Κεφάλαιο 4ο: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Παρουσίαση με θέμα: "Κεφάλαιο 4ο: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Κεφάλαιο 4ο: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA
Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης Γ΄ Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κεφάλαιο 4ο: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Θοδωρής Καλαϊτζής

2 Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA
Ανασυνδυασμένο μόριο DNA: Τεχνητό μόριο DNA με γονίδια από 2 ή περισ. οργανισμούς. Εισαγωγή του (τους) σε βακτήρια ή ευκαρ. κυτ.  Γενετικά τροποποιημένα κυτ. ζουν και αναπαράγονται  Ιδιότητες (απογόνους) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ: Τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό. Α. Κατανόηση μυστηρίων ζωής και εξέλιξης (Γη) Β. Βελτίωση υγείας και τρόπου διαβίωσης Θοδωρής Καλαϊτζής

3 Μεταφορά γεν. υλικού μεταξύ οργανισμών
Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA: Απομόνωση ολικού DNA (δότης) + Κόψιμο με περιοριστικές ενδονουκλεάσες + Ένωση με φορέα κλωνοποίησης (= πλασμίδιο ή DNA φάγων  ανεξάρτητος αυτοδιπλασιασμός) Μεταφορά του σε κύτ. ξενιστή: Εισαγωγή σε βακτήριο = Μετασχηματισμός. Επιλογή & Απομόνωση ξενιστών: Μόνο τα κυτ. με ανασ/νο DNA  Αυτά πολ/νται και δίνουν βακτηριακούς κλώνους Επιλογή κλώνου με επιθυμητό τμήμα DNA: Με ειδικά μόρια ανιχνευτές Θοδωρής Καλαϊτζής

4 ΚΛΩΝΟΙ Κλώνος: Ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.
Κλωνοποίηση: Κατασκευή (κατά προτίμηση μεγάλου αριθμού) πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών. Χιλιάδες κλώνοι που παράγονται με βήμα 3 (προηγούμενη διαφάνεια): Καθένας περιέχει ένα ανασυνδυασμένο μόριο DNA διαφορετικό από τους υπόλοιπους κλώνους (ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ!) Θοδωρής Καλαϊτζής

5 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες
Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Παραγωγή από βακτήρια Προστασία από εισβολή «ξένου» DNA (φυσιολογικός ρόλος) Αναγνώριση ειδικών αλληλουχιών 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA (και ειδικό κόψιμό τους) Π.χ. EcoRI (Ε. coli): 5΄-GAATTC- 3΄ 3΄-CTTAAG- 5΄ Μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα Σχηματισμός δ. Η μεταξύ άκρων και βάσεων άλλων κομματιών DNA (κομμένων με ίδιο τρόπο) Αλληλουχία GAATTC διάσπαρτη σε γονιδιώματα οργαν. Θοδωρής Καλαϊτζής

6 Φορείς κλωνοποίησης Κόψιμο γονιδιώματος σε χιλιάδες κομμάτια με την EcoRI  Ενσωμάτωση κομματιών σε ειδικούς φορείς κλωνοποίησης (πλασμίδια, DNA φάγων) Πλασμίδια που επιλέγονται: Αλληλουχία 1 φορά μόνο [1ο κριτήριο επιλογής] + Κόψιμο από EcoRI και δημιουργία γραμμικού μορίου με μονόκλωνα άκρα Ανάμιξη δύο ειδών DNA και ένωση με DNA δεσμάση  Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων (κάποια ξαναγίνονται κυκλικά, χωρίς DNA του οργανισμού) Θοδωρής Καλαϊτζής

7 Μηχανισμοί ανασυνδυασμού του DNA
Θοδωρής Καλαϊτζής

8 Μετασχηματισμός Βακτήρια-ξενιστές: δέχονται μικρό αριθμό πλασμιδίων - μερικά μόνο πλασμίδια (ακόμα λιγότερα) είναι ανασυνδυασμένα. Χρησιμοποίηση ως ξενιστές: Βακτήρια χωρίς πλασμίδια (ευαισθησία σε αντιβιοτικά)  Επιλογή αυτών των (ελάχιστων) βακτηρίων παρουσία αντιβιοτικού λόγω γονιδίου ανθεκτικότητας (που βρίσκεται στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο) [2ο κριτήριο επιλογής] Είσοδος πλασμιδίου σε βακτήρια, λόγω προηγούμενης κατεργασίας  Τοιχώματα παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια Θοδωρής Καλαϊτζής

