Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ Journal : Biomaterials, October 2009;30 Publisher : Elsevier Original Paper :

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ Journal : Biomaterials, October 2009;30 Publisher : Elsevier Original Paper :"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ Journal : Biomaterials, October 2009;30 Publisher : Elsevier Original Paper : Biomechanical silk protein-based gene delivery systems Researchers : Keiji Numata, Balajikarthick Subramanian, Heather A. Currie, David L. Kaplan Επιμέλεια Παρουσίασης : Μαρκουλάκη Βασιλική Ημερομηνία : 9/12/2010 Μάθημα : Βιοοργανικές Νανοδομές 1

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ.3 : ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σελ.4 : 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σελ.7 : 2.1 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΑΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ Σελ.11 : 2.2 ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ : Σελ.14 : 2.3 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΧΑΡ/ΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ ΙΟΝΤΟΣ Σελ.22 : 2.4 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΤΑΙΝΙΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΣΥΜΠΛΟΚΑ pDNA : Σελ.27 : 2.5 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Σελ.32 : 2.6 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑ Σελ.34 : 3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Σελ.35 : 4.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Σελ.36 : 5.ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Σελ.37 : ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι πρωτεϊνες μεταξιού είναι πολύ χρήσιμες στην παράδοση γονιδίων γιατί αυτοοργανώνονται σε πολύ ισχυρές δομές,είναι βιοδιασπώμενες και μη κυτταροτοξικές. Γι’αυτό το λόγο,η γενετική μηχανική επεμβαίνει κατασκευαστικά ώστε να μπορούμε να ελέγξουμε αυτά τα συστήματα παράδοσης γονιδίων. Σε αυτή την εργασία,περιληπτικά έγιναν τα εξής : 1.Κατασκευή συστάδων συμπολυμερών μεταξιού με πολυλυσίνη. 2.Τα συμπολυμερή μεταξιού-πολυλυσίνης μαζί με pDNA σχηματίζουν ιοντικά συμπλέγματα. 3.Προετοιμασία των παραπάνω για παράδοση γονιδίων σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα. 4.Χαρακτηρισμός των συστημάτων με διάφορες μεθόδους. 5.Ακινητοποίηση των συμπλεγμάτων pDNA σε ταινίες μεταξιού. 6.Αποτελέσματα και συζήτηση 3

4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τι είναι η παράδοση γονιδίων; Είναι η διαδικασία εισαγωγής «ξένου» DNA σε κύτταρα-ξενιστές,και αποτελεί απαραίτητο βήμα π.χ.για γονιδιακή θεραπεία και για γενετική μετατροπή των σοδειών. Γιατί προτιμούμε τις πρωτεϊνες μεταξιού για γονιδιακή παράδοση; 1.Διαλυτότητα και ικανότητα βιοδιάσπασης υλικών βασισμένα σε μετάξι ελέγχονται από 2οταγή δομή → σχεδιασμός βιοϋλικών με επιλεκτικές ιδιότητες. 2.Όταν μετατρέπονται με τη βοήθεια της γενετικής μηχανικής παρουσιάζουν νέες ιδιότητες π.χ. αυξημένη κυτταρική προσρόφηση. *Γι’αυτό άλλωστε χρησιμοποιήθηκε fibroin στην εργασία αυτή ως πρωτεϊνη μεταξιού.Έχει εξερευνηθεί εκτεταμμένα σα βιοϋλικό για καλλιέργεια κυττάρων και μηχανική ιστών και έχει κερδίσει έγκριση FDA. 4

5 Γιατί χρησιμοποιήθηκε πολυλυσίνη σε αυτήν την εργασία; 1.Είναι φυσικό βιοπολυμερές 2.Χρησιμοποιείται ως κατιοντικό πολυμερές για το σχηματισμό «οχημάτων» παράδοσης για μικρά φάρμακα(τα κατιοντικά πολυμερή και αμινοξέα αλληλεπιδρούν με το DNA,μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και σχηματίζουν συμπλέγματα πολυηλεκτρολυτών) 3.Είναι χρήσιμος μη φυσικός-ιός γενετικός φορέας 4.Είναι βιοδιασπώμενη 5.Έχει χαμηλή κυτταροτοξικότητα 6.Προσφέρει ευκαμψία στο μέγεθος του συμπλόκου pDNA 7.Μπορεί να στοχεύσει συγκεκριμένους τύπους κυττάρων Γιατί χρησιμοποιήθηκε πλασμιδικό DNA (pDNA) ; Μπορεί να παράγει βιοενεργές πρωτεϊνες στα τροποποιημένα κύτταρα του ξενιστή 5

