacije lipidnih parametara utvrđene određivanjem lipida u tri navrata u toku 5-6 meseci bile su značajno veće od analitičkih varijacija za holesterol, LDL-holesterol i trigliceride (TG imaju vrlo veliku intraindividualnu varijaciju), dok su neznatno veće za HDL-holesterol, apo AI i apo B (metode sa većim KV).

Određivanje tipičnih vrednosti Odrediti parametre lipidnog statusa najmanje u dva navrata Interval: 1 nedelja - 2 meseca Svesti na minimum uticaj preanalitičkih faktora Priprema pacijenta Postupak uzimanja i obrade uzoraka Zbog velikih varijacija, rezultati koji se dobiju jednim merenjem ne moraju da odgovaraju uobičajenom lipidnom statusu pacijenta, već se mogu od njega značajno razlikovati zbog kratkoročnog uticata nekog faktora koji utiče na koncentraciju serumskih lipida i lipoproteina. Međutim, da bi se procenio rizik od koronarnih bolesti kod pacijenta, potrebno je odrediti uobičajenu, tipičnu koncentraciju serumskih lipida i lipoproteina. Uobičajena koncentracija serumskih lipida i lipoproteina može se pouzdanije proceniti izvođenjem analize u više navrata (ponavljanje u istom uzorku mnogo ne pomaže, a ima smisla samo utoliko što umanjuje efekat analitičke varijacije). Analiziranje u više navrata podrazumeva dolaženje pacijenta u zdravstvenu ustanovu nekoliko puta, pri čemu se svaki put radi cela procedura od vađenja krvi do izdavanja rezultata. Zato bi bilo poželjno da se broj ovakvih ponovljenih ispitivanja što je moguće više smanji. Poznavanje preanalitičkih faktora koji utiču na lipidni status omogućuje primenu mera kojima se uticaj tih faktora svodi na minimum. Te mere podrazumevaju pažljivu pripremu pacijenta u određenom intervalu pre uzimanja uzorka krvi, kao i način samog uzimanja i obrade uzorka. Cilj tih mera je da se intra-individualna varijacija smanji na minimum, čime se omogućuje procena uobičajenih koncentracija lipidnih parametara datog pacijenta bez preteranog ponavljanja procedure. Napr., uz primenu preciznih analitičkih metoda i rigoroznu pripremu pacijenta, moguće je odrediti tipičnu koncentraciju holesterola i LDL-holesterola izvođenjem analize u dva navrata. Ako se dobiju vrednosti holesterola koje su daleko od granica odlučivanja, obično je dovoljno i jedno određivanje. Zbog veće nepreciznosti metoda za određivanje LDL-holesterola, jedno određivanje je dovoljno samo kod izrazito visokih vrednosti. U sprovođenju navedenih mera, biohemičar ima važnu ulogu - priprema pacijenta u saradnji sa lekarom, - uzimanje i obrada materijala - svakodnevni rad u laboratoriji.

Faktori intraindividualne varijacije Fiziološke varijacije Bihejvioralne varijacije (način života) Ishrana, fizička aktivnost, pušenje, alkohol, stres... Klinički faktori Uticaj bolesti Uticaj lekova Uzimanje i obrada uzoraka Usavršavanje analitičkih metoda olakšalo je utvrđivanje varijacija - sa nepreciznim metodama teško je utvrditi šta je prouzrokovalo razliku između rezultata. Brojni faktori utiču - iz poznavanja njihovih efekata proizilaze uputstva za praktičan rad kojih biohemičar treba da se pridržava da bi se intraindividualna var. svela na minimum. Fiziološke varijacije Hronobiološke varijacije Starost Posebne fiziološke varijacije kod žena Faktori sredine - socijalne navike Način ishrane Gojaznost Fizička aktivnost Pušenje Alkohol Kafa Stres Klinički faktori Uticaj oboljenja Uticaj lekova Uzimanje i obrada uzoraka Priprema pacijenta (poslednji obrok, položaj tela) Postupak vađenja krvi (staza) Vrsta uzorka (kapilarna ili venska krv, serum ili plazma) Antikoagulansi, konzervansi Čuvanje

