ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ 2Η ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ – ΒΑΚΤΗΡΙΑ – ΚΑΤΗΓΟΡΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ - ΤΕΧΝΙΚΕΣ

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ (Key Words)

ΕΥΚΑΡΥΩΤΕΣ PROKARYOTES BACTERIA ARCHAEA 3

ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΕΣ (Βακτήρια) Ευβακτήρια ή «Αληθή» βακτήρια Ανθρώπινα παθογόνα Κλινικά ή περιβαλλοντικά Ένα βασίλειο Πεπτιδογλυκάνη (μουρείνη): peptidoglycan (murein) Mουραμικό οξύ (muramic acid) Αρχαία Περιβαλλοντικοί μόνο οργανισμοί Δεύτερο βασίλειο; Ψευδομουρείνη (pseudomurein) Δεν φέρουν μουραμικό οξύ (no muramic acid) Διαφορές αλληλουχίας στο 16S rRNA 5

N-Acetyl-Glucosamine (NAG), N-Acetyl-Muramic acid (NAM), N-Acetyl-Talosamic acid (NAT)

Προκαρυωτικά σε αντιδιαστολή με τα Ευκαρυωτικά κύτταρα Μη-διαμερισματοποιημένα Οι κυτταρικές μεμβράνες στερούνται στερολών (π.χ. χολοστερόλης) Μονήρη κυκλικά χρωμοσώματα Ριβοσωμικά RNA 70S - υπομονάδες 30S (16S rRNA) 50S (5S & 23S rRNA) 8

Η Οξειδωτική Φωσφορυλίωση γίνεται στην κυτταρική μεμβράνη (αφού δεν υπάρχουν μιτοχόνδρια). Τοίχωμα Κυτταρόπλασμα Μεμβράνη Το κυτταρικό τοίχωμα έξω από την μεμβράνη είναι άκαμπτο και προστατεύει από αλλαγές στην οσμωτική πίεση. 9

Όλα τα κύτταρα, προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά έχουν ριβοσώµατα

Ευκαρυωτικά Προκαρυωτικά Gram + Gram - (π.χ. ζώα) Flagellum Nucleoid Rough endoplasmic reticulum Cell membrane Cell wall Nucleus Gram - Cell (inner) membrane Outer membrane Ribosomes Granule Cell wall Capsule Pili Cytoplasm Mitochondria 11

Βακτήρια με Πλασμίδια Φέρουν Πλασμίδια (Plasmids) Τι είναι τα πλασμίδια; Σε ορισμένα βακτήρια, εκτός από το γενετικό υλικό τους, που είναι ένα κυκλικό μόριο DNA μήκους 1 mm, υπάρχουν πλασμίδια. Τα πλασμίδια είναι κυκλικά μόρια DNA, 100 φορές μικρότερα από το κύριο κυκλικό μόριο και μπορούν να αντιγράφονται ανεξάρτητα απ’ αυτό. Περιέχουν γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά και γονίδια που τους επιτρέπουν να μεταφέρονται από βακτήριο σε βακτήριο. 12

Πλασμίδια Πρόκειται για εξωχρωμοσωμικά DNA (Extra-chromosomal DNA) Βρίσκονται σε πολλαπλά αντίγραφα Κωδικοποιούν - Παράγοντες παθογένειας (pathogenesis factors) - Παράγοντες αντίστασης στα αντιβιοτικά (antibiotic resistance factors)

ΜΗ ΕΝΣΩΜΑΤΟΥΜΕΝΑ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ (a) ΚΑΙ ΕΠΙΣΩΜΑΤΑ (b)

Ο Κυτταρικός Φάκελλος του Βακτηρίου Gram Stain Gram θετικά βακτήρια Gram αρνητικά βακτήρια 15

