ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΑ: ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Σύλβα Χαραλάμπους Κύρια ερευνήτρια Εργαστήριο Διαγονιδιακής.

Παρουσίαση με θέμα: "ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΑ: ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Σύλβα Χαραλάμπους Κύρια ερευνήτρια Εργαστήριο Διαγονιδιακής."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΑ: ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Σύλβα Χαραλάμπους Κύρια ερευνήτρια Εργαστήριο Διαγονιδιακής Τεχνολογίας Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Τι είναι η διαγονιδιακή τεχνολογία
Γιατί και που εφαρμόζεται, ποιοι την χρησιμοποιούν Πως χρησιμοποιείται στη Βιοϊατρική έρευνα και ποια είναι τα προϊόντα της Ποιες είναι οι βασικές αρχές της διαγένεσης Με ποιους διαφορετικούς τρόπους μπορούμε να χειριστούμε τη διαγένεση ώστε να έχουμε ένα επιθυμητό αποτέλεσμα «προτυποποίηση ανθρώπινων ασθενειών» Παραδείγματα δημιουργίας συστημάτων μελέτης ανοσολογικών διεργασιών Πως διαγράφεται το μέλλον της διαγένεσης 2

3 Διαγονιδιακή είναι η τεχνολογία κατά την οποία:
μη ενδογενές DNA (από το ίδιο είδος, από τελείως διαφορετικό είδος ή από τεχνητό γενετικό υλικό) εισάγεται μέσω ειδικών φορέων, στο γονιδίωμα ενός οργανισμού το ενδογενές DNA ενός οργανισμού τροποποιείται με κατάλληλες τεχνικές Οι ειδικοί φορείς μπορεί να είναι πλασμίδια ή ιοί 3

4 γενετική ρύθμιση σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις
Για να μελετάμε το πως πραγματοποιείται η γενετική ρύθμιση σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις Για να παράγουμε ζωικά/φυτικά προϊόντα ώστε να βελτιώνεται η παραγωγή τους Για να φτιάχνουμε γενετικά πρότυπα Για να φτιάχνουμε αποτελεσματικότερα εμβόλια Για να βελτιώνουμε το επίπεδο της υγεία μας Η διαγένεση αποτελεί ένα γενετικό εργαλείο

5 Η διαγονιδιακή τεχνολογία μπορεί να εφαρμοστεί εν δυνάμει σε όλα τα έμβια συστήματα με διαφορετικές προσεγγίσεις και διαφορετική αποτελεσματικότητα. Χρησιμοποιείται στην ιατρική, στην κτηνοτροφία, στη γεωργία, στην οικολογία Το πεδίο εφαρμογών της είναι τόσο ευρύ που δημιουργεί κοινωνικές, οικονομικές, πολιτικές και πολιτισμικές εμπλοκές! 5

6 Τα προϊόντα της διαγένεσης προσελκύουν το ενδιαφέρον του εμπορικού κόσμου και ειδικότερα αυτού της φαρμακοβιομηχανίας των βιομηχανιών κατασκευής εργαστηριακού εξοπλισμού αλλά και των εταιρειών διαχείρισης πληροφοριών Φάρμακα Όργανα εργαστηριακά / ιατρικά Συστήματα διαχείρισης δεδομένων -ρομποτική

7 Στη Βιολογική έρευνα η διαγονιδιακή τεχνολογία εφαρμόζεται ως επί το πλείστον σε ζώα και μάλιστα σε ποντίκια 7

8 Γιατί ποντίκια; Πέρα από τους πρακτικούς λόγους (μικρά θηλαστικά, εύκολη αναπαραγωγή, μικρό κόστος διατήρησης), είναι ανώτερα θηλαστικά με μεγάλο ποσοστό των γονιδίων τους κοινό με αυτό των ανθρώπων Η γενετική του ποντικού αποτελεί το ιδανικότερο σύστημα για την προτυποποίηση των ανθρώπινων ασθενειών 8