Fiziološke varijacije Hronobiološke varijacije Cirkadijalni ritam Varijacija iz dana u dan Sezonske varijacije Starost Posebne fiziološke varijacije kod žena Menstrualni ciklus Trudnoća Menopauza Holesterol - najstabilniji parametar lipidnog statusa. Dnevna varijacija nije značajna i obično nije veća od 3% (KV) - brzina sinteze holesterola je nešto veća u toku noći. Varijacija iz dana u dan oko 6%, kod nekih osoba i do 11%. Vrednosti su veće zimi nego leti za 3-5%, a varijacija je utoliko veća ukoliko su veće razlike između zimskih i letnjih temperatura. Na zimski porast utiče i drugačiji način ishrane kao i porast indeksa telesne mase, ali to objašnjava samo oko 30% utvrđene varijacije. Trigliceridi - najizraženije varijacije. Prosečna dnevna varijacija je oko 30%: minimum oko 3:00 AM, rastu do maksimuma u poslepodnevnim časovima, zatim opadaju u toku večeri. Paralelno varira koncentracija lipida u VLDL lipoproteinima, dok se koncentracija lipida u HDL i LDL malo menja u toku dana. Porast TG posle doručka je veći nego posle ostalih obroka u toku dana (različit insulinski odgovor na obroke). Jutarnji porast TG postoji i bez unošenja hrane (povećana lipoliza, SMK preuzima jetra i sekretuje LP). Zbog poremećaja dnevnog ritma, mogu se dobiti više koncentracije TG natašte kod radnika u noćnoj smeni. Čak i kad se isključe varijacije zbog unošenja obroka, fluktuacije TG natašte su oko 23% (iz dana u dan u toku jednog ili nekoliko meseci), kod nekih osoba i 40% od srednje vrednosti. Zbog ovako velike nasumične varijacije iz dana u dan, teško je utvrditi ciklične fluktuacije u toku menstrualnog ciklusa, između godišnjih doba i sl (razne studije su objavile kontradiktorne rezultate). HDL-holesterol - Prosečna varijacija oko 7% u toku meseca do godine, retko preko 12%. Varijacija je veća kod pušača nego kod nepušača. Sezonska varijacija je nešto manja nego kod ukupnog holesterola ili LDL-holesterola. LDL-holesterol - Friedewald: visoka varijabilnost, oko 9,5% (TG ulaze u račun). Kao i ukupan holesterol, zimi je viši za oko 2,5% nego leti. Ako se meri - slično ukupnom holesterolu. *** (Apo AI - Minimum oko 6 AM, maksimum uveče. Varijacija oko 7-8%, veća kod pušača. Apo B - do 6,5% u toku dana bez značajne pravilnosti, oko 8-10% iz dana u dan. Lp(a) - Nema značajnog cirkadijalnog ritma. Prosečna varijacija iz dana u dan je 8,6%. )

Uticaj pola i starosti na lipidni status 4 Holesterol (mmol/L) 5 mmol/L 4 LDL-holesterol 3 3 2 2 Trigliceridi (mmol/L) 2 Uticaj starosti Novorođenčad imaju niske vrednosti lipida, LP i apoLP. Vrednosti rastu u toku prvih par nedelja života, a zatim se stabilizuju do puberteta. U pubertetu najpre prolazno opadaju koncentracije lipida, LP i apo LP, a zatim dolazi do karakterističnih promena zavisno od pola. Dečaci - pad HDL-C i apo AI (androgeni) Devojčice - postepen porast HDL-C i apo AI, vrednosti su naročito visoke do menopauze (estrogeni - ubrzana sinteza apo A i HDL, supresija HL - usporen katabolizam HDL) Odrasli - holesterol raste sa starošću, kao i LDL-C, TG i apo B (povećano stvaranje, usporen katabolizam - smanjenje aktivnosti LDL-receptora). Kod žena je ovaj porast LDL usporen zbog estrogena (stimulacija sinteze LDL-receptora) Fenomen platoa - kasniji kod žena, naročito izražen kod TG. Pad holesterola posle 70 godina (selektivni mortalitet?) Starost nema uticaja na podložnost LDL oksidaciji. Lp(a) izgleda da blago raste sa starošću, naročito kod žena posle menopauze. Zašto žene imaju niže TG? (VLDL u LDL - zbog bržeg katabolizma LDL pomera se ravnoteža?) 1 1 HDL-holesterol 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Starost (godine) 20 30 40 50 60 Starost (godine) žene muškarci

Promene lipidnog statusa u trudnoći I trimestar Ukupan holesterol  LDL-Holesterol  II i III trimestar Ukupan holesterol  HDL-Holesterol  LDL-Holesterol  Trigliceridi Holesterol (mmol/L) OBRISATI SLAJD MENSTRUALNI CIKLUS Holesterol - u vreme ovulacije vrednosti su 0,36 mmol/L veće od prosečnih, a zatim opadaju do minimuma u kasnoj lutealnoj fazi i u vreme menstruacije (10-20% niže od prosečnih vrednosti). LDL-holesterol - vrednosti su niže u kasnoj lutealnoj fazi i za vreme menstruacije. Apo AI i apo B - Nema dokazanih promena u toku menstrualnog ciklusa. TG - ne zna se zbog velikih nasumičnih varijacija. TRUDNOĆA Holesterol - Postepeno raste u toku trudnoće do maksimuma od 30-80% u vreme porođaja. Zato, vrednosti holesterola određene u trudnoći ne predstavljaju tipične vrednosti. Kao i ukupan holesterol, i apo B znatno raste u toku trudnoće (60%), i LDL-holesterol. Koji je uzrok (povećano stvaranje zbog povećanja VLDL, a na početku trudnoće je preovladavao efekat estrogena da snižavaju LDL?) Povećava se i apo AI za oko 30% i HDL-holesterol. Trigliceridi - Najizraženiji efekat trudnoće - U toku trudnoće postepeno rastu, (2-3 puta viši nego pre trudnoće), a posle porođaja se brzo normalizuju. Zato, ni vrednosti TG u toku trudnoće ne predstavljaju tipične vrednosti. Viši nivo je delom posledica povaćanja VLDL, ali i obogaćivanja LDL i HDL trigliceridima. Raste i slobodan glicerol (lipoliza) Nivo parametara lipidnog statusa se postepeno opada posle porođaja (TG se ubrzo vraćaju na normalu, LDL-holesterol znatno sporije), da bi se uobičajene koncentracije svih parametara postigle posle desetak nedelja. Međutim, laktacija usporava normalizaciju vrednosti, a naročito odlaže pad HDL-holesterola i apo AI. Lp(a) - Raste u toku trudnoće (2 puta viši na kraju II trimestra), vraća se na početne vrednosti do porođaja ili posle porođaja (različiti rezultati raznih studija). Promene metabolizma lipida u trudnoći izražene su u II i III trimestru. Rezistencija na insulin - u odmakloj trudnoći. Povećana mobilizacija masti je odraz povećanih potreba u toku trudnoće. TG Povećano stvaranje VLDL u jetri (estrogeni), ubrzana lipoliza TG masnog tkiva (rezistencija na insulin). Usporen katabolizam (smanjena aktivnost LPLzbog rezistencije na insulin, efekat najizrazitiji u masnom tkivu). (Metabolizam u masnom tkivu je usmeren u pravcu mobilizacije masti uz inhibiciju ulaska m.k. iz plazme zbog smanjenja LPL). Sem porasta VLDL, hipertrigliceridemija je posledica i obogaćivanja drugih klasa LP (HDL i LDL) trigliceridima (usled porasta aktivnosti CETP i visoke koncentracije TG) Ukupan i LDL-holesterol Najpre opada pod dejstvom estrogena, kasnije raste, kao posledica povećanja VLDL (metabolički prekurzor LDL) i ubrzane sinteze apo B. HDL Nagomilava se 2b forma. (1) Povećana aktivnost LCAT (porast aktivatora, apo AI), efikasno prikupljanje holesterola iz tkiva (2) Usporen katabolizam zbog smanjene aktivnosti HL (estrogeni).    Nedelje