6 !! ΓΕΝΙΚΑ,ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΜΑΣΤΕ ΝΑ ΣΧΕΔΙΑΣΟΥΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ,ΠΟΥ ΝΑ ΜΗΝ ΕΙΝΑΙ ΦΥΣΙΚΟΙ ΙΟΙ,ΒΑΣΙΣΜΕΝΟΥΣ ΣΤΟ ΜΕΤΑΞΙ,ΜΗ-ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΥΣ, ΒΙΟΔΙΑΣΠΩΜΕΝΟΥΣ,ΠΟΥ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝ ΜΗ ΤΟΞΙΚΑ ΚΑΤΙΟΝΤΙΚΑ ΠΟΛΥΜΕΡΗ !! 6

7 2.1 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΑΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ 1. Απομόνωση τμήματος DNA της πρωτείνης MaSp1 από την αράχνη Nephila Clavipes. Το τμήμα αυτό του DNA είναι δίκλωνο και ο κάθε κλώνος αποτελείται από την εξής ακολουθία: Lys-a: 5’-CTAGC-AAG-AAA-AAG-AAA-AAA-AAG-AAA- AAA-AAG-AAA-AAG-AAA-AAA-AAG-AAA-A-3’ Lys-b: 3’-G-TTC-TTT-TTC-TTT-TTT-TTC-TTT-TTT-TTC- TTT-TTC-TTT-TTT-TTC-TTT-TGATA -5’ *Οι υπογραμμισμένες περιοχές με πλάγια γράμματα ονομάζονται περιοριστικές περιοχές και χρησιμεύουν στο να διασπαστούν τα μόρια του DNA σε συγκεκριμένα θραύσματα,που είναι ευκολότερο να αναλυθούν και να χρησιμοποιηθούν,απ’ότι το αρχικό μεγάλο μόριο. 7

8 2. Οι 2 κλώνοι (Lys-a και Lys-b) που παρουσιάστηκαν πριν,είναι συμπληρωματικοί ο ένας προς τον άλλον και σχηματίζουν DNA διπλής έλικας(με θέρμανση των 2 κλώνων για διάσπαση δεσμών και επανασύνδεσή τους). 3. Αυτό το DNA αρχικά περιείχε 15 τριπλέτες που κωδικοποιούν λυσίνη. Πολυμερίστηκε προς σχηματισμό διμερούς(2x15=30 τριπλέτες που κωδικοποιούν λυσίνη) και τριμερούς(3x15=45 τριπλέτες) 4)Τέλος,το καθένα από τα παραπάνω συνδέθηκε με το pET30-6μερές προς σχηματισμό : 1)pET30-6μερές (δε συνδέθηκε με DNA) 2)pET30-6μερές-15 τριπλέτες που κωδικοποιούν λυσίνες 3)pET30-6μερές-30 τριπλέτες που κωδικοποιούν λυσίνες 4)pET30-6μερές-45 τριπλέτες που κωδικοποιούν λυσίνες 8

9 Τι είναι το pET30-6μερές; Βακτηριακό πλασμίδιο Ανθεκτικό στην καναμυκίνη Χρησιμεύει στην κλωνοποίηση και μετάφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στην Ε.Coli 9

10 Αριστερά : Ο «χρυσός» ιστός της αράχνης Nephila Clavipes Δεξιά : Η θηλυκή αράχνη Nephila Clavipes και ο κατά πολύ μικρότερος αρσενικός της σύντροφος 10