Η ΧΡΩΣΗ GRAM Η χρώση κατά Gram είναι µέθοδος χρώσης βακτηρίων που δίνει δυνατότητα αναγνώρισής τους. Η µέθοδος επινοήθηκε πριν από 100 περίπου χρόνια από τον Δανό γιατρό Hans Gram. Η µέθοδος συνίσταται στην κατ' αρχή χρώση µε ιώδες της γεντιανής (gentian violet), στη συνέχεια ακολουθεί επεξεργασία µε το διάλυµα Gram που αποτελείται από 1 µέρος ιώδιο, 2 µέρη ιωδιούχο κάλιο και 300 µέρη νερό. Ύστερα από έκπλυση µε αιθυλική αλκοόλη τα βακτήρια είτε διατηρούν ένα βαθύ µπλε χρώµα είτε αποχρωµατί-ζονται τελείως. Καµιά φορά χρησιµοποιείται και κάποια άλλη χρωστική όπως η φουξίνη ή η εοζίνη για να γίνουν πιο ορατά τα αποχρωµατισµένα βακτήρια.

Η ΧΡΩΣΗ GRAM Τα βακτήρια που διατηρούν τη μπλε χρωστική χαρακτηρίζονται ως Gram θετικά, ενώ εκείνα που αποχρωματίζονται, Gram αρνητικά. Μερικοί μικροοργανισμοί που άλλοτε διατηρούν τη χρωστική και άλλοτε όχι χαρακτηρίζονται Gram μεταβλητοί. Χαρακτηριστικά Gram θετικά βακτήρια είναι οι σταφυλόκοκκοι. Χαρακτηριστικά Gram αρνητικά βακτήρια είναι οι βάκιλοι που προκαλούν τον κοκίτη ενώ χαρακτηριστικά Gram μεταβλητοί είναι οι βάκιλοι που προκαλούν τη φυματίωση. Η διαφορά αυτή στη χρώση οφείλεται στη διαφορετική λεπτή δοµή των κυτταρικών τοιχωμάτων τους.

Gram+, Gram-

Χρώση Gram για Mycobacterium tuberculosis

Η ΧΡΩΣΗ GRAM Τα κυτταρικά τοιχώματα των θετικών κατά Gram βακτηρίων αποτελούνται κυρίως από πεπτιδογλυκάνες, ενώ τα κυτταρικά τοιχώματα των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων αποτελούνται από δυο στρώσεις, ένα λεπτό στρώµα από πεπτιδογλυκάνες και µια εξωτερική µεµβράνη από λιποπρωτεΐνες και λιποπολυσακχαρίτες. Η διαφορετική αυτή χρώση δίνει τη δυνατότητα στους µικροβιολόγους να κατατάσσουν τα βακτήρια σε τρεις κατηγορίες, τα βακτήρια χωρίς τοιχώματα, τα αρνητικά κατά Gram και τα θετικά κατά Gram.

GRAM ΘΕΤΙΚΟ GRAM ΑΡΝΗΤΙΚΟ Cytoplasm Cytoplasm Periplasmic space Lipoteichoic acid Peptidoglycan-teichoic acid Cytoplasmic membrane Cytoplasm GRAM ΑΡΝΗΤΙΚΟ Lipopolysaccharide Porin Outer Membrane Braun lipoprotein Periplasmic space Inner (cytoplasmic) membrane Cytoplasm 22

Διαφορές στην εξωτερική μεμβράνη Gram αρνητικά βακτήρια Κύριος φραγμός διαπερατότητας (major permeability barrier) Χώρος μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης περιπλασμικός χώρος (periplasmic space): Ο χώρος που περιλαμβάνεται μεταξύ της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και της εξωτερικής μεμβράνης καλείται περιπλασμικός χώρος, μέσα στον οποίο ανευρίσκονται διάφορα ένζυμα. αποθήκευση λυτικών ενζύμων Gram θετικά βακτήρια Δεν έχουν περιπλασμικό χώρο 23

GRAM ΑΡΝΗΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΦΑΚΕΛΛΟΣ Outer Membrane (Major permeability barrier) Lipopolysaccharide Porin Braun lipoprotein Periplasmic space Degradative enzyme Periplasmic binding protein Permease Inner (cytoplasmic) membrane Cytoplasm 24 24

