Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

ΝΕΦΡΙΚΗ ΙΝΩΣΗ Ερευνητικό Πρόγραμμα Αριστείας. Στατιστικά Στοιχεία Αριστείας Ι Υποβλήθηκαν 1497 προτάσεις σε όλα τα γνωστικά πεδία Στα πεδία Ιατρικές Επιστήμες.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "ΝΕΦΡΙΚΗ ΙΝΩΣΗ Ερευνητικό Πρόγραμμα Αριστείας. Στατιστικά Στοιχεία Αριστείας Ι Υποβλήθηκαν 1497 προτάσεις σε όλα τα γνωστικά πεδία Στα πεδία Ιατρικές Επιστήμες."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΝΕΦΡΙΚΗ ΙΝΩΣΗ Ερευνητικό Πρόγραμμα Αριστείας

2 Στατιστικά Στοιχεία Αριστείας Ι Υποβλήθηκαν 1497 προτάσεις σε όλα τα γνωστικά πεδία Στα πεδία Ιατρικές Επιστήμες και Επιστήμες Ζωής υποβλήθηκαν 416 προτάσεις (27,8%) Το ΕΣΕΤ όρισε 10 Θεματικές Επιτροπές και αυτές αναζήτησαν Εξωτερικούς Κριτές Προκρίθηκαν για χρηματοδότηση συνολικά 206 προτάσεις (13,7%) Στα πεδία Ιατρικές Επιστήμες και Επιστήμες Ζωής προκρίθηκαν 69 προτάσεις (16,6%) Στα πεδία Ιατρικές Επιστήμες και Επιστήμες Ζωής προκρίθηκαν για το ΙΙΒΕΑΑ 7 προτάσεις (10% των πεδίων) Από τις 69 εγκεκριμένες, 3 αναφέρονται συνολικά ή μερικά σε νεφρικές παθήσεις

3 Στοιχεία του Προγράμματος Συνοπτικός τίτλος: ΝΕΦΡΙΚΗ ΙΝΩΣΗ Πλήρης τίτλος: Κατανόηση και πρόβλεψη της νεφρικής ίνωσης: ο ρόλος της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης Συνολικός αιτούμενος προϋπολογισμός: € Συνολικός εγκεκριμένος προϋπολογισμός: €

4 Μέλη του προγράμματος Από ΙΙΒΕΑΑ --- Άρης Χαρώνης --- Πάνος Πολίτης --- Τόνια Βλάχου --- Σοφία Κοσσίδα --- Έλενα Αρβανίτη --- Μυρτώ Ρίζου Από Πανεπιστήμιο Αθηνών --- Δημήτρης Βλαχάκος Από Πανεπιστήμιο Πατρών --- Δημήτρης Γούμενος

