Odredjivanje brojnosti mikroorganizama

Παρουσίαση με θέμα: "Odredjivanje brojnosti mikroorganizama"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Odredjivanje brojnosti mikroorganizama

2 Odredjivanje brojnosti mikroorganizama
Može se vršiti: Direktnim metodama –neposredno, odredjuje se ukupan broj mikroorganizama, nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja živih i mrtvih ćelija Indirektnim metodama (odgajivačke, optičke)-posredno posmatranje mikroorganizama metodama izolacije i gajenja u laboratoriji, broje se samo žive ćelije

3

4 Direktne metode Metoda po Breed-u – brojanje mo na obojenom razmazu suspenzije na odredjenoj površini predmetnice Komore za brojanje – primenjuje se za brojanje mo većih dimenzija (alge, kvasci, krupnije bakterije spore gljiva i plesni) u uzorku vode odredjene zapremine, sitniji mo padaju na dno komore i teže se uočavaju pod mikroskopom Membranski filtri – metoda bakteriološke filtracije, koriste se nitrocelulozni filtri

5 Metoda po Breed-u brojanje mo na prosto bojenom preparatu
ispod predmetnice stavi se milimetarska hartija na predmetnicu se nanese 0,01ml suspenzije i napravi razmaz na površini od 4cm2, susenje, fiksiranje, prosto bojenje posmatranje pod imerzijom za svaki mikroskop se posebno pri korišćenju odgovarajućeg uveličanja odredi koeficijent K K=P/p=P/4 P-površina razmaza (4cm2), p-povrsina vidnog polja (p=r2·π=r2·3,14), r se odredjuje pomoću objekt mikrometra brojanje se vrši u 50 vidnih polja, a zatim se izračuna prosečan br. mo po jednom vidnom polju (a) A=a·K·100 A-ukupan br. mo u 1ml

6 Komore za brojanje -Thoma-ova komora-
debela staklena pločica na čijoj sredini su dva udubljenja, izmedju udubljenja je srednje polje pločice srednje polje je 0,1mm niže od druga dva polja izmedju kojih se nalazi na srednjem polju je ugravirana kvadratna mreža koja se sastoji od 25 velikih kvadrata, a svaki veliki kvadrat je podeljen na 16 malih kvadrata (cela komora izdeljena je na 400 malih kvadrata) stranica malog kvadrata iznosi 1/20mm, a površina 1/400mm2, površina cele komore je 1mm2 visina stupca suspenzije u kojoj se broje mo iznad kvadratne mreže iznosi 0,1mm, pa je zapremina suspenzije 1/4000mm3

7 Postupak odredjivanja ukupnog br. mo pomoću komore za brojanje
Sterilnom pipetom nanese se kap suspenzije na kvadratnu mrežicu, prekrije pokrovnicom Mikroskopiranje (objektiv 40x), u vidno polje postavi se veliki kvadrat u gornjem levom uglu i izbroje mo u svih 16 malih kvadrata (ćel. koje se nalaze na graničnim linijama broje se, ali samo ako se nalaze na 2 stranice kvadrata), brojanje se izvodi u 5-10 velikih kvadrata Izračunavanje ukupnog br. mo u 1ml suspenzije (N) N=m·n·400·10000/Q m - ukupan br. ćel. u kvadratima u kojima je izvršeno brojanje n - razredjenje suspenzije, ako je pravljeno Q - br. malih kvadrata u kojima je izvršeno brojanje m/Q – prosečan br. ćel. po malom kvadratu

8 Membranski filtri za kvantitativne analize se najčešće koriste membranski filtri čija je veličina pora 0,2μm pre upotrebe filtri se moraju pripremiti za rad na ivici filtra grafitnom olovkom označi se br. probe, filter se prokuva u destilovanoj vodi (istiskuje se vazduh iz pora) pre filtracije steriliše se pribor sterilan levak se kroz gumeni zapušač postavlja na bocu, čiji se ispust koristi za spajanje sa vakuum pumpom filter se postavi na nosač u levku za filtraciju i pomoću vakuuma filtrira željena količina uzorka za odredjivanje br. bakterija filtrira se različita količina vode, u zavisnosti od čistoće vode