11 2.2 ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ Τα pET30-6μερές, pET30-6μερές-15λυσίνες, pET30- 6μερές-30λυσίνες και pET30-6μερές-45λυσίνες εισάχθηκαν σε κύτταρα Ε.Coli: 1.Καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό στους 37˚C. 2.Πρωτεϊνική μετάφραση. 3.Συλλογή κυττάρων με φυγοκέντρηση στα 13,000g, μετά από 4 περίπου ώρες πρωτεϊνικής μετάφρασης. 4.Εφαρμογή κυττάρων σε denaturing buffer(διαβρωτικό ρυθμιστικό διάλυμα,100mM NaH2PO4,10mM Tris- HCl,8M urea pH=8.0) και λύση αυτών με ελαφρά ανακίνηση για 12 ώρες και φυγοκέντρηση στα 13,000g στους 4˚C για 30 λεπτά. 5.Έκλουση πρωτεϊνών με Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE). 11

12 Λίγα λόγια για τη μέθοδο SDS-PAGE Λίγα λόγια για τη μέθοδο SDS-PAGE Είναι μία τεχνική χρωματογραφίας,ευρέως χρησιμοποιούμενη στη βιοχημεία,γενετική,μοριακή βιολογία για το διαχωρισμό των πρωτεινών ανάλογα με το μήκος της πολυπετιδικής αλυσίδας ή το ΜΒ. Προετοιμασία δείγματος Μέθοδος SDS-PAGE 12

13 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ&ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ A.MΒ πριν τον καθαρισμό των πρωτεϊνων B.ΜΒ μετά τον καθαρισμό Σειρά 1.6μερές μεταξιού 2.6μερές μεταξιού-15λυσίνες 3.6μερές μεταξιού-30λυσίνες 4.6μερές μεταξιού-45 λυσίνες Μ. Πρότυπες πρωτεϊνες Πειραματικά ΜΒ Η σειρά 1 και στις δύο εικόνες δείχνει ΜΒ γύρω στα 27kDa,ενώ οι 2-4 γύρω στα 30 kDa Θεωρητικά ΜΒ kDa 3.25 kDa 4.27 kDa *1 amu=1 Da=1,66x10^(-27) kg Η πρωτεϊνική ταυτοποίηση έδειξε ότι οι βιομηχανικές πρωτεϊνες ήταν οι αναμενόμενες ανασυνδυασμένες,και ότι ήταν μερικώς διαλυτές σε νερό και διαλυτές σε HFIP, σε θερμοκρασία δωματίου. 13

14 2.3 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΧΑΡ/ΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ ΙΟΝΤΟΣ Τι εννοούμε με τον όρο σύμπλοκο ιόν; Είναι η ένωση των ανασυνδυασμένων μεταξιών που φτιάχτηκαν προηγουμένως,μαζί με πλασμίδια. Πλασμίδια : δίκλωνα μόρια DNA,συνήθως κυκλικά.Συναντώνται σε βακτήρια και κάποιους ευκαρυωτικόυς οργανισμούς,και επειδή μπορούν να κλωνοποιούνται αυτόνομα σε κατάλληλες συνθήκες,αποτελούν αναντικατάστατο εργαλείο της Τεχνολογίας Ανασυνδυασμένου DNA. 14

15 Προετοιμασία σύμπλοκου ιόντος 1.Ανάμειξη ενός διαλύματος εξαφθοροϊσοπροπανόλης (HFIP) που περιείχε την πρωτεϊνη μεταξιού με το διάλυμα των πλασμιδίων (pDNA),σε διάφορες αναλογίες P/N (μοριακή αναλογία ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μεταξιού P προς τα νουκλεοτίδια N του pDNA). 2.Επώαση,πριν το χαρακτηρισμό, του παραπάνω μείγματος σε θερμοκρασία δωματίου για μία μέρα. Χαρακτηρισμός σύμπλοκου ιόντος 1.Ηλεκτροφόρηση πηκτής (agarose gel electrophoresis) 2.Dynamic Light Scattering (DLS) 3.Αtomic Force Microscopy (AFM) *Να σημειωθεί ότι το pDNA κωδικοποιεί την πρωτείνη GFP (green fluorescent protein) η οποία φθορίζει,και έτσι φάνηκαν τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού. 15