Bihejvioralne varijacije Način ishrane Gojaznost Fizička aktivnost Pušenje Alkohol Kafa Stres

Uticaj sastojaka hrane Varijabilnost reakcije pojedinih osoba na različite vrste hrane. Npr. Povećan unos holesterola hranom dovodi do značajnog porasta (više od 5%) koncentracije holesterola u serumu kod samo 30% ispitanika (mehanizam: supresila aktivnosti LDL-receptora). Masne kiseline - Zasićene m.k. palmitinska (C16:0) i miristinska (C14:0) povećavaju konc. TC i LDL-C (mehanizam: nije potpuno jasan, verovatno interferencija sa katabolizmom LDL preko LDL-receptora). Stearinska kiselina nema uticaja na koncentraciju holesterola, verovatno zato što se konvertuje u mononezasićenu oleinsku kiselinu. Povećanje holesterola pod dejstvom zasićenih m.k. je dvostruko veće nego sniženje pod dejstvom polinezasićenih m.k. Zasićene m.k. srednje dužine lanca povećavaju nivo TG (transport iz GI trakta do jetre direktno portalnim krvotokom, supstrat za sintezu TG i VLDL u jetri. Dugolančane se ugrađuju u hilomikrone i metabolizuju se više u perifernim tkivima, naročito u mišićnom i masnom tkivu). Protektivne efekte imaju jedino prirodne (cis) nezasićene m.k., dok trans oblici dobijeni delimičnom hidrogenizacijoom biljnih ulja, nemaju protektivan efekat, već naprotiv povećavaju LDL i ukupan holesterolRiblje ulje sadrži -3 polinezasićene m.k. koje snižavaju TG, a naročito kod osoba sa hipertrigliceridemijom (do 66%, inhibicija sinteze endogenih TG u jetri). Kod nekih osoba sa hiperlipoproteinemijama (naročito tipa IV i V), dovode do povećanja koncentracije LDL- i HDL-holesterola. Vegetarijanci: “zdraviji” lipidni status: 37% niži LDL-C (laktovegetarijanci nemaju toliko niže vrednosti zbog većeg unosa zasićenih m.k.), 12% viši HDL-C. Broj obroka u toku dana - Osobe koje uzimaju 4 ili više obroka imaju niži holesterol (uglavnom LDL) od onih koji istu, ili čak manju količinu hrane uzmu u 1 ili 2 obroka. Količina masti u hrani i ukupna količina unetih kalorija dnevno - smanjenje ima povoljan efekat. Ugljeni hidrati - nema bitne razlike između efekata prostih šećera i složenih ugljenih hidrata. Efekat promene načina ishrane - značajne promene lipidnog statusa posle relativno kratkog perioda.

Gojaznost i lipidni status Promene kod gojaznih osoba (BMI>30 kg/m2) Ukupan holesterol  LDL-holesterol  HDL-holesterol  Trigliceridi  Redukcija telesne težine Sniženje ukupnog i LDL-holesterola (-10%) Povećanje HDL-holesterola (10%) Sniženje triglicerida (-40%) Tip gojaznosti Definicija: indeks telesne mase veći od 30 Odavno se zna da je gojaznost povezana sa povećanim rizikom od CHD. U mnogim zemljama ovo je važan uzročnih povećanih koncentracija holesterola. Stepen gojaznosti izgleda nema većeg uticaja. Sem što utiče na lipide, gojaznost takođe utiče na sistolni i dijastolni pritisak i na toleranciju glukoze. Postoji rezistencija na insulin - ubrzana lipoliza u masnom tkivu, raste slobodan glicerol i TG Distribucija masti (tip gojaznosti) je veoma važna. Centralno (intraabdominalno) nagomilavanje masti (visok odnos obima struka i kukova) povezano je sa višim TG i VLDL-C i nižim HDL-C, kao i sa većim stepenom morbiditeta (hiperlipoproteinemije, hipertenzija, dijabetes i CHD). Promene kod redukcije tt - najpre opadaju TG. HDL u početku dijete nešto opada, ali se kasnije normalizuje i raste. Mehanizmi uticaja gojaznosti i redukcije tt način ishrane - količina masti u hrani rezistencija na insulin (broj insulinskih receptora smanjen kod gojaznih, povećava se posle redukcije tt)