5 Περίληψη του προγράμματος Η ίνωση, που ορίζεται σαν η παθολογική άθροιση εξωκυττάριας ουσίας, επηρεάζει τη δομή και τη λειτουργία πολλών οργάνων. Είναι μία πολύπλοκη διαδικασία στην οποία εμπλέκονται πολλοί κυτταρικοί τύποι. Η πρόταση εστιάζεται στη νεφρική ίνωση η οποία αποτελεί σημαντικό ιατρικό πρόβλημα, δεδομένου ότι περισσότερο από το 10% του ενήλικου πληθυσμού επηρεάζεται από αυτήν, ιδιαίτερα άτομα με σακχαρώδη διαβήτη και υπέρταση. Για να κατανοηθούν καλύτερα οι παθογενετικοί μηχανισμοί που ενεργοποιούνται σε πολύπλοκες και πολυπαραγοντικές διαδικασίες όπως η νεφρική ίνωση, η ομάδα του Κύριου Ερευνητή έχει πρόσφατα εφαρμόσει τεχνικές πρωτεωμικής σε ζωϊκό μοντέλο νεφρικής ίνωσης. Με την προσέγγιση αυτή πιστοποιήθηκε ότι δύο πρωτείνες που δεν είχαν μέχρι τώρα εμπλακεί στις διαδικασίες της νεφρικής ίνωσης, η καλρετικουλίνη και η τρανσγελίνη, εμφάνιζαν υπερέκφραση κατά την ανάπτυξη της ίνωσης, από πολύ πρώϊμα στάδια. Η υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτείνης. Η παρούσα πρόταση έχει τρεις στόχους: •Πρώτον, την κατανόηση των μηχανισμών που είναι υπεύθυνοι για την παρατηρούμενη υπερέκφραση, συνδυάζοντας τεχνικές βιοπληροφορικής και μοριακής βιολογίας, με στόχο τη χαρτογράφηση κρίσιμων περιοχών στους υποκινητές των γονιδίων των πρωτεινών αυτών. •Δεύτερον, τη μελέτη των αλλαγών στον κυτταρικό φαινότυπο των ειδικών νεφρικών κυττάρων που υπερεκφράζουν τις πρωτείνες αυτές, συνδυάζοντας τεχνικές κυτταρικής βιολογίας και πρωτεωμικής. •Τρίτον, την ανίχνευση τυχόν μεταβολών στην έκφραση αυτών των πρωτεινών σε υλικό από ασθενείς που πάσχουν από νεφρικές παθήσεις, χρησιμοποιώντας βιοψικό υλικό και δείγματα ούρων. Πιστεύεται ότι η προτεινόμενη πολύπλευρη και μεταφραστική προσέγγιση θα συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων παθογενετικών μηχανισμών και θα συμβάλει στην ανάπτυξη πρώϊμων δεικτών για πρόγνωση και διάγνωση της νεφρικής ίνωσης.

6 Στόχοι του προγράμματος •Πρώτον, την κατανόηση των μηχανισμών που είναι υπεύθυνοι για την παρατηρούμενη υπερέκφραση, συνδυάζοντας τεχνικές βιοπληροφορικής και μοριακής βιολογίας, με στόχο τη χαρτογράφηση κρίσιμων περιοχών στους υποκινητές των γονιδίων των πρωτεινών αυτών. •Δεύτερον, τη μελέτη των αλλαγών στον κυτταρικό φαινότυπο των ειδικών νεφρικών κυττάρων που υπερεκφράζουν τις πρωτείνες αυτές, συνδυάζοντας τεχνικές κυτταρικής βιολογίας και πρωτεωμικής. •Τρίτον, την ανίχνευση τυχόν μεταβολών στην έκφραση αυτών των πρωτεινών σε υλικό από ασθενείς που πάσχουν από νεφρικές παθήσεις, χρησιμοποιώντας βιοψικό υλικό και δείγματα ούρων.

7 Πακέτα Εργασίας •ΠE1. Συλλογή πειραματικού υλικού •ΠΕ2. Μελέτη των μηχανισμών υπερέκφρασης της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης •ΠΕ3. Μελέτη των φαινοτυπικών αλλαγών που προκαλούνται από την υπερέκφραση της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης •ΠΕ4. Ανίχνευση της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης σε δείγματα νεφροπαθών •ΠΕ5. Ενέργειες δημοσιότητας και διάχυσης των ερευνητικών αποτελεσμάτων