9 Δημιουργία πρώτου Διαγονιδιακού ποντικού από τους J.Gordon & F. Ruddle
1966 Microinjection of mouse eggs (Lin; Science 151:333) Δημιουργία πρώτου Διαγονιδιακού ποντικού από τους J.Gordon & F. Ruddle

10 Οι πρώτες προσεγγίσεις:
Το πρώτο διαγονιδιακό ζώο με λειτουργικό γονίδιο φτιάχτηκε από τους Palmiter et al. το 1982 Το γονίδιο της αυξητικής ορμόνης του αρουραίου υπό τον έλεγχο του εκκινητή της μεταλλοθειονίνης (ΜΤ) μεταφέρθηκε σε ζυγωτά ποντικού, μεταφέρθηκαν σε ψευδοέγκυες μητέρες και δημιουργήθηκαν έτσι τα πρώτα ποντίκια με μεγαλύτερο από το φυσολογικό μέγεθος "supermice" - 1982 Mar 4;296(5852):39-42. Τιμήθηκαν με το βραβείο Charles Leopold Mayer το 1994, που είναι το καλύτερο βραβείο της Γαλλικής Ακαδημίας των Επιστημών.

11 Altering the genome by homologous recombination.
Οι πρώτες προσεγγίσεις: Ο M. Cappechi το 1989 έδειξε ότι ακριβής αντικατάσταση του γονιδίου με ομόλογο ανασυνδυασμό μπορεί να γίνει σε μετασχηματισμένα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΕS) και να δημιουργήσει μεταλλαγμένα έμβρυα 2007 Bραβείο Νobel Ιατρικής/ Φυσιολογίας ( 24 βραβεία στην καριέρα του) Science Jun 16;244(4910): Altering the genome by homologous recombination. Capecchi MR. Howard Hughes Medical Institute, Department of Biology, University of Utah, Salt Lake City 11

12 Πως πραγματοποιείται η Διαγένεση

13 Τροποποιώντας ενδογενή γονίδια με την εισαγωγή μεταλλάξεων
Αναστέλλοντας την έκφραση ενδογενών γονιδίων με παρέμβαση σε διαφορετικά επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης Ελέγχοντας την έκφραση γονιδίων σε επιλεγμένους ιστούς / κύτταρα ή σε επιλεγμένα στάδια της ανάπτυξης Επάγοντας τη γονιδιακή έκφραση σε επιλεγμένες καταστάσεις

14 το ενδογενές DNA ενός οργανισμού τροποποιείται με κατάλληλες τεχνικές
Οι ειδικοί φορείς μπορεί να είναι πλασμίδια ή ιοί 14 14

15 Τι απαιτείται: Mια κατάλληλα φτιαγμένη γονιδιακή κατασκευή (construct)* Ένας πλασμιδιακός ή ιικός φορέας με κατάλληλα χαρακτηριστικά Ένα είδος ζώου ή κυττάρων που θα αποτελέσουν το μέσο έκφρασης του γονιδίου

16 Πώς πραγματοποιείται:
Εισαγωγή μη ενδογενούς DNA σε κύτταρα μπορεί να πραγματοποιηθεί με: μετασχηματισμό (transformation) μεταμόλυνση (transfection) άμεση μικροένεση (microinjection) 16

17 Για να μετατραπεί το γονιδίωμα με τρόπο ώστε:
1. να επηρεάζεται η λειτουργία του επιθυμητού μόνο γονιδίου 2. να είναι ανιχνεύσιμες οι όποιες αλλαγές που έχουν πραγματοποιηθεί στο επίπεδο της γονιδιακής κατασκευής, ΠΡΕΠΕΙ 1. να χρησιμοποιούνται μερικά γενετικά και πρωτεϊνικά στοιχεία 2. να συνδυάζονται μεταξύ τους με ειδικό σχεδιασμό Με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται η καλύτερη έκφραση των γενετικών αλλαγών ανάλογα με την περίπτωση. 17