Fizička aktivnost i lipidni status Dugoročni efekti LDL-holesterol  HDL-holesterol  Trigliceridi  Kratkoročni efekti intenzivnog vežbanja Ukupan holesterol  Mehanizmi Smanjen sadržaj masti u organizmu Ubrzan katabolizam lipoproteina bogatih trigliceridima u mišićima i masnom tkivu Efekti su u srazmeri sa intenzitetom vežbanja, odnosno stepenom postignute kondicije. Brzo hodanje - znatno povećanje HDL (27%) Fizička aktivnost dovodi do povećanja aktivnosti LPL - brži katabolizam TRL, TG opadaju, a naročito kod pacijenata sa hipertrigliceridemijom. Akutno vežbanje Povećanje ukupnog holesterola (+13%) Povećanje HDL-C (+17%), bez promene volumena plazme

Alkohol i lipidni status Male količine imaju pozitivne efekte... HDL-holesterol  LDL-holesterol  ... ali velike količine su štetne Trigliceridi  Alkohol - HDL se značajno povećava (indukcija sinteze apo). LDL - kod nepušača nešto raste, a kod pušača opada (vrednosti su kod pušača već više i bez uticaja alkohola). Po rezultatima nekih studija, raste samo HDL3, odnosno Lp AIAII, koji nemaju protektivni efekat. TG se povećavaju samo kod velikih količina alkohola, ili kod pacijenata sa hiperTGemijom, kojima alkohol pogoršava stanje. Neki protektivni efekat postoji (manji morbiditet i mortalitet). Najpovoljniji lipidni status - nepušači koji konzumiraju male količine alkohola.

Ostali bihejvioralni faktori Pušenje Ukupan holesterol  LDL-holesterol  HDL-holesterol  Trigliceridi  Kafa Ukupan holesterol  LDL-holesterol  Stres HDL-holesterol  OBRISATI SLAJD? Pušenje - Promene lipidnog statusa - dozna zavisnost efekata. Kod adolescenata promene su jače izražene. Još je veći pad HDL, pa je zato promena ukupnog holesterola manja nego dok odraslih. Efekti su delom prouzrokovani i razlikama u ishrani i uzimanju alkohola između pušača i nepušača. Mislilo se da pušenje ubrzava oksidaciju LDL (duvanski dim sadrži oksidanse), ali rezultati ispitivanja to nisu potvrdili. Promene lipidnog statusa objašnjavaju svega oko 10% ukupnog efekta pušenja na povećanje rizika od ateroskleroze. Pušenje ima i druge efekte, pa preovladava sklonost ka trombozi nad sklonošću ka aterosklerozi. To su:povećanje faktora koagulacije, karboksihemoglobina, broja leukocita, hematokrita i viskoziteta krvi. Kafa Kofein ne utiče na lipidni status (isti nivo kod kafe sa i bez kofeina) Prokuvana kafa povećava holesterol za 6-10%, LDL-holesterol 9%, a efekat je dozno-zavisan. Nema uticaja na nivo HDL-holesterola. Instant kafa ne utiče znatnije na lipidni status, kao i filter-kafa. Hiperholesterolemijski faktor se izgleda zadržava filtriranjem. Većina studija ne ukazuje na uticaj kafe na TG. Stres Primećeno je da u stresnim situacijama raste nivo ukupnog holesterola, što može biti i posledica promena u ishrani koje prate stres. Hospitalizacija dovodi do pada HDL i apoAI za oko 10%. Nije poznat tačan mehanizam povezanosti stresa sa lipidnim statusom.