Ο Λιποπολυσακχαρίτης, LPS Ο LPS χορηγούμενος σε πειραματόζωα αλλά και στον άνθρωπο προκαλεί πληθώρα παθοφυσιολογικών καταστάσεων, όπως: πυρετό, διαταραχές του μεταβολισμού, λευκοκυττάρωση, λευκοπενία, υπόταση, κυκλοφορική ανεπάρκεια (shock) ακόμα και θάνατο. Λόγω της θέσης που κατέχει στο κυτταρικό τοίχωμα των Gram αρνητικών βακτηρίων και των τοξικών του συνεπειών ονομάζεται και ενδοτοξίνη.

Δοκιμή Πυρογόνων - Πυρετογόνων Δοκιμή Λίμουλους – Limulus test

Pyrogen free materials Limulus test: Gram-positive bacteria do not cause degranulation of the horseshoe crab hemocytes. Morphological examination of hemocytes in contact with Gram-positive bacterium S. aureus and Gram-negative bacterium P. aeruginosa. Factor C activity was assayed to indicate whether the hemocytes had degranulated. Samples were tested with and without LPS, in case Factor C was exocytosed in its inactive precursor form. The histobars show dose-dependent increase in the fluorescent product formed by increasing levels of LPS which activated the Factor C. The inset shows that after incubation with S. aureus, hemocytes aggregated at the bottom of pyrogen-free borosilicate glass tube appearing as a dense button of cells. In contrast, P. aeruginosa, a Gram-negative bacterium with LPS, caused hemocyte degranulation, thus, the absence of such aggregation of hemocytes as they were degranulated. Scale bar, 10 μm in (a).

Πορίνες Η εξωτερική μεμβράνη των Gram αρνητικών βακτηρίων είναι μια διπλοστοιβάδα φωσφολιπιδίων, που φέρει μόρια λιποπολυσακχαριτών και ένα σύστημα πρωτεϊνών. Η εξωτερική μεμβράνη αφενός μεν δεν αφήνει να μετακινηθούν οι πρωτεΐνες του περιπλασμικού χώρου, αφετέρου δε προφυλάσσει το βακτηριακό κύτταρο από διάφορους παράγοντες βλαπτικούς π.χ. ένζυμα υδρολυτικά. Δρα επίσης, ως ηθμός και αφήνει μόνο μικρού Μ.Β. υδρόφιλες ουσίες να εισέλθουν ενώ μεγαλύτερες ουσίες όπως για παράδειγμα τα αντιβιοτικά διέρχονται δυσκολότερα.

Πορίνες Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα Gram αρνητικά βακτήρια να εμφανίζουν μεγαλύτερη αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά από ότι τα Gram θετικά βακτήρια. Η ιδιότητα της εξωτερικής μεμβράνης να δρα προστατευτικά αποκλείοντας τη διέλευση βλαβερών για το βακτήριο μορίων, οφείλεται στο σύστημα των πρωτεϊνών της, τις ονομαζόμενες πορίνες.

GRAM ΘΕΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΦΑΚΕΛΛΟΣ Degradative enzyme Peptidoglycan-teichoic acid Lipoteichoic acid Cytoplasmic membrane Cytoplasm 31 31

Βακτηριολυτικά ένζυμα, π.χ. λυσοζύμη Λυσοζύμη είναι ένζυμο που διασπά τις πεπτιδογλυκάνες από το κυτταρικό τοίχωμα των ευαίσθητων βακτηρίων. Η λυσοζύμη καταστρέφει ορισμένα Gram θετικά βακτήρια και δεν είναι γενικά δραστική στα αρνητικά λόγω της διαφοράς στο κυτταρικό τοίχωμα. OM= Outer Membrane PG= PeptidoGlycan CM= Cytoplasmic Membrane