18 Τέτοια γενετικά και πρωτεϊνικά στοιχεία είναι:
Υποκινητές εξώνια, εσώνια σήματα πολυαδενυλίωσης Pa IRES (Ιnternal Ribosome Entry Site) βραχίονες ομολογίας δείκτες επιλογής για το προσδιορισμό των κυττάρων που έχουν ενσωματώσει (θετική επιλογή-neo) ή έχουν απολέσει (αρνητική επιλογή - HSV-tk) το διαγονίδιο γονίδια αναφοράς (Lac Z, GFP) ανασυνδυάσες ειδικής θέσης όπως η Cre recombinase που καταλύει τον ανασυνδυασμό μεταξύ δύο ειδικών αλληλουχιών, που λέγονται loxP επαγώγιμα συστήματα (tet on-off, Tetracycline inducible gene expression) internal ribosome entry site, abbreviated IRES, is a nucleotide sequence that allows for translation initiation in the middle of a messenger RNA (mRNA) sequence as part of the greater process of protein synthesis. Usually, in eukaryotes, translation can be initiated only at the 5' end of the mRNA molecule, since 5' cap recognition is required for the assembly of the initiation complex. hese sequences were first discovered in 1988 in poliovirus RNA and encephalomyocarditis virus RNA

19 Δείκτες επιλογής Χρησιμοποιούνται επειδή η ενσωμάτωση (θετική επιλογή) ή η απώλεια (αρνητική επιλογή) συμβαίνει μόνο σε μέρος των κυττάρων Δείκτες θετικής επιλογής Τοποθετούνται μέσα στις περισσότερες κατασκευές για να προσδιορίζουν τα κύτταρα στα οποία το DNA έχει εισαχθεί παροδικά ή έχει ενσωματωθεί στο γονιδίωμα (neor = ανθεκτικότητα στη νεομυκίνη) Δείκτες αρνητικής επιλογής Τοποθετούνται όταν είναι επιθυμητή η απώλεια ενός γονιδίου, όπως ελλείψεις ή η αύξηση του ομόλογου ανασυνδυασμού που χρειάζεται για να επιτευχθεί ενσωμάτωση (tkr = ανθεκτικότητα στο ganciclovir)

20 Γονίδια Αναφοράς (Reporter genes)
Lac Z (β γαλακτοζιδάση, χρησιμοποιείται για την εύκολη ανίχνευση κυττάρων ή γονιδίων που το εκφράζουν) Έκφραση της β-Gal υπό τον υποκινητή της νευρογενίνης που εκφράζεται σε πρόδρομα νευρικά κύτταρα (χρώση με Χ-Gal) Έκφραση της β-Gal υπό τον ROSA υποκινητή που εκφράζεται συστηματικά Το γονίδιο lacZ της Ε.coli, κωδικοποιεί την β-γαλακτοζιδάση (β-Gal) που καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης αλλά και των συνθετικών της αναλόγων. Για ιστολογική ανάλυση, το υπόστρωμα X-gal δίνει ένα αδιάλυτο μπλέ ίζημα που βάφει έντονα τα κύτταρα, αλλά και ιστούς 2. Η πρωτεΐνη GFP (Green Fluorescent Protein)προέρχεται από την μέδουσα Aequoria victoria, και είναι μια φυσικά φθορίζουσα πρωτεΐνη, δηλ. δεν απαιτείται υπόστρωμα για να παραχθεί φθορισμός κάτι που επιτρέπει την παρακολούθηση βιολογικών διεργασιών σε πραγματικό χρόνο. H παρατήρηση μπορεί να γίνει με οπτικό μικροσκόπιο φθορισμού, συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal), κυτταρομετρητή ροής. Άλλες φθορίζουσες πρωτεΐνες είναι οι παραλλαγές της GFP, EGFP (Enhanced) και YFP (Yellow), καθώς και η κόκκινη πρωτεΐνη dsRED Το γονίδιο lacZ της Ε.coli, κωδικοποιεί την β-γαλακτοζιδάση (β-Gal) που καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης αλλά και των συνθετικών της αναλόγων. Για ιστολογική ανάλυση, το υπόστρωμα X-gal δίνει ένα αδιάλυτο μπλέ ίζημα που βάφει έντονα τα κύτταρα και ιστούς