9 Κλωνοποίηση Είναι η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων (εξειδικευμένος ορισμός εδώ) ΚΑΘΕ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΜΕ 1 ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΖΕΤΑΙ ΚΑΙ ΔΙΝΕΙ 1 ΚΛΩΝΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ: Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού δότη Επιλογή ενός κλώνου (με το επιθυμητό γονίδιο): με ειδικά μόρια-ανιχνευτές. Μεγαλύτερα τμήματα ξένου DNA  Φορέας: βακτηριοφάγος λ. Θοδωρής Καλαϊτζής

10 Ανακεφαλαίωση Θοδωρής Καλαϊτζής

11 Κλωνοποίηση mRNA: Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης (1)
Ανώτεροι ευκαρ. οργ. : Μεταγραφή πολλών γονιδίων σε ορισμένους κυτ. τύπους (π.χ. αιμοσφαιρίνες->πρόδρομα ερυθροκύτταρα) Κλωνοποίηση γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα: cDNA βιβλιοθήκες. Αυτές: 1. Περιέχουν αντίγραφα όλων των, εκφραζόμενων στα κύτταρα αυτά, γονιδίων 2. Απομόνωση μόνο εξωνίων (αλληλουχιών που μεταφράζονται σε αμινοξέα). Θοδωρής Καλαϊτζής

12 Κλωνοποίηση mRNA: Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης (2)
mRNA ως καλούπι για σύνθεση cDNA (αντίστροφη μεταγραφάση)  υβρίδια mRNA-cDNA Διάσπαση mRNA (χημ. ουσίες) ή αποδιάταξή του με θέρμανση cDNA ως καλούπι για σύνθεση συμπληρ. αλυσίδας DNA  δίκλωνα DNA Εισαγωγή δίκλωνων μορίων σε πλασμίδια ή φάγους και κλωνοποίησή τους ΕΤΣΙ: Σύνθεση σε κυτ. Ξενιστή της επιθυμητής πρωτ. Θοδωρής Καλαϊτζής

13 Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης
Θοδωρής Καλαϊτζής

14 Υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων (1)
Αποδιάταξη: Σπάσιμο δ. Η μεταξύ συμπληρωματικών αλυσίδων DNA-DNA (ή DNA-RNA) και αποχωρισμός τους, λόγω επίδρασης χημ. ουσιών ή αύξησης θερμ.  Επανασύνδεση συμπληρ. αλυσίδων σε κατάλληλες συνθήκες Υβριδοποίηση: Σύνδεση μονόκλωνων συμπληρ. αλυσίδων DNA-DNA ή DNA-RNA. Λόγω υβριδοποίησης: Ανίχνευση με γνωστό μόριο DNA, του συμπληρωματικού του (μέσα σε χιλιάδες άλλα κομμάτια) Θοδωρής Καλαϊτζής

15 Υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων (2)
Γονιδιωματική βιβλιοθήκη (κομμάτια κλωνοποιημένου χρωμοσωμικού DNA): Κομμάτια με ολόκληρα γονίδια Κομμάτια τμήματα γονιδίων Κομμάτια με τμήματα DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες Από όλα αυτά, «ψαρεύουμε» αυτό (ή αυτά) που θέλουμε με χρήση ιχνηθετημένων μορίων DNA ή RNA (μόρια ανιχνευτές) [σελ. 14- Ιχνηθέτηση?] Θοδωρής Καλαϊτζής

16 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Δημιουργία πολλών αντιγράφων 1 γονιδίου  Μελέτη συγκεκριμένου γονιδίου & Παραγωγή πρωτεΐνης (σε μεγάλες ποσότητες) PCR: Επιλεκτική αντιγραφή (εκατομμύρια φορές) ειδικών αλληλουχιών DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου. Από 1985: Ιατρική (διάγνωση ασθενειών π.χ. AIDS), Εγκληματολογία (διαλεύκανση υποθέσεων) & Παλαιοντολογία (μελέτη DNA από απολιθώματα) Θοδωρής Καλαϊτζής

17 PCR Θοδωρής Καλαϊτζής