Klinički faktori Uticaj bolesti Uticaj lekova Infarkt miokarda Lipidni status odrediti u prva 24h ili posle 3 meseca! Infekcija, trauma, operacije Maligne bolesti Sekundarne hiperlipoproteinemije Dijabetes Hipotiroidizam Opstrukcija žučnih puteva Hronična insuficijencija bubrega Uticaj lekova Infarkt miokarda - Vrednosti se ne menjaju u periodu od 24 časa od infarkta. Kasnije opadaju vrednosti ukupnog, HDL i LDL holesterola, apo A i apo B. Stepen sniženja zavisi od težine infarkta (reverzibilna ishemija 9%, 18% kod preživelih i 26% kod umrlih u bolnici) i od početnih koncentracija (niže konc - manje sniženje). Minimalne vrednosti 1 nedelju posle infarkta. Nema pravilnosti u promenama TG. Slični efekti moždanog infarkta Infekcija i zapaljenje - Promene su slične kod bakterijskih i virusnih infekcija, zavise od težine bolesti. U akutnoj fazi, ukupan holesterol pada za 15% (opadaju i LDL- i HDL-), apo AI za 22%, dok se apoB ne menja. Promene su posledica supresije hepatične i lipoproteinske lipaze (IL-1, interferon i TNF). Za vreme konvalescencije mogu da rastu TG. Za vreme akutnog pankreatitisa, rastu TG, a opada HDL-holesterol. Trauma i operacije - Veće operacije dovode do značajnog pada holesterola (-31%) i TG (43%), a LDL opada nešto manje. Opada VLDL-holesterol i VLDL-TG (smanjena sinteza u jetri zbog nedostatka prekurzora, povećan katabolizam). Koncentracije se normalizuju za 1 mesec. HDL-holesterol takođe opada (-35%), i duže ostaje snižen. Operacije posle opekotina - razlika u tome što TG rastu (max posle 5-6 dana) Maligne bolesti - Postoji povezanost između niskih vrednosti holesterola i karcinoma. Primećen je pad holesterola (LDL, a HDL se ne menja, kao ni TG) za 0.6 mmol/L dve godine pre postavljana dijagnoze karcinoma. Smatra se da je to posledica prekliničke faze u kojoj se povećava aktivnost LDL-receptora. Izuzetak je karcinom dojke, sa višim konc. ukupnog i LDL.holesterola i TG. Sekundarne hiperlipoproteinemije Najčešći uzroci sekundarne hiperlipo - DM i hipotireoidizam. Hipotireoidizam - hiperLP kod 30% pacijenata - povećano stvaranje i usporen katabolizam LDL (preovladava porast holesterola). LpX - abnormalni LP bogat holesterolom, sporo se uklanja iz plazme pa prouzrokuje porast ukupnog holesterola u plazmi. Lečenje primarnog oboljenja - normalizacija lipidnog statusa Uticaj lekova Antihipertenzivi Estrogeni, gestageni Imunosupresivni lekovi

Uticaj lekova na lipidni status (izuzev hiperlipidemika) Diuretici, Beta-blokatori (propranolol) - hipertenzija - dozna zavisnost efekta na lipide. Beta-blokatori inhibiraju LCAT (pad HDL) i LPL (porast TG). Kontraceptivi - efekat zavisi od sadržaja estrogena i vrste i doze progestagena. Visok sadržaj progestagena (stariji kombinovani preparati) - raste LDL, opada HDL. Noviji preparati sa manje estrogena i sa progestagenima koji imaju slabije izražene androgene osobine - bolji lipidni status, ali povećani TG jer takvi progestageni ne mogu da antagonizuju efekat estrogena da povećavaju TG (VLDL). Holesterol se normalizuje 1 ciklus posle prestanka uzimanja kontraceptiva, TG duže. Ciklosporin - efekat traje 30 dana poprekidu terapije. Heparin - otpuštanje LPL u plazmu Fenobarbiton - indukcija hepatičnih mikrozomalnih enzima Lekovi za terapiju hiperLP nisu prikazani u tabeli

Uzimanje i obrada uzoraka krvi Uzimanje uzorka našte ili posle obroka Položaj tela Venska staza Serum ili plazma Izbor antikoagulansa Čuvanje uzoraka OBRISATI SLAJD Fasting - Posle unošenja obroka sa dosta masti, TG rastu posle 1 h, max posle 4h, ostaju povišeni do 9h.Lagan mešan opbrok mnogo manje povećava TG. Porast TG jako varira od osobe do osobe, prosečan maksimum je preko 2 x veći od vrednosti natašte. Postprandijalna lipemija je izrazitija kod muškaraca i kod starijih osoba. Direktno je srazmerna konc. TG natašte i apoB, a obrnuto koncentraciji HDL. Ukupan holesterol u proseku ne raste posle obroka, ali reakcija svih osoba nije ista. Dolazi do promene sadržaja holesterola i TG u raznim klasama LP. Sve ove vrednosti se vraćaju na koncentracije natašte posle 12h. Vrednosti ApoAI se ne menjaju. LDL opada (više po Friedewald-u), HDL (precipitacione metode) blago opada. Položaj tela Hemokoncentracija kod prelaza u stojeći položaj. Konc. Noradrenalina se menja kod ustajanja. Venska staza - Hemokoncentracija. Kapilarna ili venska krv - Razlika u rezultatima raznih studija. Razlike u vrednostima su više posledica različitih antikoagulanasa i analitičkih metoda. Serum ili plazma - Postoje razlike u rezultatima, koje su prouzrokovane efektima antikoagulanasa koji se koriste prilikom uzimanja krvi za dobijanje plazme. Antikoagulansi i konzervansi - Citrat i oksalat izazivaju izlazak znatne količine vode iz eritrocita (“razblaživanje” plazme). Kada se koristi oksalat dobija se 9-15% niži holesterol nego u serumu. EDTA je najčešće korišćen (3% niže vrednosti zbog preraspodele vode (pomnožiti dobijene vrednosti sa 1.03). Važno je da odnos EDTA i krvi bude pravilan, jer veća koncentracija EDTA povlači više vode iz Er. EDTA stabilizuje LP, pa deluje i kao konzervans (nekoliko uticaja na metabolizam: oksidacija m.k. i holesterola pod dejstvom jona bakra; inhibira fosfolipazu C koju sadrže neke bakterije, inhibira konverziju proapoAI u apoAI). Zato se kao uzorak najčešće koristi serum ili EDTA-plazma. Heparin dat in vivo snižava TG u uzorku (oslobađanje LPL u plazmu). Fluorid inhibira neke enz. Kod određivanja holesterola. Drugi konzervansi - aprotinin inhibira proteolizu apoB, diizopropilfluorofosfat proteolizu apoE i AII.