21 Γονίδια Αναφοράς (Reporter genes)
GFP (Green Fluorescent Protein,πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) Έμβρυα διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων που εκφράζουν GFP κάτω από συστηματικό υποκινητή μαζί με άλλα που δεν εκφράζουν. Η GFP φθορίζει μετά από διέγερση με γαλάζιο φώς (488 nm) ή από UV φως. Το γονίδιο lacZ της Ε.coli, κωδικοποιεί την β-γαλακτοζιδάση (β-Gal) που καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης αλλά και των συνθετικών της αναλόγων. Για ιστολογική ανάλυση, το υπόστρωμα X-gal δίνει ένα αδιάλυτο μπλέ ίζημα που βάφει έντονα τα κύτταρα, αλλά και ιστούς 2. Η πρωτεΐνη GFP (Green Fluorescent Protein)προέρχεται από την μέδουσα Aequoria victoria, και είναι μια φυσικά φθορίζουσα πρωτεΐνη, δηλ. δεν απαιτείται υπόστρωμα για να παραχθεί φθορισμός κάτι που επιτρέπει την παρακολούθηση βιολογικών διεργασιών σε πραγματικό χρόνο. H παρατήρηση μπορεί να γίνει με οπτικό μικροσκόπιο φθορισμού, συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal), κυτταρομετρητή ροής. Άλλες φθορίζουσες πρωτεΐνες είναι οι παραλλαγές της GFP, EGFP (Enhanced) και YFP (Yellow), καθώς και η κόκκινη πρωτεΐνη dsRED Η πρωτεΐνη GFP προέρχεται από την μέδουσα Aequoria victoria, και είναι μια φυσικά φθορίζουσα πρωτεΐνη, δηλ. δεν απαιτείται υπόστρωμα για να παραχθεί φθορισμός κάτι που επιτρέπει την παρακολούθηση βιολογικών διεργασιών σε πραγματικό χρόνο. H παρατήρηση μπορεί να γίνει με οπτικό μικροσκόπιο φθορισμού, συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal) και κυτταρομετρητή ροής. Άλλες φθορίζουσες πρωτεΐνες είναι οι παραλλαγές της GFP, EGFP (Enhanced) και YFP (Yellow), καθώς και η κόκκινη πρωτεΐνη dsRED

22 Επιστήμη και Τέχνη

23

24 ΔΥΟ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ΔΙΝΟΥΝ ΚΑΛΥΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠ΄ΌΤΙ ΜΙΑ
Αιμοφόρα αγγεία που εκφράζουν GFP φαίνονται σε ποντίκια που εκφράζουν RFP μελάνωμα. OTECHNIQUES  36, No. 1 January, 19, 2004]      (726 Kb)

25 Ανασυνδυάσες ειδικής θέσης
Καταλύουν τον ανασυνδυασμό μεταξύ δύο αλληλουχιών του DNA και πραγματοποιούν τροποποιήσεις μετά την εισαγωγή, δημιουργώντας νέες λειτουργίες ή προκαλώντας απώλειες άλλων. Cre recombinase: καταλύει τον ανασυνδυασμό μεταξύ δύο 34bp loxP θέσεων αναγνώρισης loxP αλληλουχίες: μοναδική δομή με παλινδρομικές επαναλήψεις 13bp εκατέρωθεν της κεντρικής 8bp αλληλουχίας Flp recombinase: αλλάζει στην FRT θέση FRT αλληλουχίες: έχει την ίδια δομή αλλά διαφορετική αλληλουχία με το loxP

26 Mεταγραφικοί παράγοντες
Υποκινητής Επιθυμητό γονίδιο Cre ανασυνδυάση Μη λειτουργικό γονίδιο Η Cre μεταγράφεται και μεταφράζεται