Μερικά βακτήρια είναι κινητά Κινησιογόνα οργανίδια – μαστίγια ΜΑΣΤΙΓΙΑ (FLAGELLA) Μερικά βακτήρια είναι κινητά Κινησιογόνα οργανίδια – μαστίγια Ανιχνεύουν το περιβάλλον Αντιδρούν στην παρουσία τροφής και δηλητηρίων - χημειοταξία Μαστίγια - Πακτωμένα στην κυτταρική μεμβράνη - Προέχουν σαν αλυσίδες - Υπομονάδες Φλαγελλίνης (Flagellin) - Κινούνται με σπειροειδή κίνηση και δρουν ως «προπέλες» του βακτηρίου 34

Flagellum of Gram-negative Bacteria

ΜΑΣΤΙΓΙΑ (FLAGELLA) Τα Escherichia coli κύτταρα χρησιμοποιούν μακρές, λεπτός δομές που ονομάζονται μαστίγια για να έχουν ώθηση. Αυτές περιστρέφονται αριστερόστροφα, δημιουργώντας μια ροπή που προκαλεί το βακτήριο να περιστρέφεται δεξιόστροφα.

Η ΔΙΑΦΟΡΑ ΤΩΝ ΜΑΣΤΙΓΙΩΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΒΛΕΦΑΡΙΔΕΣ (CILIA, π. χ

Αξονικά νημάτια (Axial filaments) Σπιροχαίτες (spirochetes), ωχρά σπιροχαίτη Παρόμοια λειτουργία με τα μαστίγια Αναπτύσονται κατά μήκος του κυττάρου Εκτελούν οφιοειδείς (snake-like) κινήσεις Τριχίδια (Pili) ή Ινίδια (fimbriae) Τριχοειδείς (hair-like) προεκτάσεις του κυττάρου Φυλετική σύνδεση (sexual conjugation) Προσκόλληση (adhesion) στα επιθήλια του ξενιστή 38

Ο σχηματισμός μορφών χωρίς τοίχωμα (Wall-less) Προκύπτουν από τη δράση: ενζύμων που διαλύουν το κυτταρικό τοίχωμα αντιβιοτικών που αναστέλλουν τη βιοσύνθεση πεπτιδογλυκάνης (peptidoglycan biosynthesis) Συνήθως μη-βιώσιμες μορφές (non-viable) Μη διπλασιαζόμενα βακτήρια χωρίς τοίχωμα: σφαιροπλάστες (spheroplasts) με εξωτερική μεμβράνη πρωτοπλάστες (protoplasts) χωρίς εξωτερική μεμβράνη Διπλασιαζόμενα βακτήρια χωρίς τοίχωμα: L μορφές (στελέχη που στερούνται τοιχώματος) Γένος (Genus) βακτηρίων χωρίς τοίχωμα: Mycoplasma 39

Μυκοπλάσματα Το Μυκόπλασμα (Mycoplasma) είναι γένος βακτηρίων που δεν διαθέτουν κυτταρικό τοίχωμα σε αντίθεση με τα κοινά βακτήρια. Χωρίς κυτταρικό τοίχωμα, είναι ανεπηρέαστα από πολλά αντιβιοτικά όπως η πενικιλίνη και τα αντιβιοτικά β-λακτάμης, τα οποία στοχοποιούν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος. Μπορούν να είναι παρασιτικά ή σαπροφυτικά. Αρκετά είδη είναι παθογόνα για τον άνθρωπο με σημαντικότερο εκπρόσωπο το είδος M. pneumoniae που προκαλεί άτυπη πνευμονία και αναπνευστικές διαταραχές.

Περιβλήματα και στοιβάδες βλέννας Capsules and slime layers Εξωτερικά περιβλήματα (outside cell envelopes) Αν είναι σαφώς περιγεγραμμένα: Περιβλήματα (capsules) Μη-σαφώς περιγεγραμένα: στοιβάδες βλέννας ή γλυκοκάλυκας (slime layer or glycocalyx) Συνήθως πολυσακχαριδικά (polysaccharide) Συχνά χάνονται σε καλλιέργειες in vitro Προστατευτικά in vivo 41