16 Λίγα λόγια για την Ηλεκτροφόρηση Πηκτής(Agarose Gel Electrophoresis) Λίγα λόγια για την Ηλεκτροφόρηση Πηκτής(Agarose Gel Electrophoresis) Είναι μία τεχνική διαχωρισμού του DNA και RNA σε ένα μίγμα,μέσω του μήκους τους, υπολογισμού του μεγέθούς τους ή διαχωρισμού πρωτεϊνών. 16

17 Εικόνα : Agarose gel of pDNA and pDNA complexes with different molecular weights of lysine sequence (A) and different P/N ratio (B). A1 and B1: pDNA (control), A2: Silk6mer and pDNA (P/N 10), A3: Silk6mer-lys15 and pDNA (P/N 10), A4: Silk6mer-lys30 and pDNA (P/N 10), A5: Silk6mer- lys45 and pDNAm (P/N 10), B2: Silk6mer-lys30 and pDNA (P/N 2.5), B3: Silk6mer-lys30 and pDNA (P/N 5), B4: Silk6mer-lys30 and pDNA (P/N 10), and B5: Silk6mer-lys30 and pDNA (P/N 25), B6: Silk6mer-lys30 and pDNA (P/N 50). Στα (Α) και (Β) έχω σύμπλοκα μεταξιού- pDNA.Στο (Α) αυξανω το ΜΒ της λυσίνης σε κάθε σειρά.Στο (Β) μειώνω τα νουκλεοτίδια του pDNA,. Η εικόνα από ηλεκτροφόρηση πηκτής δείχνει τη μετανάστευση του ελεύθερου pDNA και των συμπλόκων pDNA σε 1% agarose gel. 1.Μετανάστευση 6μερούς μεταξιού- pDNA δείχνει ότι μαζί με τα μόρια μεταξιού υπάρχει και pDNA. 2.Τα ανασυνδυασμένα μετάξια που περιείχαν ακολουθίες πολυλυσίνης μετανάστευσαν πιο αργά από το ελεύθερο pDNA → ελεύθερο pDNA μερικώς προσδεδεμένο στις ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες → μπορεί να απελευθερώθηκε pDNA κατά την ηλεκτροφόρηση. 3.Τα μείγματα pDNA-6μερούς μεταξιού με διαφορετικές αναλογίες Ρ/Ν(από 2.5 έως 50) έδειξαν μικρές διακυμάνσεις στην πηκτή,δηλ.όλα είχαν παρόμοια σταθερότητα. 17

18 Λίγα λόγια για την μέθοδο DLS-Dynamic Light Scattering Λίγα λόγια για την μέθοδο DLS-Dynamic Light Scattering Είναι μία τεχνική προσδιορισμού της κατανομής μεγέθους μικρών σωματιδίων ή πολυμερών σε διάλυμα.Εφαρμόζουμε ακτίνα laser(μονοχρωματική ακτίνα φωτός) και επειδή τα σωμάτια υπακούν στην κίνηση Brown,ανάλογα το μέγεθός τους,παίρνουμε διαγράμματα συναρτήσει του χρόνου. 18

19 Με τη μέθοδο DLS μετρήθηκε η υδροδυναμική διάμετρος των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών-συμπλόκων pDNA. 1.6μερές μεταξιού χωρίς pDNA : d= nm 2.6μερές μεταξιού με pDNA : d=570 nm 3.Ανασυνδυασμένα μετάξια με πολυλυσίνη,χωρίς pDNA : d= nm 4.Aνασυνδυασμένα μετάξια με πολυλυσίνη και pDNA : d ↑ όταν lys ↑ ή P/N ↑ 5.6μερές με 30 και 45 λυσίνες με αναλογία Ρ/Ν=10 και 25 έδωσαν 2 διάμετρους(η μία αντιστοιχούσε σε μικρό και η άλλη σε μεγάλο σύμπλοκο) 6.Τα μεγάλα ιζήματα(Ρ/Ν=50)δε μπόρεσαν να χαρακτηριστούν με DLS. 19