27 Επαγώγιμα συστήματα για χρονική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης
Στην αποσαφήνιση μιας βιολογικής, φυσιολογικής ή παθογενετικής, διαδικασίας μερικές φορές δεν αρκεί να μελετήσουμε την συνεχή έκφραση ενός διαγονιδίου. Απαιτείται η έκφραση του διαγονιδίου μόνο σε συγκεκριμένα χρονικά στάδια. Επίσης ειδικά σε περιπτώσεις έκφρασης που ένα γονίδιο είναι θνησιγόνο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη είναι επιθυμητή η έκφρασή του μόνο μετά την γέννηση ή μετά την ενηλικίωση. Για αυτό έχουν δημιουργηθεί συστήματα διαγένεσης που λειτουργούν ως γενετικοί διακόπτες. Είναι δηλαδή δυνατή η επαγωγή ή η καταστολή της γονιδιακής έκφρασης όποτε είναι επιθυμητό. Τet on-off, Tetracycline inducible gene expression

28 Με ποιο τρόπο δημιουργούνται τα επιθυμητά διαγονιδιακά ποντίκια

29 ΔΙΑΓΕΝΕΣΗ ΜΕ: Μικροένεση σε προπυρήνες Εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα Ιικοί φορείς Μεταφορά κυτταρικών πυρήνων από σωματικά κύτταρα (Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT) Zinc Finger Νουκλεάση / Leu Zip (Zinc Finger Nuclease, ZFN / Leu zip Nuclease, LZN) μέσω σπέρματος με χημικό τρόπο ΕΝU (N-ethyl-N-nitrosourea) μέσω sleeping beauty μεταθετών στοιχείων

30 ΕΝU

31 Sleeping beauty μεταθετά στοιχεία

32 Μεταφορά DNA (γονιδιακής κατασκευής) με μικροένεση σε προπυρήνες

33 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ

34 ΠΡΟΣΟΧΗ ! Τα ζώα που προκύπτουν ονομάζονται
υπερεκφραστές (Τg) διότι η εξωγενής γονιδιακή κατασκευή ενσωματώνεται συνήθως σε περισσότερα από ένα αντίγραφα Η τεχνική αφορά σε μικρά κομμάτια DNA (20 kb), σε τμήματα χρωμοσωμάτων που κλωνοποιούνται σε φάγο P1, βακτηριακά χρωμοσώματα BAC ή τεχνητά χρωμοσώματα ζύμης YAC Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι το σημείο της ενσωμάτωσης του ξένου DNA είναι τυχαίο και άρα μη ελεγχόμενο. 34

35 Ταυτοποίηση της ένθεσης του διαγονιδίου
Τα ποντίκια που έχουν ενσωματώσει μία (η περισσότερες) φορές το διαγονίδιο πρέπει αρχικά να ταυτοποιούνται με ανάλυση κατά Southern και όχι με PCR που είναι λιγότερο αξιόπιστη και πληροφοριακή. Με PCR μπορούν να ανιχνεύονται οι απόγονοι των founders. Αν υπάρχουν συγχρόνως και head-to-tail και tail-to-tail και head-to-head arrays και συγχρόνως έχει γίνει ανασυνδυασμός στις περιστοιχίζουσες αλληλουχίες η ανάλυση της ένθεσης και των περιστοιχιζουσών αλληλουχιών γίνεται πολύ πιο πολύπλοκη

36 Ένας πιο κατευθυνόμενος τρόπος για τον καθορισμό της λειτουργίας ενός γονιδίου και την επίπτωση στο φαινότυπο είναι η Κατευθυνόμενη γονιδιακή στόχευση (gene targeting) Η τεχνολογία αυτή επιτρέπει την ενσωμάτωση του εξωγενούς DNA σε συγκεκριμένη γενετική θέση. Επιτυγχάνεται με ομόλογο ανασυνδυασμό μεταξύ της γονιδιακής κατασκευής στόχευσης και του ενδογενούς γονιδίου. 36

37 Κατευθυνόμενη γονιδιακή στόχευση
Μεταφορά DNA (γονιδιακής κατασκευής) με μικροένεση ES κυττάρων σε βλαστοκύστεις