9 Membranski filtri filter se nakon filtracije fiksira u pari formalina, suši, a zatim boji bojenje se vrši 5% rastvorom eritrozina u 5% karbolnoj vodi 2h, pri čemu se boje i mrtve i žive ćelije odbojavanje se vrši prenošenjem filtra u seriju petri ploča sa filter hartijom natopljenom destilovanom vodom (površina membranskog filtra na kojoj su zadržane bakterije boji se svetlo ružičasto, dok se bakterije boje intenzivno crveno) bojenje može da se vrši i DAPI bojom (4-6-diamidin-2-fenilindol) koja je visoko specifična za DNK žive ćelije, gradeći kompleks koji fluorescira svetloplavo

10 Odredjivanje broja mikroorganizama membranskim filtrima
Suv membranski filter stavlja se na predmetnicu preko kapi imerzionog ulja, a zatim se na gornju stranu filtra nanosi još jedna kap imerzionog ulja Mikroskopira se uljanom imerzijom, koristeći pri tom okularnu mrežicu Brojanje se vrši u vidnih polja okularne mrežice Broj mo direktnim metodama se odredjuje po odgovarajućim formulama Ukoliko se za odredjivanje ukupnog broja mo koristi isti pribor za filtraciju, isti mikroskop, broj vidnih polja i količina profiltrirane vode, postupak izračunavanja ukupnog br. bakterija u 1cm3 ispitivane vode (n) dobija se množenjem prebrojanih bakterijskih ćelija (b) sa koeficijentom K

11

12 Odredjivanje broja mikroorganizama membranskim filtrima
n=b·K K=a·106/c·d·e a-površina filtera u mm2 106-prevodjenje mm2 u μm2 b-broj bakterija u vidnom polju c-površina okularne mrežice pri tom uvećanju d-količina profiltrirane vode u ml e-broj vidnih polja u kojima se broje bakterije na površini c

13 Odgajivačke metode za odredjivanje brojnosti mikroorganizama
Bira se podloga i uslovi kultivacije (temperatura, dužina inkubacije…) koji su selektivni za željeni mo, a nepovoljni za neželjene mo Strategija obogaćivanja kulture je da oponaša što je moguće više uslove koji postoje u sredini u kojoj se željeni mo nalazi i na taj način omogući izolaciju stanovnika takive sredine Primenjuju se klasične metode razredjivanja i zasejavanja odgovarajućeg razredjenja na tečne ili čvrste podloge Na čvrstim podlogama (CFU-Colony Forming Unit)-validan br. kolonija na petri ploči Na tečnim podlogama (MNP-Most Probable Number)-čitanje se vrši po Mac Crede tablicama iz serije razredjenja

14 Odredjivanje broja mikroorganizama na čvrstim hranljivim podlogama
Pripremi se sterilisana agarizovana hranljiva podloga, razlije se u petri ploče Na podlogu se sterilnom pipetom nanosi 0,1ml inokuluma iz odgovarajućeg razredjenog uzorka i sterilnim stapićem razmaže po površini podloge (radi se u 3-5 ponavljanja) Petri ploče se odlažu u termostat na inkubaciju u obrnutom položaju Nakon inkubacije vrši se brojanje Računa se prosečan broj kolonija po petri ploči, a brojnost se izražava u 1ml uzorka (množenjem prosečnog br. kolonija sa primenjenim razredjenjem)

15 Pravljenje razredjenja

16 Pravljenje razredjenja

17 Odredjivanje broja mikroorganizama na čvrstim hranljivim podlogama

18 Odredjivanje broja mikroorganizama na čvrstim hranljivim podlogama
Heterotrofne bakterije u vodi-MPA, inkubacija 5-6 dana, 26°C, a br. potencijalno patogenih na istoj podlozi, inkubacija 48h na 37°C Koliformne bakterije u vodi u kojoj se ne očekuje njihova veća zastupljenos (voda za piće)-filtriranje ml vode kroz bakteriološke filtre, filtri se postavljaju na površinu endo-agara u petri ploči, inkubacija 24-48h na 37°C, koli indeks -broje se crvene kolonije sa metalnim sjajem izrasle na filtru, a rezultat se izražava kao br. koliformnih mikroorganizama u 100ml vode

