Τεχνικές μελέτης καρκίνου

Παρουσίαση με θέμα: "Τεχνικές μελέτης καρκίνου"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Τεχνικές μελέτης καρκίνου
Μορφολογία (πρότυπο ανάπτυξης, μορφολογία κυττάρων, υποστρώματος κτλ.) Ιστοχημεία (ειδικές κυτταροχημικές χρώσεις) Ανοσοϊστοχημεία (ταυτοποίηση προέλευσης κυττάρων, δείκτες διαφοροποίησης, πολλαπλασιασμού κ.α.) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Κυτταρομετρία ροής Κυτταρογενετική Μοριακή διαγνωστική

2 Ειδικές Ιστοχημικές Χρώσεις
Mycobacterium tuberculosis in lung, Ziehl-Neelsen acid fast stain Glycogen in Ewing's sarcoma, PAS stain

3 The t(14;19)(q32;q13)-positive small B-cell leukaemia
Morphological features of bone marrow and lymph node specimens: (A–C) bone marrow aspirate smears showing atypical morphology of neoplastic cells (×1000); (A) many of the neoplastic cells have high nuclear:cytoplasmic ratio and nuclear indentations (case 2); (B) heterogeneous mixture of small and medium cells with indented nuclei (case 3); (C) heterogeneous mixture of small to large cells with rare vacuolated cells and nuclear indentations (case 4). (D) The bone marrow core biopsy contains an interstitial to diffuse infiltrate of predominantly small lymphocytes (×100) (case 4). (E) Higher magnification of core biopsy demonstrates admixed larger cells (×400) (case 4). (F) The neoplastic cells in bone marrow biopsy strongly express CD20 (×400) (case 2). (G) Many of the neoplastic cells show strong nuclear staining for bcl3. (H) The lymph node architecture is effaced by a diffuse proliferation of predominantly small lymphoid cells with occasional pale proliferation centres (×100) (case 4). (I) Higher magnification of proliferation centre in lymph node (×400) (case 4).

4 The t(14;19)(q32;q13)-positive small B-cell leukaemia
Representative immunophenotypic analysis by flow cytometry demonstrates that the neoplastic cells express CD5, CD19, CD20 (bright), CD79b, FMC7 and monotypic kappa light chain (case 2)

5 The t(14;19)(q32;q13)-positive small B-cell leukaemia
A representative karyogram demonstrates the t(14;19)(q32;q13) and +12 (case 3)

6 Fluorescence in situ hybridization

7 Real-Time PCR

8 Real-Time PCR

9 Real-Time PCR

10

11 Advantages of Real-Time PCR
No post-PCR manipulation is required. Thus, the results are available as soon as PCR is completed (i.e., within two hours) decreasing the turnaround time and additionally reducing the risk of PCR contamination. This methodology allows co-amplification and detection of a normalizer gene (housekeeping gene and/or positive internal control) in the same tube to obtain accurate quantitative measurements and to confirm the presence of amplifiable DNA in a test sample. Decreased variability, because the collection of the data is performed during the exponential phase of the PCR, thus the results are not influenced by limited reagents. As the TaqMan probe is complementary to the target, the assay is target specific. High sensitivity, 1 tumor cell in 100,000 normal cells can be detected.

12 t(2;5)(p23;q35) Methods of detection RT-PCR Long-range PCR
Classical cytogenetics FISH ALK immunostaining

13

14

15 Τραχηλικός λεμφαδένας
Η&Ε

16 CD3

17 CD5

18 CD20

19 Ki67 (MIB-1)

20 Πολυκλωνικά T λεμφοκύτταρα (control)
Συνδυασμός εκκινητών: Vβ+Jβ1+Jβ2 (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων bp) 2

21 Μονοκλωνικά Τ λεμφοκύτταρα (control) Συνδυασμός εκκινητών: Vβ+Jβ1+Jβ2
3

22 Μονοκλωνικός πληθυσμός Τ λεμφοκυττάρων (βέλη)
ΑΣΘΕΝΗΣ Συνδυασμός εκκινητών: Vβ+Jβ1+Jβ2 (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων bp) Μονοκλωνικός πληθυσμός Τ λεμφοκυττάρων (βέλη) 4

23 Ύπαρξη μονοκλωνικού πληθυσμού Τ λεμφοκυττάρων (βέλος)
Ασθενης Συνδυασμός εκκινητών: Dβ+Jβ (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων και bp) Ύπαρξη μονοκλωνικού πληθυσμού Τ λεμφοκυττάρων (βέλος) 10

24 8 Πολυκλωνικά Β λεμφοκύτταρα (control)
Συνδυασμός εκκινητών FR3: VH1-7+JH consensus (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων bp) 8

25 9 Μονοκλωνικά Β λεμφοκύτταρα (control)
Συνδυασμός εκκινητών FR3: VH1-7+JH consensus 9

26 10 ΑΣΘΕΝΗΣ (μυελός) Συνδυασμός εκκινητών FR3: VH1-7+JH consensus
(αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων bp ) Ύπαρξη μονοκλωνικού πληθυσμoύ Β λεμφοκυττάρων (βέλος) 10

27 p-loop Catalytic domain Activation loop Υ253Η M244V L248Q E355G L364I
V379I S417Y E450G E459K M351T E255K F359V L370P T315I Μεθοδολογία ελέγχου ύπαρξης μεταλλάξεων στην κινάση Abl Απομόνωση RNA από 10cc ηπαρινισμένου περιφερικού αίματος (Qiagen RNA blood) Εκτίμηση ποιότητας/ποσότητας RNA (Agilent 2100 Bioanalyzer) Ανάστροφη μεταγραφή 1 μg RNA προς cDNA Εκτέλεση PCR αντίδρασης, με κατάλληλους εκκινητές, για τον πολλαπλασιασμό του υβριδικού γονιδίου BCR/ABL. 2μl από την πρώτη PCR χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση 2ης PCR για τον πολλαπλασιασμό του ABL του υβριδικού γονιδίου BCR/ABL, με κατάλληλους εκκινητές. (S. Branford et al, Blood, 2002; ) BCR ABL 1η PCR 2η PCR (820bp) Κλωνοποίηση PCR προιόντος σε ΤΑ vector Διαμόλυνση E. Coli (TOP10F) και απομόνωση πλασμιδιακού DNA από 7 αποικίες Ανάλυση αλληλουχίας βάσεων πλασμιδίων (Beckman-Coulter CEQ8000), με ανάγνωση και από τις δύο κατευθύνσεις Σύγκριση των αλληλουχιών βάσεων των πλασμιδίων με τη γενωμική αλληλουχία του γονιδίου ABL. Με την τεχνική αυτή έχουμε ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο ΑBL που εμπεριέχεται στο παθολογικό υβριδικό γονίδιο BCR/ABL με ευαισθησία 14%. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ Aνιχνεύθηκε η μετάλλαξη Ε255Κ σε 4 από τις 7 αλληλουχίες που αναλύθηκαν.

28 Bcr/abl abl Ασθενης

29 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
Λειομυοσάρκωμα Σάρκωμα Ewing

30 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
Μελάνωμα Μεσοθηλίωμα