38 Αυτοί οι τύποι ζώων ονομάζονται knock outs (ΚΟ) και knock ins (ΚΙ)
Στην περίπτωση της κατευθυνόμενης γονιδιακής στόχευσης η τεχνητή αλλαγή ενός ενδογενούς γονιδίου (ειδική μετάλλαξη), πραγματοποιείται σε εμβρυϊκά βλαστικά (ES) κύτταρα ποντικού. Αυτοί οι τύποι ζώων ονομάζονται knock outs (ΚΟ) και knock ins (ΚΙ) Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι στα συμβατικά ΚΟ δεν μπορούν να μελετηθούν γονίδια που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και στη λειτουργία του οργανισμού και τούτο γιατί η γενετική τροποποίηση είναι παρούσα στα ζώα από το γονιμοποιημένο ωάριο. 38

39 Κατασκευή και εισαγωγή φορέα στο γονιδίωμα
Ο φορέας πρέπει να αποτελείται από: δύο περιοχές ομολογίας σε κάθε άκρο (συμπληρωματικές για συγκεκριμένες θέσεις του γονιδιώματος) το διακεκομμένο (disrupted gene) γονίδιο που μας ενδιαφέρει το γονίδιο αντίστασης στη νεομυκίνη (neor), μεταξύ των δύο περιοχών ομολογίας το γονίδιο κινάσης της θυμιδίνης (tk) εκτός της ομόλογης περιοχής Αυτό το σύστημα εκμεταλλεύεται τη διαδικασία του ομόλογου ανασυνδυασμού, για να γίνει ανταλλαγή του διακεκομμένο γονιδίου με το κανονικό. Όταν ο φορέας εισαχθεί στο κύτταρο, μπορεί: είτε να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα έπειτα από ομόλογο ανασυνδυασμό (επιθυμητό αποτέλεσμα) είτε να ενσωματωθεί σε μη επιθυμητό σημείο του γονιδιώματος, είτε να μην εισαχθεί καθόλου. Η G418 χρησιμοποιείται για την επιλογή των κυττάρων που φέρουν την νεομυκίνη και επομένως των κυττάρων στα οποία ο φορέας έχει ενσωματωθεί, και η grancyclovir χρησιμοποιείται για την επιλογή κυττάρων, στα οποία ο ομόλογος ανασυνδυασμός έχει γίνει τυχαία.

40 Κατασκευή ενός φορέα (Ανατύπωση από Walinski, 2004)
Κατασκευασμένος φορέας Καμία ενσωμάτωση Στοχευμένη ενσωμάτωση του γονιδίου Τυχαία ενσωμάτωση του γονιδίου κύτταρο που σκοτώνεται από τη νεομυκίνη κύτταρο ανθεκτικό στη νεομυκίνη: σκοτώνεται από το grancyclovir κύτταρο ανθεκτικό στη νεομυκίνη και στο grancyclovir Α = αρχικό αλληλόμορφο Α* = αλληλόμορφο αντικατάστασης = περιοχές ομολογίας =κινάση της θυμιδίνης

41 Γονιδιακή στόχευση για τη δημιουργία ΚΟ ποντικών
Γονιδίωμα ποντικού Ευθυγραμμοποιημένος φορέας-στόχος Το ΚΟ αλληλόμορφο σε ΕS κύτταρα είναι ανθεκτικό σε G418 Δημιουργία χιμαιρικών ποντικών Διασταύρωση ποντικών που φέρουν το ΚΟ αλληλόμορφο 41

42 Με την τεχνολογία αυτή είναι δυνατό να αναπαρασταθούν
πολλές γενετικές αλλαγές οι οποίες συνδέονται με συγκεκριμένη ανθρώπινη νόσο. Η γενετική αλλαγή μπορεί να είναι από σημειακή μετάλλαξη και μικρή έλλειψη μέχρι μεγάλη χρωμοσωμική αλλοίωση. 42

43 «Υπό όρους» μεταλλαξιγένεση (Conditional mutants)
Με την τεχνική αυτή ένα γονίδιο μπορεί να κατασταλεί ή να ενεργοποιηθεί σε ειδικό όργανο ή ιστό, για μια συγκεκριμένη χρονική περίοδο στο ενήλικο άτομο. Με αυτό τον τρόπο παρέχεται η δυνατότητα μεγαλύτερου χρονοτοπικού φαινοτυπικού ελέγχου 43