19 Odredjivanje broja mikroorganizama na čvrstim hranljivim podlogama

20 Odredjivanje broja mikroorganizama na tečnim hranljivim podlogama
Zasejavanje serije razredjenja (iz svakog razredjenja u 3-5 ponavljanja) u tečne hranljive podloge razlivene i sterilisane u epruvetama Nakon inkubacije vrši se očitavanje broja pozitivnih epruveta iz svakog korišćenog razredjenja (epruvete u kojima se uočava rast) Najverovatniji broj mikroorganizama se očitava pomoću tablica po Mac Credy-ju

21 Odredjivanje broja mikroorganizama na tečnim hranljivim podlogama

22 Odredjivanje broja mikroorganizama optičkim metodama
Zasnivaju se na opštim principima merenja mutnoće optičkim aparatima (kolorimetar, nefelometar, turbidometar, spektrofotometar) Najčešće se primenjuju za odredjivanje broja mo u čistim kulturama Metoda se ne može primenjivat za odredjivanje brojnosti u supstratima koji se boje, koji pored mo sadrže i druge suspendovane materije, ili kod mo koji nemaju homogen rast Pre nego što se pristupi odredjivanju brojnosti neophodno je napraviti kalibracionu krivu za svaki aparat, odnosno soj mo čija se brojnost odredjuje Kalibraciona kriva pokazuje zavisnost izmedju gustine mo i procenta apsorpcije svetlosti

23 Odredjivanje broja mikroorganizama optičkim metodama
Do kalibracione krive se dolazi na taj način što se napravi serija razredjenja ispitivane kulture, izmeri % apsorpcije svetla (ili ekstinkcija kod nekih aparata) i odredjuje brojnost direktnom ili odgajivačkom metodom Rezultati merenja i brojnost se unesu u koordinatni sistem, a zatim konstruiše kalibraciona kriva Kriva omogućuje brzo odredjivanje brojnosti na osnovu izmerene apsorpcije svetlosti datog uzorka

24 Odredjivanje broja mikroorganizama optičkim metodama

25 Bakterije kao indikatori stanja kvaliteta vode sa ekološkog aspekta
Mikrobiološki (bakteriološki) indikatori stanja i kvaliteta voda sa šireg ekološkog aspekta: Ukupan broj bakterija (T) Broj aerobnih heterotrofa (H) hemoorganotrofi Broj fakultativnih oligotrofa (FO) Zastupljenost i brojnost različitih fizioloških grupa bakterija Mikrobiološki (bakteriološki) indikatori stanja i kvaliteta površinskih voda sa sanitarno-ekološkog aspekta: Ukupne koliformne bakterije (UK), 37°C, laktoza+ Fekalne koliformne bakterije (FK), 44°C, metalni sjaj, E. coli

26 Odgajivačke metode heterotrofi (H) fakultativni oligotrofi (FO)
organska materija je izvor C, izvor E i e- aerobni heterotrofi (saprofiti) su indikator kvaliteta vode sa aspekta njenog organskog zagađenja (opterećenosti) podloga: MPA- meso-peptonski agar inkubacija: 5-7 dana , 22-26° C klasifikacija vode po Kohlu, 1975 fakultativni oligotrofi (FO) naseljavaju sredine sa vrlo niskim koncentracijama organskih materija, a mogu se nalaziti i u sredinama sa višim koncentracijama tih materija indikatori su voda koja su manje opterećene materijama organske prirode podloga: MPA 1:10, sadrži deste puta manje org. materije inkubacija: 5-7 dana, 22-26°C

27 Kategorizacije voda na osnovu različitih parametara