Uticaj promene položaja tela na vrednosti holesterola i triglicerida Trigliceridi Koncentracija (% od početne) Ležeći Stojeći Ležeći Stojeći Koncentracija (% od početne) Hemokoncentracija kod prelaza u stojeći položaj. Konc. Noradrenalina se menja kod ustajanja. Sledeća folija Pre venepunkcije, pacijent treba da sedi najmanje 5 minuta, a najbolje 15 minuta Sedeći Stojeći Sedeći Stojeći Vreme (min) Vreme (min)

Uticaj venske staze na nivo triglicerida ( ) i holesterola ( ) Povećanje koncentracije (% od početnih vrednosti) Hemokoncentracija. Ponovo folija Uzimanje i obrada uzoraka Prilikom uzimanja krvi, poveska sme da se drži najduže 1 minut Vreme (min)

Čuvanje uzoraka Ukupan holesterol Trigliceridi, HDL- i LDL-holesterol 0-4oC: do 4 dana zamrznuti uzorci (-20 ili -70oC): do 5 godina Trigliceridi, HDL- i LDL-holesterol veća stabilnost u EDTA-plazmi nego u serumu najbolje u svežim uzorcima zamrzavanje na -70oC Ukupan holesterol je stabilan, lako se čuva. Trigliceridi su osetljiviji od ukupnog holesterola (hidroliza), naročito u serumu, a manje u EDTA-plazmi. Različite studija su dale različite rezultate. LP frakcije je najbolje raditi u svežim uzorcima. Efekti čuvanja zavise od parametra i od metode (npr. TG - manji efekti kod metoda koje mere ukupan glicerol). Menja se struktura i sastav LP, što utiče na reagovanje sa antitelima kod imunohemijskih metoda i na dobijene rezultate određivanja pojedinih lipidnih komponenti. EDTA stabilizuje LP, dobro je plazmu odmah ohladiti na 2-4 stepena da se spreče promene u sastavu LP. Za duže čuvanje, bolje je zamrzavati na -70 nego na -20 mada apo B nešto opada kod zamrzavanja na ‘70. Posle odmrzavanja, uzorci se ne smeju ponovo zamrzavati.

Preporuke za svođenje preanalitičkih varijacija na minimum (1) Priprema pacijenta pre dolaska u laboratoriju Lipidni status treba ispitivati samo u stabilnom metaboličkom stanju. Pacijent treba da se hrani na uobičajeni način i da ne menja telesnu težinu najmanje dve nedelje pre ispitivanja. Pre donošenja odluke o terapiji, lipidni status treba ispitati u dva navrata u razmaku između 1 nedelje i 2 meseca. Pacijent ne sme da intenzivno vežba 24h pre uzimanja krvi. Za određivanje triglicerida i LDL-holesterola, uzorci se uzimaju isključivo našte, 12h od poslednjeg obroka.

Preporuke za svođenje preanalitičkih varijacija na minimum (2) Uzimanje i obrada uzoraka krvi Pre uzimanja uzoraka krvi, pacijent treba da sedi najmanje 5 minuta. Za vreme venepunkcije, povesku ne treba držati duže od 1 min. Parametri lipidnog statusa mogu da se određuju u serumu ili plazmi. Preporučuje se upotreba EDTA kao antikoagulansa, a plazmu treba što pre ohladiti na 2-4oC. Vrednosti dobijene u EDTA-plazmi množe se sa faktorom 1,03. Za određivanje ukupnog holesterola, uzorci se čuvaju na 4oC ili zamrznuti. Ukupan holesterol je stabilan u uzorcima zamrznutim na –20oC. Ako se određuju trigliceridi, HDL- i LDL-holesterol, treba zamrznuti uzorke na –70oC. Jednom odmrznuti uzorci ne smeju se ponovo zamrzavati. Ukupan holesterol je stabilan, lako se čuva. Trigliceridi su osetljiviji od ukupnog holesterola (hidroliza), naročito u serumu, a manje u EDTA-plazmi. Različite studija su dale različite rezultate. LP frakcije je najbolje raditi u svežim uzorcima. Efekti čuvanja zavise od parametra i od metode (npr. TG - manji efekti kod metoda koje mere ukupan glicerol). Menja se struktura i sastav LP, što utiče na reagovanje sa antitelima kod imunohemijskih metoda i na dobijene rezultate određivanja pojedinih lipidnih komponenti. EDTA stabilizuje LP, dobro je plazmu odmah ohladiti na 2-4 stepena da se spreče promene u sastavu LP. Za duže čuvanje, bolje je zamrzavati na -70 nego na -20 mada apo B nešto opada kod zamrzavanja na ‘70.