20 Λίγα λόγια για τη μέθοδο AFM-Atomic Force Microscopy Είναι μία τεχνική με την οποία μπορούμε να δούμε,να μετρήσουμε και να ελέγξουμε την ύλη στην νανοκλίμακα.Στέλνουμε μία ακτίνα laser προς την επιφάνεια που θέλουμε να μελετήσουμε και o βραχίονας με τη βελόνα(cantilever,συνήθως από πυρίτιο)ταλαντώνεται καθώς σαρώνει την επιφάνεια. 20

21 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΧΑΡ/ΣΜΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ pDNA Η εικόνα από μέτρηση AFM δείχνει το μέγεθος των συμπλόκων pDNA,με τις ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες σε αναλογία Ρ/Ν=10. Α)Γραμμικά μόρια Β)Σφαιρικά σύμπλοκα,d=335±104 nm C)Σφαιρικά σύμπλοκα,d=392±77 nm D)Σφαιρικά σύμπλοκα,d=436±91 nm E)Τυχαία συσσωμάτωση → μεγάλα συσσωματώματα,d=857±290 nm → ΣΗΜΑΝΤΙΚΕΣ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΣΤΙΣ ΔΙΑΣΤΑΣΕΙΣ ΤΟΥΣ 21

22 2.4 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΤΑΙΝΙΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΣΥΜΠΛΟΚΑ pDNA 1.Από κουκούλια του μεταξοσκώληκα Bombyx Mori πάρθηκε η fibroin,(πρωτείνη που αποτελεί το κύριο συστατικό του μεταξιού). 2.Προετοιμάσθηκε διάλυμα μεταξιού 5% κ.β. και τέθηκε σε 24- και 96-multiwell plates. 3.Μετά την εξάτμιση του διαλύτη,οι ταινίες μεταξιού που είχαν μείνει αποστειρώθηκαν με διάλυμα αιθανόλης. 4.Στη συνέχεια,το διάλυμα του σύμπλοκου pDNA τέθηκε επάνω στις ταινίες μεταξιού και αποξηράνθηκε τουλάχιστον 12 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου,για την απομάκρυνση του διαλύτη. 5.Τέλος,οι ταινίες μεταξιού πλύθηκαν με απιονισμένο νερό για να απομακρυνθούν τυχόν μόρια pDNA που δεν είχαν «συνδεθεί» στην επιφάνεια της ταινίας μεταξιού. 22

23 Αριστερά : Οι θηλυκές Bombyx Mori γεννούν τα αυγά τους. Δεξιά : Ο μεταξοσκώληκας Bombyx Mori 23

24 24-multiwell plate 96-multiwell plate 24

25 Α.Σύμπλοκο pDNΑ Β.Προσκόλληση του συμπλόκου στην ταινία μεταξιού Γιατί; !!ΛΟΓΩ ΗΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ!! 25

26 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ&ΧΑΡ/ΣΜΟΥ ΤΑΙΝΙΩΝ ΜΕΤΑΞΙΟΥ ΜΕ pDNA Με μικροσκοπία ΑFM μελετήθηκε η ακεραιότητα των συμπλόκων pDNA,πριν και μετά την εναπόθεση στις ταινίες μεταξιού → ΕΙΧΑΝ ΤΑΥΤΟΣΗΜΟ ΜΕΓΕΘΟΣ Πάνω:6μερές μεταξιού με 30 λυσίνες μεταξιού και pDNA.Τα σύμπλοκα ακινητοποιήθηκαν στην επιφάνεια του μεταξιού. Κάτω:Διαστάσεις συμπλόκων Ύψος περίπου 20 nm 26

27 2.5 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ 1.Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (εν συντομία ΗΕΚ cells) καλλιεργήθηκαν σε DMEM. 2.Όταν αποκολλήθηκαν από το θρεπτικό υλικό,τοποθετήθηκαν στις ταινίες μεταξιού στην πλάκα 24-multiwell με πυκνότητα 5000 κύτταρα/τετραγωνικό εκατοστό. 3.Επώαση κυττάρων για 24 ώρες σε 37°C. 4.Με τη βοήθεια της μικροσκοπίας φθορισμού πήραμε φθορίζουσες εικόνες(λόγω της GFP). Ερώτηση:Γιατί χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα ΗΕΚ; Διότι χρησιμοποιούνται ευρέως σαν μεταφραστικό εργαλείο για ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες σε γονιδιακή θεραπεία. 27