Ενδοσπόρια (Endospores) ή Σπόροι (spores) Σχηματίζονται από αδρανή (Dormant) βακτήρια Παράγονται από κύτταρα που λιμοκτονούν Ανθίστανται σε αντίξοες συνθήκες - υψηλές θερμοκρασίες - οργανικούς διαλύτες Περιέχουν διπικολινικό ασβέστιο (calcium dipicolinate): θερμοανθεκτικότητα Ανάμεσα σε άλλα εμφανίζονται στα γένη Bacillus και Clostridium (αναερόβια) 43

Παραλλαγές στη μορφολογία των ενδοσπορίων: (1, 4) κεντρικά ενδοσπόρια, (2, 3, 5) τερματικά ενδοσπόρια, (6) πλευρικά ενδοσπόρια. Χρωματισμένο παρασκεύασμα του Bacillus subtilis δείχνει τα ενδοσπόρια πράσινο και τα σποριογόνα κύτταρα με κόκκινο

Καλλιέργεια και ταυτοποίηση των μολυσματικών παραγόντων 45

Λέξεις Κλειδιά (Key Terms) Μετά την καλλιέργεια Βιοχημικά tests π.χ. ζύμωση λακτόζης Γενετικά tests Αλληλούχηση DNA - Sequencing, Polymerase chain reaction (PCR) DNA-DNA ομολογία - υβριδοποίηση Περιοριστικά ένζυμα Restriction enzymes (digests) Χημικά «αποτύπωμα» Chemical - fatty acid/protein profiling/fingerprinting Ανοσολογικά tests – Immunological tests Άμεση ταυτοποίηση (π.χ. χωρίς καλλιέργεια) PCR Ανίχνευση αντιγόνων - Antigen detection Χρώση - Staining (e.g. Gram stain) Ορολογικά - Serology (antibody detection) Απομόνωση - Isolation (culture) Αποικίες άγαρ - Agar plate plate/colonies Θρεπτικά υγρά - Liquid media Ταυτοποίηση και ταξινόμηση Identification & taxonomy Οικογένεια - Family Γένος - Genus Είδος - Species Τύπος - Type Στέλεχος - Strain 46

Ταξινόμηση (Taxonomy) Καθορίζει κοινά χαρακτηριστικά ανάμεσα σε στελέχη ενός βακτηριακού είδους Συνήθως είναι γενετική ταξινόμηση Επιτρέπει την ανάπτυξη διαγνωστικών τεστ 47

Κατηγοριοποίηση (Classification) επαγωγικά - απαγωγικά Στέλεχος, μία μονήρης απομόνωση ή σειρά. (Strain: one single isolate or line). Τύπος και ενίοτε παθότυπος, ένα υποσύνολο του είδους. (Type: sub-set of species). Είδος, στενά συγγενικά στελέχη. (Species: related strains). Γένος, στενά συγγενικά είδη. (Genus: related species). Οικογένεια, στενά συγγενικά γένη. (Family: related genera). 48

Αναγνώριση μολυσματικών παραγόντων στο διαγνωστικό εργαστήριο Αναγνώριση (ταυτοποίηση) του «αιτίου» Κρίσιμες θεραπείες (π.χ. Aids treatment) Βοηθά την επιλογή ειδικών αντιβιοτικών (Helps specific antibiotic selection) Γενικό νοσοκομειακό εργαστήριο (General hospital laboratory) Φυσιολογικές/βιοχημικές δοκιμές (Physiological/biochemical tests) Εργαστήρια αναφοράς (Reference laboratories) Γενετικές δοκιμές (Genetic tests) 49

Βήματα απομόνωσης και ταυτοποίησης «Steps in isolation and identification» Βήμα 1ο : Ενοφθαλμισμός με κρίκο στερών καλλιεργειών σε τρυβλία (Streaking culture plates) Μορφολογία αποικιών μετά την επώαση (colonies on incubation e.g. after 24 hr) Μέγεθος, υφή, χρώμα, αιμόλυση (size, texture, color, hemolysis) Απαιτήσεις σε οξυγόνο (oxygen requirement) 50