Interindividualna varijacija – udeo genetičkih faktora

Genetički faktori Pol Rasa Genetički polimorfizmi brojnih proteina povezanih sa metabolizmom lipoproteina Lp(a) Apolipoprotein E CETP Hepatična lipaza Lipoproteinska lipaza OBRISATI SLAJD?

Umesto zaključka

Vaša pitanja?

Osnovni parametri lipidnog statusa Ukupan holesterol LDL-holesterol HDL-holesterol Trigliceridi

Limone sul Garda Apo A-IMilano OBRISATI SLAJD

Apolipoprotein(a) Sastavni deo lipoproteina(a), skr. Lp(a) Prof. dr Zorana Jelić-Ivanović: Genetički faktori rizika za KVB 13.3.2017 Apolipoprotein(a) Sastavni deo lipoproteina(a), skr. Lp(a) Struktura Lp(a): slična LDL-čestici + molekul apo(a) Koncentracija Lp(a) je genetički kontrolisana. Apo (a) pokazuje strukturnu homologiju sa plazminogenom Lp(a) kompetuje sa plazminogenom i t-PA za vezivanje za fibrin i time ometa fibrinolizu. Polimorfizam – izoforme različite veličine (različit broj ponavljanja K4 tipa 2) Male izoforme – veće koncentracije Lp(a) i veći afinitet prema fibrinu – veći rizik za KVB Struktura čestica Lp(a) je vrlo slična strukturi LDL-čestica s tim što svaka čestica Lp(a) sadrži još i po jedan molekul apolipoproteina(a), pa se može reći da je LDL + Apo(a) = Lp(a). Apo(a) je po strukturi sličan plazminogenu. Plasminogen je prekursor aktivnog enzima, plazmina, koji je glavni nosilac procesa fibrinolize, zahvaljujući svojoj sposobnosti da razlaže fibrin. Zbog strukturne sličnosti, smatra se da Lp(a) kompetuje sa plazminogenom za vezivanje za fibrin i površinu endotelnih ćelija, čime inhibira fibrinolizu. Kao rezultat toga, povećava se rizik stvaranja tromba (fibrinoliza spada u antikoagulantne faktore). Takođe, apo(a) ima i adhezivne osobine, pa se lako vezuje za krvne sudove i prodire u subendotelni prostor. Zbog svojih adhezivnih karakteristika, on u subendotelu vezuje LDL, VLDL i kalcijum, ubrzavajući na taj način rast plaka, uz dalju akumulaciju Lp(a). Koncentracija Lp(a) u plazmi je vrlo različita kod raznih osoba i u najvećoj meri je genetski predodređena. Apo(a) pokazuje više različitih genetičkih polimorfizama, od kojih je najznačajniji veličinski polimorfizam. U okviru tog polimorfizma, otkriven je veći broj izoformi različize molekulske mase, a razlika u veličini apo(a) tih izoformi je posledica razlike u broju ponavljanja jednog dela molekula apo(a) koji se obeležava kao K4. Kod osoba bele rase, postoji obrnuta zavisnost između veličine izoforme apo(a) i koncentracije Lp(a) u plazmi. Veličinski polimorfizam nije jedini značajan polimorfizam apo(a). Takođe, ponavljajući polimorfizam pentanukleotidne sekvence TTTTA u promotoru APO (a) gena utiče na koncentraciju Lp(a) u belim populacijama. Dokazana je inverzna korelacija izmedju broja pentanukleotidnih ponavljanja i koncentracije Lp(a) sto se tiče bele populacije, ali ova korelacija nije dokazana i kod crne populacije. Koncentracije Lp(a) iznad 150 mg/L povezane su sa povećanim rizikom za KVB. Dakle, osobe koje nose genotipove sa manjim izoformama apo(a) i sa manjim brojem TTTTA ponavljnja sklonije su ishemijskim bolestima srca. FL – fosfolipidi, TG – trigliceridi, Hol – slobodan holesterol, HE – holesterol-estri Predmet: Faktori rizika za KVB 33

Apolipoprotein E Aleli: Genotipovi: Fenotipovi: 2/2 E2/E2 Homozigoti 2 3 4 Najčešći tip 3 Varijante se razlikuju po strukturi u 2 ostatka aminokiselina E3 - cistein, arginin E2 - Cys, Cys E4 - Arg, Arg Heterozigoti

Uticaj genetičkog polimorfizma apo E na lipidni status Fenotip apo E Ukupan holesterol LDL- holesterol HDL- holesterol Trigliceridi 2/2 2/3 3/3 3/4 4/4 8% ukupne interindividualne varijacije u konc. holesterola prouzrokovano je polimorfizmom apo E. Dugo se zna da E2 ima svega 1-2% afiniteta prema receptoru u odnosu na E3. Nagomilavanje IDL - Tip III. U novije vreme se sve više govori o povećanom riziku od KVB kod osoba koje su nosioci E4 (više vrednosti holesterola). E2 - Niži ukupan i LDL-holesterol, zbog veće aktivnosti LDL-receptora, koji ostaju slobodni za vezivanja LDL-apoB. Isto tako, manje je stvaranje LDL iz VLDL. Kod E4 je obrnuto (sniženje holesterola kod E2 veće je od povećanja kod E4). 4/4 - brzo uklanjanje remnanta iz plazme,nishodna regulacija LDL-receptora. Homozigotna forma E2/E2 - povećan rizik od KVB zbog nagomilavanja aterogenih IDL čestica uz povećanje TG, ali su heterozigoti verovatno sa manjim rizikom (nije sigurno utvrđeno). Noviji rezultati su pokazali da i veličina LDL-čestica raste od apo E2 ka E4 (raste i aterogeni rizik). Koncentracija samog apoE raste od E2 ka E4. Ta tabeli nije prikazana izoforma E2/E4, jer se u njoj potiru suprotni efekti formi E2 i E4 na lipidni status.