28 Αριστερά: DMEM:Μέσο για καλλιέργειες κυττάρων.Χρησιμοποιείται για να διατηρήσει τα κύτταρα σε καλλιέργειες ιστών.Αποτελείται από άλατα,γλυκόζη και βιταμίνες.Δημιουργήθηκε από τον Ηarry Eagle(DMEM:Dulbecco’s modified Eagle's medium) Δεξιά: Καλλιέργεια σε DMEM 28

29 Λίγα λόγια για τη μικροσκοπία φθορισμού Λίγα λόγια για τη μικροσκοπία φθορισμού Τεχνική που δίνει τις ιδιότητες οργανικών ή ανόργανων ουσιών,μέσω του φαινομένου φθορισμού.Η προς μελέτη ουσία σημαίνεται με GFP(φθορίζον μόριο),ακτινοβολείται με ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος,η GFP το απορροφά και στέλνει πίσω ένα μεγαλύτερο μήκος κύματος. 29

30 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ Εικόνα από μικροσκοπία φθορισμού για το 6μερές μεταξιού με 30 λυσίνες,με διαφορετικές αναλογίες Ρ/Ν. Bλέπουμε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό σε θετικά κύτταρα έχει η Ρ/Ν=10,και η αποτελεσματικότητα μειώνεται για Ρ/Ν=25,50,5, 2.5 → Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΕΤΥΧΕ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΟΓΙΑ Ρ/Ν=10 30

31 Εικόνα φθορισμού για 6μερές μεταξιού με pDNA και 15,30,45 λυσίνες σε αναλογία Ρ/Ν=10. Μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στη μεταγραφή φαίνεται να έχει το 6μερές με 30 λυσίνες,ενώ το απλό 6μερές απέτυχε. 31

32 2.6 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑ 1.Τα κύτταρα ΗΕΚ που ήταν στις 24-multiwell πλάκες τέθηκαν στις 96-multiwell πλάκες.Οι τελευταίες περιείχαν σύμπλοκα pDNA. 2.Καλλιέργεια για 48 ώρες. 3.Η κυτταροτοξικότητα στα ΗΕΚ που βρίσκονταν με τα σύμπλοκα pDNA,χαρακτηρίσθηκε από ένα σταθερό ποσοτικό προσδιορισμό. Ερώτηση:Τι είναι η κυτταροτοξικότητα; Με τον όρο κυτταροτοξικότητα εννοούμε κατά πόσο είναι μία ουσία τοξική για ένα κύτταρο.Στην περίπτωσή μας,πόσα κύτταρα ΗΕΚ επιβίωσαν από την επαφή με τα σύμπλοκα pDNA. 32

33 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ pDNA,ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΗΕΚ Το διάγραμμα δείχνει τα αποτελέσματα της κυτταροτοξικότητας για απλό 6μερές μεταξιού,και για 6μερές μεταξιού με 15,30,45 λυσίνες.Τα κύτταρα με 6μερή μεταξιού με 15 και 30 λυσίνες δεν εξέθεσαν τοξικότητα στη συγκεκριμένη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκαν(0.76mg/ml). Τη χαμηλότερη βιωσιμότητα κυττάρων έδειξε το 6μερές με 45 λυσίνες. 33