Καλλιέργεια σε αιματούχο άγαρ «Sheep blood agar plate culture» Bacillus anthracis Bacillus cereus 51

Μικτές αποικίες «Mixed colonies» 52

Απομόνωση και Ταυτοποίηση-1 Isolation and identification Βήμα 2ο : Οι αποικίες χρωματίζονται κατά Gram τα κύτταρα παρατηρούνται με τη βοήθεια μικροσκοπίου (cells are observed microscopically) 53

Μορφολογία μετά την χρώση Gram «Gram stain morphology» Σχήμα - Shape Κόκκοι (σφαιρικοί) - cocci (round) Βάκιλοι (βακτηρίες, κύλινδροι) - bacilli (rods) Σπείρες ή καμπύλες - spiral or curved (e.g. spirochetes) Μονήρη ή πολλαπλά κύτταρα - Single or multiple cells Ομάδες (π.χ. σταφυλόκοκκοι) - clusters (e.g. staphylococci) Αλυσίδες (π.χ. στρεπτόκοκκοι) -chains (e.g. streptococci) Θετικά ή αρνητικά κατά Gram - Gram positive or negative 55

56

57

Βήμα 3ο : Απομόνωση βακτηρίων και αναγνώριση του είδους Γενικά χρησιμοποιώντας φυσιολογικές και βιοχημικές δοκιμές. 59

Ο Εργαστηριακός Πάγκος Clinical Microbiology Laboratory Bench 60

ΕΝΑ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΥ/ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΥ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΥ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΕΝΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ

Δοκιμή αντοχής/ευπάθειας στα αντιβιοτικά Βήμα 4ο : Δοκιμή αντοχής/ευπάθειας στα αντιβιοτικά 62

Δοκιμασίες ευπάθειας στα αντιβιοτικά Antibiotic susceptibility testing Ευπαθές Ανθεκτικό Bacterial lawn Growth No growth Antibiotic disk 63

Μοριακή διαφοροποίηση Molecular differentiation Γενωμική - Genomics Χαρακτηρισμός γόνων - Gene characterization Αλληλούχηση - Sequencing PCR Περιοριστικά κλάσματα - Restriction digests Υβριδοποίηση - Hybridization Αναλογίες βάσεων (% guanine + cytosine) 64

Αλληλούχηση συγκεριμένων περιοχών 16S rRNA Sequencing Διαφοροποιεί τα βακτηριακά είδη - Differentiates bacterial species Ανάπτυξη κλινικών δοκιμών που στηρίζονται στην αλληλούχηση - Development of clinical tests based on sequence (e.g. PCR) 65

(Real-time) Πραγματικού χρόνου PCR ds DNA Cycle one Dye Cycle two Cycle 30 2 30 66

DNA-DNA Υβριδοποίηση (hybridization) Strain 1 Heat + Strain 2 0% Homology 100% Homology 67

Αποτυπώματα και Περιγράμματα (Profiles) Λιπαρά οξέα μακράς αλυσίδας Long chain fatty acids - structural (e.g. cell membrane) Μεταβολίτες βραχείας αλυσίδας - Short chain - Απλοί μεταβολίτες - metabolic - Πτητικοί μεταβολίτες – volatiles - Αλκοόλες – alcohols - Περίγραμμα πρωτεϊνών (Protein profiling): defining a species by characteristic proteins - Πρωτεομική - Proteomics: defining all proteins expressed by a species under specific growth conditions 68

Δοκιμές συγκόλλησης π.χ. Streptococcal Agglutination Test antigenic extract Antibody Latex beads 69

Άμεση αλληλούχηση Bacterial DNA sequences amplified directly from human body fluids Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης Polymerase chain reaction (PCR) Επιτυχία στην άμεση διάγνωση της φυματίωσης 70

Μικροσκόπηση - Microscopy Απλό Μικροσκόπιο Εγκεφαλονωτιαίο υγρό Πτύελα Μικρή εξειδίκευση Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο: Λεπτομέρεια Υψηλής ευκρίνειας 71