8 ΠE1. Συλλογή πειραματικού υλικού •Κυτταρικές σειρές: Για την έκφραση της καλρετικουλίνης θα χρησιμοποιηθεί η κυτταρική σειρά HK-2, μια καλά διαφοροποιημένη και χαρακτηρισμένη σειρά σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων. Για την έκφραση της τρανσγελίνης θα χρησιμοποιηθεί κυτταρική σειρά ανάλογα με τον χαρακτηρισμό των κυττάρων που θα αποδειχθεί ότι την παράγουν. Οι κυτταρικές σειρές θα επιμολυνθούν με κατάλληλους φορείς, ώστε να επιτευχθεί υπερέκφραση (αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις και υποέκφραση με τεχνικές siRNA) της καλρετικουλίνης ή της τρανσγελίνης. Η επιτυχής επιμόλυνση και η υπερέκφραση ή υποέκφραση θα επιβεβαιωθούν με τεχνικές στυπώματος κατά Western. •Ζωϊκά μοντέλα: Για τη μελέτη της ινωτικής διαδικασίας θα χρησιμοποιηθεί το μοντέλο της μονόπλευρης απόφραξης του ουρητήρα σε επίμυς και μυς. Τα ζώα θα αναισθητοποιηθούν, θα γίνει ολική απόφραξη του δεξιού ουρητήρα και θα θυσιασθούν μετά από συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα, 2, 8 ή 17 ημερών. Όλες οι διαδικασίες θα γίνουν σύμφωνα με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από τις αρμόδιες αρχές. Νεφρικός ιστός θα συλλεγεί και θα φυλαχθεί είτε σε υγρό άζωτο για περαιτέρω βιοχημικές και μορφολογικές μελέτες είτε σε παραφίνη μετά από μονιμοποίηση σε φορμόλη για μορφολογικές μελέτες. Μέρος του ιστού που θα φυλαχθεί σε υγρό άζωτο θα χρησιμοποιηθεί για κοπή λεπτών τομών στις οποίες θα εφαρμοσθεί η τεχνική της μικροτομής με laser για περαιτέρω πρωτεωμικές μελέτες. •Ανθρώπινο υλικό: Το ανθρώπινο υλικό θα περιλαμβάνει βιοψικό υλικό και δείγματα ούρων. Το υλικό αυτό θα φυλαχθεί σύμφωνα με διεθνή πρωτόκολλα και θα χρησιμοποιηθεί μετά από γραπτή συγκατάθεση των συμετεχόντων, που θα έπεται αναλυτικών επεξηγήσεων. Το υλικό θα εξετασθεί με τεχνικές ανοσοϊστοχημείας, ανοσοφθορισμού, στυπώματος κατά Western και πρωτεωμικής. Κατάλληλοι μάρτυρες θα χρησιμοποιηθούν (υλικό από νεφρεκτομές σε ογκολογικούς ασθενείς).

9 ΠΕ2. Μελέτη των μηχανισμών υπερέκφρασης της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης Για την επίτευξη του στόχου μας θα χρησιμοποιήσουμε ένα συνδυασμό βιοπληροφορικών και πειραματικών προσεγγίσεων. Αρχικά, με τη χρήση κατάλληλων πακέτων λογισμικού, θα αναλύσουμε τα γονίδια της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης για να εντοπίσουμε πιθανές ρυθμιστικές αλληλουχίες (υποκινητές και ενισχυτές) καθώς επίσης και πιθανές θέσεις δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων. Από αυτή την ανάλυση θα προκύψουν λίστες με πιθανούς μεταγραφικούς ρυθμιστές/παράγοντες αυτών των γονιδίων. Στη συνέχεια θα κλωνοποιήσουμε τις αλληλουχίες που εντοπίστηκαν σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς και με μια σειρά μεταλλάξεων θα χαρτογραφήσουμε λεπτομερώς τις περιοχές που απαιτούνται για την μεταγραφική ενεργοποίηση αυτών των γονιδίων σε κυτταρικές σειρές (π.χ. HK2 και HEK293). Επίσης φορείς υπερέκφρασης για τους παραπάνω μεταγραφικούς παράγοντες θα κατασκευαστούν ή θα ζητηθούν από άλλα εργαστήρια, ώστε μέσω πειραμάτων διπλής διαμόλυνσης κυτταρικών σειρών να εξετάσουμε την ικανότητα τους να προάγουν ή να καταστέλλουν την μεταγραφική ενεργότητα των ρυθμιστικών αλληλουχιών των γονιδίων της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης. Επιπλέον, παρόμοια πειράματα θα πραγματοποιηθούν με τη χρήση siRNA μορίων, που στοχεύουν αυτούς τους παράγοντες, για να δοκιμάσουμε εάν απαιτούνται για την σωστή ρύθμιση αυτών των γονιδίων. Επίσης οι μεταγραφικοί παράγοντες με τη μεγαλύτερη ικανότητα να επηρεάζουν την μεταγραφή των δύο γονιδίων θα δοκιμαστούν σε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης σε κυτταρικές σειρές. Γενικά με αυτές τις προσεγγίσεις περιμένουμε να διαλευκάνουμε το δίκτυο των μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης κατά την πρόοδο της νεφρικής ίνωσης. Επιπλέον, ο εντοπισμός αυτού του δικτύου μεταγραφικών παραγόντων περιμένουμε να μας δώσει πληροφορίες για πιθανά σηματοδοτικά μονοπάτια, τα οποία ίσως να παίζουν κομβικό ρόλο στην πρόοδο της ίνωσης. Φαρμακολογικοί αναστολείς και/ή αγωνιστές γι αυτά τα μονοπάτια θα χρησιμοποιηθούν σε in vivo πειράματα για να διαπιστώσουμε την ικανότητα τους να επηρεάζουν την έκφραση της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης καθώς επίσης και την πρόοδο της νεφρικής ίνωσης στο πειραματικό μοντέλο της μονόπλευρης ουρητηρικής απόφραξης.