34 3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1.Το σύμπλοκο pDNA-6μερές μεταξιού χωρίς την λυσίνη δεν σχημάτισε σφαιρικά σωματίδια(πιθανόν λόγω αλληλεπιδράσεων pDNA με τα θετικά φορτισμένα αμινοξέα του μεταξιού). 2.Τα αναδιαμορφωμένα μετάξια+λυσίνη με το pDNA σχημάτισαν σφαιρικά σύμπλοκα.Η αλληλουχία της πολυλυσίνης είναι απαραίτητη για το σχηματισμό ιοντικών συμπλόκων μεταξιού με pDNA. 3.Το 6μερές μεταξιού με 45 λυσίνες και τα σύμπλοκα που φτιάχτηκαν με αναλογία Ρ/Ν=50 και 25 παρήγαγε πολύ μεγάλα σύμπλοκα,λόγω υψηλής θετικής φόρτισης του μεταξιού. 4.Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης,μέρος του pDNA απελευθερώθηκε από τα σύμπλοκα.Αυτό ίσως υπονοεί ότι το pDNA κρατείται στο εσωτερικό ή στην επιφάνεια των σφαιρικών συμπλόκων.!!!Περαιτέρω έρευνα χρειάζεται!!! 5.Τα σύμπλοκα pDNA,ήταν ακινητοποιημένα και μισοθαμμμένα στην επιφάνεια της ταινίας μεταξιού.Μισοθαμμένα λόγω μερικής διαλυτοποίησης ταινίας,πριν εξατμιστεί η HFIP,ακινητοποιημένα λόγω (protein-protein) υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταξύ μεταξιού στα σύμπλοκα και των ταινιών. 34

35 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΥΡΙΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ : Το 6μερές μεταξιού με 30 λυσίνες,Ρ/Ν=10 και διάμετρο 380 νανόμετρα ήταν το πιο αποτελεσματικό και κατάλληλο για παράδοση γονιδίων. 1.Το μέγεθος των σωματιδίων στην παράδοση γονιδίων είναι πολύ σημαντικό(για d>400 nm δεν μπορούν να μετασχηματιστούν στα κύτταρα). 2.Υψηλή θετική φόρτιση μπορεί να αυξήσει την κυτταροτοξικότητα και επομένως να μειώσει την αποτελεσματικότητα μεταγραφής. 3.Ενίσχυση αποτελεσματικότητας με προσθήκη λειτουργικών πεπτιδίων στις συστάδες συμπολυμερών και στο μετάξι. 4.Η πολυλυσίνη,αν και είναι βιοδιασπώμενη και μη κυτταροτοξική,έχει ετερογένεια στο ΜΒ και δεν μπορούμε να παράξουμε σύμπλοκα pDNA ομογενούς μεγέθους. 35

36 5. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Η πολυλειτουργικότητα στη σχεδίαση και εφαρμογή των νέων βιομηχανικών πρωτεϊνών από μετάξι,προτείνει πολλές χρήσεις σε εφαρμογές παράδοσης γονιδίων. Γονιδιακή θεραπεία για : 1.Κυστική ίνωση 2.Αιμοφιλία 3.Μυϊκή δυστροφία 4.Δρεπανοκυτταρική αναιμία 5.Διάφορες μορφές καρκίνου 6.Ελεγχόμενη απόδοση φαρμάκων Η γονιδιακή θεραπεία,εκτός από σωματική,μπορεί να αφορά το μετασχηματισμό των ωαρίων και σπερματοζωαρίων με τα επιθυμητά γονίδια,ώστε η θεραπεία να μεταφέρεται από γενιά σε γενιά. Τέλος,παράδοση γονιδίων μπορούμε να έχουμε και στη γεωργία (βελτίωσης σοδειάς καλαμποκιού,ντομάτας κλπ.) 36

37 Βιβλιογραφία Βιοχημεία Τόμος I&II (Jeremy M.Berg-John L.Tymoczko-Lubert Stryer) Εισαγωγή στην Κυτταρική Βιολογία Τόμος Ι&ΙΙ(Alberts-Bray- Johnson-Lewis-Raff-Roberts-Walter) Longman English Dictionary Google Translators Science Daily Wikipedia The Free Encyclopedia Science Direct Mr.Google https://www.lablife.org Elsevier 37

38 Ευχαριστώ πολύ για το χρόνο που διαθέσατε! 38


Κατέβασμα ppt "ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΣΜΕΝΑ ΣΕ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΞΙΟΥ Journal : Biomaterials, October 2009;30 Publisher : Elsevier Original Paper :"

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google