Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης για το πρόγραμμα ΕΣΠΑ 2014 Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Γελαδάρης Ιωάννης ΑΜ.: Υπεύθυνος Εργαστηρίου: Πολυδεύκης Χατζόπουλος Διάρκεια Πρακτικής Άσκησης: 14/07/2014 – 31/08/2014

Συνοπτική παρουσίαση πρακτικής άσκησης Κατά τη διάρκεια της πρακτικής άσκησης στο εργαστήριο Μορικής Βιολογία του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, μου δώθηκε η ευκαιρία να έλθω σε επαφή με δύο κύριες τεχνικές χειρισμού βιολογικού περιεχομένου, εκ των οποίων η μία είναι η «Απομόνωση γονιδιωματικού DNA με τη χρήση CTAB» σε φυτάρια Arabidopsis thaliana, ενώ η άλλη είναι η «Αλκαλική λύση βακτηριακών κυττάρων» από βακτήρια Escherichia coli τα οποία είχαν αναπτυχθεί σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό. Ακόμα χειρίστηκα τεχνικές όπως η «PCR», η «Πέψη γενετικού υλικού με τη χρήση κατάλληλων περιοριστικών ενζύμων», «Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης» και παρατήρηση του gel σε λάμπα υπεριώδους ακτινοβολίας, ενώ ακόμα παρασκεύασα θρεπτικό υλικό «1/2MS» στο οποίο τοποθέτησα προς ανάπτυξη σπόρους A. thaliana αγρίου τύπου αλλά και μεταλαγμάτων. Επίσης μελέτησα, μακροσκοπικά και μικροσκοπικά, φαινοτυπικούς χαρακτήρες σε φυτά αγρίου τύπου και μεταλαγμάτων Α. Thaliana, όπως το χρώμα και η ποιότητα των φύλλων και ο αριθμός εμβρύων σε καρποταξίες. Στη συνέχεια τα αποτελέσματα των φαινοτύπων αυτών τα εξέτασα χρησιμοποιώντας εργαλεία της Γενετικής και της Στατιστικής. Τέλος μπόρεσα να μάθω τεχνικές αποστήρωσης υπό κενό αέρος και υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας, και χρησιμοποίησα διάφορα εργαστηριακά εργαλεία(πιπέτες, τρυβλία κ.α) και μηχανήματα(φυγόκεντρος, συσκευη PCR, συσκευή Hood κα).

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA Το πρώτο βήµα σε όλες τις µεθόδους απομόνωσης γονιδιωματικού DNA είναι η διάρρηξη των µεµβρανών και η λύση των κυττάρων. Μερικές φορές ακολουθεί αποµάκρυνση του RNA (µε RNAσες, άλατα ή άλλες µεθόδους). Για την αποµάκρυνση των πρωτεϊνών από το DNA συνήθως γίνεται πέψη µε πρωτεϊνάσες. Τα υπολείµµατα των πρωτεϊνών αποµακρύνονται µε εκχύλιση µε διάλυµα κεκορεσµένου άλατος, οργανικη εκχύλιση ή πρόσδεση σε στήλη (ιοντανταλλαγής ή χρωµατογραφίας). Το DNA ανακτάται µετά από κατακρήµνιση µε αιθανόλη ή ισοπροπανόλη.

Υγρό άζωτο Γουδί CTAB διάλυμα για απομώνωση DNA  100mM Tris-HCL (pH 8.0)  20mM EDTA (pH 8.0)  1,4N NaCl  2% w/v CTAB  1% PVP Serag (24:1) Ισοπροπανόλη 70% v/v εθανόλη Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA Υλικά

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA Διαδικασία 1. Αφού παραλάβουμε το φυλλικό δείγμα από φυτάρια Α.thaliana, το λειοτριβούμε στο γουδί προσθέτοντας υγρό άζωτο με αποτέλεσμα το δείγμα να γίνει σκόνη και το προσθέτουμε σε σωληνάριο eppendorf. 1.Φυτάρια Α.thaliana

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 2. Προθερμαίνουμε το CTAB σε υδατόλουτρο 65 o C και προσθέτουμε έναν όγκο σε κάθε eppendorf με δείγμα και επωάζουμε για 10-30min στους 65 o C. 2. Εργαστηριακό υδατόλουτρο

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 3.Προσθέτουμε έναν όγκο από Sevag σε κάθε σωλήνα και στη συνέχεια ανακινούμε χρησιμοποιώντας τη συσκευή Vortex και έπειτα φυγοκεντρούμε για 2min, ενώ τέλος μεταφέρουμε το υγρό μέρος σε νέο καθαρό σωληνάριο. 3.Φυγόκεντρος

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 4. Προσθέτουμε 0,7 του όγκου ισοπροπανόλη, επωάζουμε για 10min και στη συνέχεια φυγοκεντρούμε για 15 min.

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 5. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και πλένουμε το ίζημα με 0,5ml 70% κρύας αιθανόλης και φυγοκεντρούμε για 3min. Επαναλαμβάνουμε και απομακρύνουμε την αιθανόλη αφήνοντας το ίζημα να στεγνώσει. 6. Επαναιωρούμε το DNA με 50μl νερό και το διατηρούμε στο πάγο.

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 7. Αφού αναμείξουμε το DNA με χρωστική, το τοποθετούμε στα «πηγάδια» του gel αγαρόζης που βρίσκεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, το «τρέχουμε» με τη βοήθεια ηλεκτρικού ρεύματος συγκεκριμένης τάσης 4.Συσκευή ηλεκτροφόρησης

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 8. Όταν διαχωριστεί το DNA από τα υπόλοιπα συσταρικά που μπορεί να υπάρχουν μαζί του, αφαιρούμε το gel αγαρόζης και το τοποθετούμε σε συσκευή που περιέχει λάμπα υπεριόδους ακτινοβολίας για να μπορέσουμε να αποτυπώσουμε καθαρά το DNA και κατά συνέπεια να επεξεργαστούμε σωστά τα αποτελέσματά μας. 9. Κόβουμε τα κομμάτια του gel που έχει πάνω του τα κλάσματα του DNA και επαδιαλύουμε την αγαρόζη με σκοπό να την αφαιρέσουμε και να κρατήσουμε και πάλι καθαρό το DNA.

Τεχνική Απομόνωσης Γονιδιωματικού DNA 5.Συσκευή UV με gel αγαρόζης 6.Αποτελέσματα απομόνωσης ύστερα απο φωτογράφιση του gel στον ηλεκτρονικό υπολογιστή