44 Πώς πραγματοποιείται:
Η «υπό όρους» τροποποίηση του γενετικού υλικού συνδυάζει την τεχνική της γονιδιακής στόχευσης με το σύστημα ανασυνδυασμού ειδικής θέσης Cre/loxP και αποσκοπεί συνήθως στην υπό όρους ενεργοποίηση ή αντικατάσταση ενός γονιδίου. Γι’ αυτό το σκοπό προαπαιτείται η δημιουργία δύο σειρών διαγονιδιακών ποντικών: μιας που φέρει δύο loxP σε συγκεκριμένες θέσεις ενός γονιδίου και μιας δεύτερης σειράς ποντικών όπου η Cre εκφράζεται είτε κυτταροειδικά, ή σε συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο. 44

45 Υπό συνθήκες γονιδιακή στόχευση για τη δημιουργία ΚΟ ποντικών
Γονιδίωμα ποντικού Ευθυγραμμοποιημένος φορέας-στόχος Το ΚΟ αλληλόμορφο σε ΕS κύτταρα είναι ανθεκτικό σε G418 Δημιουργία χιμαιρικών ποντικών Διασταύρωση ποντικών που φέρουν το ΚΟ αλληλόμορφο Το DNA που βρίσκεται ανάμεσα στις θέσεις loxP απομακρύνεται στα κύτταρα που φέρουν την Cre δημιουργώντας ένα KO αλληλόμορφο Διασταύρωση με ποντίκια που φέρουν την Cre ανασυνδυάση 45

46 Η επιτυχής εφαρμογή του συστήματος Cre /loxP στη Μοριακή Γενετική άνοιξε νέους δρόμους στη γενετική τροποποίηση των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών και υπόσχεται ακόμα περισσότερα στον τομέα της γονιδιακής θεραπείας του ανθρώπου. 46

47 Επαγώγιμο από τετρακυλίνη σύστημα γονιδιακής έκφρασης: Tet on-off
Παρέχει τη δυνατότητα ενεργοποίησης ή απενεργοποίησης της μεταγραφής ενός γονιδίου με την παρουσία ή όχι του αντιβιοτικού Dox (παράγωγο της τετρακυκλίνης) Επιτρέπει την αξιολόγηση του ρόλου της επιλεγμένης πρωτεΐνης, η οποία θεωρείται ότι εμπλέκεται στην αιτιολογία ειδικών παθολογιών Επιτρέπει την αξιολόγηση των επακόλουθων της απενεργοποίησής της μετά την εμφάνιση παθολογικών συμπτωμάτων. Έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε πολλά διαφορετικά είδη κυττάρων και οργάνων.

48 Το σύστημα έκφρασης Tet-on /-off
Tet-off tTA + Nτοξικυκλίνη - Nτοξικυκλίνη Tet-on Iστοειδικός μεταγραφή

49 Τρόποι αναστολής της ενδογενούς γονιδιακής ρύθμισης
Τρόποι αναστολής της ενδογενούς γονιδιακής ρύθμισης CreLoxP Tet on-off Antisense RNA/ In vivo-Morhpolinos Moulton JD et al. Using morpholinos to control gene expression. Curr Protoc Mol Biol Jul;Chapter 26:Unit26.8. ZFN Ribozymes Trans dominant negative (act as competitive inhibitors) siRNA Ενδοκυτταρικά αντισώματα (Intrabodies) Αριθμός δημοσιεύσεων (Pubmed database) 49

50 Προγράμματα που έχουν ή πρόκειται να πραγματοποιηθούν
Cre Zoo GPF Zoo KOMP KOICP KOBrcP κά π.χ. American Recovery and Reinvestment Act Signature Project Program (ARRA) για να αντικαταστήσουν τα ανθρώπινα β κύτταρα του παγκρέατος (θεραπεία του διαβήτη)

51 Δημιουργία συστημάτων που να
προσομοιάζουν ανθρώπινες ασθένειες «Προτυποποίηση ασθενειών» Ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών προσεγγίσεων