Frekvencija genotipova ApoE Aleli apo E Uobičajeni alel: ε3 Rizični alel: ε4 ε2 je rizičan samo kod homozigota (primarna hiperlipoproteinemija tip III) Frekvencija genotipova ApoE Aleli ε2 ε3 ε4 1–2% 15%   55% 25%

Prof. dr Zorana Jelić-Ivanović: Genetički faktori rizika za KVB 13.3.2017 Produkti alela 4, 3, 2 su tri izoforme apolipoproteinaE obeležene su kao apoE4, E3 i E2. Slika prikazuje frakcije apoE dobijene izoelektričnim fokusiranjem kod osoba sa tri različita homozigotna fenotipa apo E (E2/2, E3/3 i E4/4). Na slici su prikazane i aminokiseline koje se kod tri varijante nalaze u pozicijama 112 i 158. ApoE4 nosi najviše pozitivnog naelektrisanja i razlikuje se od apoE3 za jednu jedinicu naelektrisanja, a od apoE2 za dve. Predmet: Faktori rizika za KVB

Prof. dr Zorana Jelić-Ivanović: Genetički faktori rizika za KVB 13.3.2017 CETP CETP – holesterol-estar transferni protein Polimorfizam TaqIB – genotip B2B2 Snižena aktivnost CETP: Koncentracija HDL-c ↑ Koncentracija malih gustih LDL čestica ↓ Smanjen rizik za KVB Holesterol-estar transferni protein (CETP) katalizuje razmenu triglicerida iz lipoproteina bogatih trigliceridima (prvenstveno VLDL) sa estrima holesterola iz HDL-a, ali i i LDL-a (što doprinosi stvaranju malih, gustih LDL-čestica). Varijacije u genu koji kodira sintezu CETP, kao što je npr. TaqIB polimorfizam, utiče na koncentraciju HDL-holesterola u plazmi. B2 alel tog gena povezan je sa višim koncentracijama HDL-c, kao i smanjenim stvaranjem malih gustih LDL-čestica. Međutim, rizik za pojavu KVB značajno je snižen samo kod osoba sa homozigotnim genotipom B2B2. Predmet: Faktori rizika za KVB

Prof. dr Zorana Jelić-Ivanović: Genetički faktori rizika za KVB 13.3.2017 Hepatična lipaza (HL) Polimorfizam u promotoru gena: -480C→T Snižena aktivnost HL Koncentracija HDL-c ↑ Prečnik HDL čestica ↑ Koncentracija malih gustih LDL čestica ↓ Smanjen rizik za KVB Hepatična lipaza (HL) učestvuje u metabolizmu lipoproteina koji sadrže apo B, ali je vrlo značajna i u metabolizmu HDL-a, gde vrši konverziju većih HDL-čestica u manje (sa manjom protektivnom aktivnošću). Visoka aktivnost HL povezana je sa sniženim koncentracijama HDL-holesterola. Takođe, visoka aktivnost HL doprinosi povećanom stvaranju malih gustih LDL čestica. Polimorfizam u promotoru gena za HL - 480C→T dovodi do smanjene transkripcije gena, što smanjuje i aktivnost HL. Posledica niske aktivnosti HL su više koncentracije HDL-c veća i povećan prečnik HDL-čestica, što smanjuje rizik za KVB. Predmet: Faktori rizika za KVB

Lipoproteinska lipaza (LPL) Prof. dr Zorana Jelić-Ivanović: Genetički faktori rizika za KVB 13.3.2017 Lipoproteinska lipaza (LPL) 1. Ser 447 zamenjen stop kodonom Aktivnost LPL ↑ Koncentracija triglicerida ↓, koncentracija HDL-c ↑, Smanjen rizik za KVB 2. Gly188Glu Aktivnost LPL ↓ Koncentracija triglicerida ↑, koncentracija HDL-c ↓, Značajno povećan rizik za KVB LPL vrši hidrolizu triglicerida VLDL-a i hilomikrona do masnih kiselina i glicerola i učestvuje u stvaranju HDL-a. Najčešći polimorfizam u populacijama je Ser447Ter (zamena kodona za serin stop kodonom), sa nešto povećanom aktivnošću LPL. Kao posledica toga, kod osoba sa ovim polimorfizmom postoji izvesno sniženje koncentracije triglicerida i povećanje koncentracije HDL-a, pa je rizik za KVB nešto niži nego kod nosilaca uobičajenog genotipa. Drugi, ređi polimorfizam je Gly188Glu sa sniženom enzimskom aktivnošću LPL povećava rizik za KVB, jer su koncentracije triglicerida znatno povećane, a (prosečno za 78%), a HDL je snižen (za 0,25 mmol/L). Predmet: Faktori rizika za KVB