10 ΠΕ3. Μελέτη των φαινοτυπικών αλλαγών που προκαλούνται από την υπερέκφραση της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης •Μελέτες σε κυτταροκαλλιέρειες: Σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές που θα υπερεκφράζουν καλρετικουλίνη και τρανσγελίνη θα χρησιμοποιηθούν για τις μελέτες αυτές. Η επιλογή και η επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών περιγράφτηκαν στην ΕΕ1. Τα κύτταρα θα καλλιεργηθούν για ορισμένο χρονικό διάστημα σε κατάλληλα επενδυμένο πλαστικό. Τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν για πλήρη πρωτεωμική ανάλυση στο τέλος του διαστήματος καλλιέργειας, χρησιμοποιώντας κλασσικές τεχνικές ηλεκτροφόρησης και ανάλυσης των διαφορικά εκφραζόμενων κηλίδων με φασματογραφία μάζας. Ταυτοποίηση πρωτεϊνών και ένταξή τους σε λειτουργίες/σηματοδοτικά μονοπάτια θα γίνει με χρήση κατάλληλου λογισμικού. •Πέραν των μελετών πρωτεωμικής, μελέτες ορισμένων χαρακτηριστικών των κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν καλρετικουλίνη και τρανσγελίνη πρόκειται να πραγματοποιηθούν. Αυτές περιλαμβάνουν μελέτες για την ανίχνευση δεικτών κυτταρικής διαφοροποίησης, μελέτες αλλαγών στην κυτταρική προσκόλληση, κινητικότητα, βιωσιμότητα/απόπτωση, στο κυτταρικό στρες και στο εκκριτικό προφίλ των κυτταρικών σειρών. •Μελέτες σε ινωτικό νεφρικό ιστό: Τα αποτελέσματα από τις παραπάνω μελέτες θα μας οδηγήσουν σε ορισμένα (γνωστά ή άγνωστα μέχρι τώρα) μακρομόρια που θα παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναπτυσσόμενη παθολογία κατά την ινωτική διαδικασία. Θα επιλέξουμε τα πλέον σημαντικά και με τη βοήθεια βιοχημικών (RT- PCR, Western blotting) και μορφολογικών (ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμός) τεχνικών θα μελετήσουμε την έκφρασή τους και τον εντοπισμό τους στο νεφρικό παρέγχυμα κατά την ανάπτυξη της ίνωσης.