52 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΠΡΟΤΥΠΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ

53 Τα πρότυπα μπορεί να κατηγοριοποιηθούν ως εξής:
Τα πρότυπα μπορεί να κατηγοριοποιηθούν ως εξής: Αυτοανοσίας CD Αντιγόνων, αντιγονικών υποδοχέων και δεικτών ιστοσυμβατότητας Παραγόντων ανάπτυξης /Υποδοχέων /Κυτταροκινών Ανοσοκαταστολής Φλεγμονωδών καταστάσεων Ενδοκυτταρικών μοριακών σημάτων Δυσλειτουργίες λεμφικών ιστών Μηχανισμών από μολύνσεις με τον ιό του AIDS Ανασυδυασμένων αντιγόνων- διαγονιδίων ειδικών των υποδοχέων των Τ κυττάρων Ελλείψεις των μηνυμάτων των υποδοχέων των Τ κυττάρων Ανάπτυξης εμβολίων

54 B6129S2-lgh-6tm1cgn Στερούνται Β κυττάρων και δεν εκφράζουν διαμεμβρανική IgM Γόνιμα και διατηρούνται Τα χρησιμοποιούμε για να κατανοήσουμε το ρόλο των Β κυττάρων στο ανοσολογικό σύστημα B6.129P2-Tcrbtm1Mom/J Επιβιώνουν και είναι γόνιμα Οι αβ υποδοχείς δεν εκφράζονται με αποτέλεσμα την έλλειψη CD4+, CD8+ Τ κυττάρων Γύρω στους 4-6 μήνες εμφανίζουν φλεγμονώδη νόσο του εντέρου

55 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ
Σύλβα Χαραλάμπους, PhD Νάντια Καβροχωριανού, Βιολόγος- υποψήφια διδάκτωρ Στεργιάτου Ιωάννα, Βιολόγος Φώτης Μπαντούνας, Τεχνολόγος Γιάννης Γρίβας, Βιολόγος, ΜSc, υποψήφιος διδάκτωρ –εξωτερικός συνεργάτης Ελένη Μαλακτάρη, Βιολόγος- επι πτυχίω Mελίνα Μακρυγιαννάκη Βιολόγος- επι πτυχίω

56 LINKS TO TRANSGENIC FACILITIES

57

58

59 Το μέλλον….. Αύξηση της ταχύτητας παραγωγής διαγονιδιακών ζώων
Αύξηση του χρονοτοπικού ελέγχου Βελτίωση της στόχευσης Παραγωγή και ανάλυση σε μεγάλη κλίμακα Δυνατότητα χρήσης συνδυασμένων μεθόδων για την διερεύνηση των πολύπλοκων μοριακών και κυτταρικών αλληλεπιδράσεων

60 Μερικές συζητήσεις σχετικά με τα πειράματα σε διαγονιδιακά ζώα
Τα διαγονιδιακά ζώα πάσχουν από περισσότερες ασθένειες από αυτές που φυσιολογικά μπορεί να παθαίνουν, χωρίς μάλιστα να είναι γνωστές οι παρενέργειες Υπάρχει μεγάλη απώλεια σε ζώα εφόσον αυτά που υπόκεινται σε διαγονιδιακούς χειρισμούς και δεν φέρουν το διαγονίδιο θυσιάζονται Υπάρχει κίνδυνος διαφυγής στο περιβάλλον και σοβαρές επιπτώσεις από αυτό. Υπάρχει αμφισβήτηση της αξίας δημιουργίας τέτοιων ζώων, αν δηλαδή το όφελος εξισορροπεί το κόστος της χρήσης αυτών των ζωντανών οργανισμών 60

61 ΕΜΜΑ http://www.emmanet.org/index.php
ΙSTT MUGEN

62 Εργαστήριο Διαγονιδιακής Τεχνολογίας
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Νάντια Καβροχωριανού Βιολόγος Γιάννης Γρίβας Βιολόγος Εργαστήριο Διαγονιδιακής Τεχνολογίας