11 ΠΕ4. Ανίχνευση της καλρετικουλίνης και της τρανσγελίνης σε δείγματα νεφροπαθών •Δείγματα νεφρικού ιστού: Θα χρησιμοποιηθεί το υλικό που περιγράφεται στην ΕΕ1. Οι βιοψίες των ασθενών θα κατηγοριοποιηθούν ανάλογα με το εάν πρόκειται για σπειραματοπάθεια, πάθηση του σωληναριοδιάμεσου ιστού ή πάθηση εξωνεφρικής/συστημικής αιτιολογίας (διαβήτης, υπέρταση, ερυθηματώδης λύκος). Υλικό από μπλοκ παραφίνης θα μελετηθεί με τις τεχνικές της ανοσοϊστοχημείας και του διπλού ανοσοφθορισμού, χρησιμοποιώντας αντισώματα και για την καλρετικουλίνη ή την τρανσγελίνη αλλά και αντισώματα σε άλλες πρωτείνες που εμπλέκονται στην ινωτική διαδικασία (a-smooth musvcle actin, fibroblast specific protein 1) καθώς και σε μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της έκφρασης της καλρετικουλίνης ή της τρανσγελίνης, με βάση τα ευρήματα που θα έχουμε από την ΕΕ2. •Δείγματα ούρων: Τα δείγματα αυτά θα φυλαχθούν με βάση ειδικά πρωτόκολλα και θα μελετηθούν με δύο τρόπους. Αρχικά, δείγματα θα αναλυθούν με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση και φασματογραφία μάζας, τεχνολογία που έχει περιγραφεί αναλυτικά από τον H. Mischak (Mischak et al, Proteom. Clin. Applic. 4:464, 2010) και η παρουσία πεπτιδίων προερχόμενων από την καλρετικουλίνη ή την τρανσγελίνη θα ελεγχθεί. Επιπλέον, δείγματα ούρων θα χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση εξοσωμάτων. Τα εξοσώματα είναι ειδικά κυστίδια που παράγονται συνεχώς από τα κύτταρα και ειδικά για την ουροφόρο οδό αποτελούν ένα είδος κυτταρικής βιοψίας. Θα χρησιμοποιηθούν μέθοδοι σταδιακών φυγοκεντρήσεων (Mathivanan et al, Proteom. 73:1907, 2010). Τα εξοσώματα θα αναλυθούν περαιτέρω με τεχνικές στυπώματος κατά Western και πρωτεωμικής.

12 ΠΕ5. Ενέργειες δημοσιότητας και διάχυσης των ερευνητικών αποτελεσμάτων •Πρώτον, συμμετοχή σε Ελληνικά και διεθνή συνέδρια σχετιζόμενα με τα αντικείμενα του προγράμματος (νεφρικές παθήσεις, μοριακή βιολογία παθογενετικών μηχανισμών, ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων, πρωτεωμική) των μελών του προγράμματος με σχετικές παρουσιάσεις. •Δεύτερον, δημοσιεύσεις των αποτελεσμάτων των πειραμάτων του προγράμματος σε διεθνή περιοδικά υψηλού δείκτη απήχησης. •Τρίτον, δημιουργία ειδικού τμήματος στην ιστοσελίδα του ΙΙΒΕΑΑ όπου θα προβάλλεται το πρόγραμμα, τα μέλη του και τα επιτεύγματά τους. •Τέταρτον, διοργάνωση συνάντησης ή συναντήσεων με μέλη της Ελληνικής Νεφρολογικής κοινότητας και με το Προεδρείο της Ελληνικής Νεφρολογικής Εταιρείας, προκειμένου να γίνει πλατειά γνωστό το πρόγραμμα, η προσπάθεια και τα αποτελέσματά του.

13 Πρόταση για κοινή συνάντηση των 3 Αριστειών με θεματολογική σύγκλιση στις νεφροπάθειες ---Οργάνωση ημερίδας ή διημερίδας ---Συνάντηση των 3 ομάδων ---Προσπάθεια προσέλκυσης και άλλων Ελλήνων Νεφρολόγων ---Πρόσκληση ξένων ομιλητών (Χατζηαντωνίου, Δέλτας, Schanstra ….) ---Παρουσίαση του προγράμματος ENCODE ---Παρουσίαση των αποτελεσμάτων και συζήτηση


Κατέβασμα ppt "ΝΕΦΡΙΚΗ ΙΝΩΣΗ Ερευνητικό Πρόγραμμα Αριστείας. Στατιστικά Στοιχεία Αριστείας Ι Υποβλήθηκαν 1497 προτάσεις σε όλα τα γνωστικά πεδία Στα πεδία Ιατρικές Επιστήμες."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google