Πρακτική άσκηση 09/07 – 31/08/2012 Από τους φοιτητές: Μαρία Καϊάφα Γιώργος-Πορφύριος Γαζής Μιχάλης Σαρδέλης Του τμήματος Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής.

Παρουσίαση με θέμα: "Πρακτική άσκηση 09/07 – 31/08/2012 Από τους φοιτητές: Μαρία Καϊάφα Γιώργος-Πορφύριος Γαζής Μιχάλης Σαρδέλης Του τμήματος Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Πρακτική άσκηση 09/07 – 31/08/2012 Από τους φοιτητές: Μαρία Καϊάφα Γιώργος-Πορφύριος Γαζής Μιχάλης Σαρδέλης Του τμήματος Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής

2 Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας Επιβλέπων καθηγητής: Δημήτριος Τσιτσιγιάννης, Επίκουρος Καθηγητής Φυτοπαθολογίας

3 Η πρακτική μας άσκηση χωρίστηκε σε δύο τμήματα : 1) στην εκτέλεση του πειράματος «Επίδραση των αιθέριων ελαίων στην ανάπτυξη του μύκητα Aspergilus flavus και στην παραγωγή αφλατοξίνων». 2) Στην παρακολούθηση και συμμετοχή σε πειράματα και εργασίες των πτυχιακών φοιτητών του εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας.

4 Επίδραση των αιθέριων ελαίων στην ανάπτυξη του μύκητα Aspergillus flavus και στην παραγωγή αφλατοξίνων. 1) Επίδραση των αιθέριων ελαίων στην ανάπτυξη του μύκητα Aspergillus flavus και στην παραγωγή αφλατοξίνων. Σκοπός πειράματος: Εξετάζουμε πως τα αιθέρια έλαια επηρεάζουν την τοξικότητα των στελεχών Γ3-5 Α -1 και Alf3α του μύκητα Aspergillus flavus(εικ1). Για την ανάλυση των αφλατοξίνων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος TLC Εικόνα 1

5 Γενικές πληροφορίες για τον Aspergillus flavus Πρόκειται για ασκομύκητα της κλάσης των πλεκτομυκήτων και τάξης Eurotiales Παράγει αλφατοξίνες-μυκοτοξίνες που είναι τοξικές και καρκινογόνες για τον άνθρωπο και τα ζώα

6 Το θρεπτικό υπόστρωμα στο οποίο αναπτύχθηκε ο μύκητας είναι το coconut count agar (CCA) Επιλέξαμε αυτό το υπόστρωμα καθώς τα τριβλία στα οποία αναπτύσσονται τοξικογόνα στελέχη του μύκητα αποκτούν ένα πράσινο ή μπλε φθορίζον χρώμα όταν φωτίζονται με λάμπα UV. Συνταγή: Για την παρασκευή 1 L θρεπτικού υποστρώματος CCA χρησιμοποιούμε: 500 γρ ινδική καρύδα 1000 ml απιονισμένο νερό

7 Εικόνες 2,3,4 :ρύθμιση του pH του υποστρώματος. Εικόνα 2 Εικόνα 3 Εικόνα 4

8 Τα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν είναι(εικ 5) : 1) ODI (6ml) 2) CRS (4.5 ml) 3) SOF (5ml) 4) MOF (2ml) 5) IVI (5ml) 6) HOF (2ml) 7) OVU (5-6ml) Εικόν5

9 Εκτέλεση του πειράματος - Αρχικά φιλτράραμε και μεταφέραμε τα αιθέρια έλαια σε καινούργια και αποστειρωμένα σωληνάκια falcon (εικόνες 6,7). εικόνα 6: φίλτρο Εικόνα 7

10 Τοποθέτηση των ελαίων σε καινούργια σωληνάκια falcon (εικόνες 8,9). Εικόνα 9 Εικόνα 8

11 Από κάθε έλαιο παίρναμε 1ml και το τοποθετούσαμε σε σωληνάκι falcon μαζί με 18 ml CCA και 1ml αποστειρωμένο νερό. Για κάθε ένα από τα αιθέρια έλαια κάναμε 2 επαναλήψεις της παραπάνω διαδικασίας. Δηλαδή σε κάθε έλαιο αντιστοιχούσαν 2 σωληνάκια falcon, ένα για κάθε ένα από τα 2 στελέχη του μύκητα.( Γ3-5 Α -1 και Alf3α)

12 Εικόνα 10: εισαγωγή ελαίου Εικόνα 11: εισαγωγή CCA Eικόνα 12: εισαγώγη νερού Εικόνα 13: το τελικό μείγμα Εικονα 11 Εικόνα 10 Εικόνα 12 Εικόνα 13

13 Έπειτα έγινε η τοποθέτηση των συνολικά 16 δειγμάτων σε ομόλογο αριθμό τρυβλίων(εικ 14). Το υπόλοιπο CCA τοποθετήθηκε σε τριβλία που δεν είχαν κάποιο αιθέριο έλαιο (για χρήση ως μάρτυρες). Τέλος όλα τα τριβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 28˚C. Εικόνα 14

14 Ύστερα σε 2 tube βάζουμε 1000μl αποστειρωμένο νερό, ένα για κάθε στέλεχος του μύκητα (εικ 15). Σε άλλα 2 tube βάζουμε 900μl αποστειρωμένο νερό, ένα για κάθε στέλεχος του μύκητα. Μέσα στα 2 πρώτα tube βάζουμε κονίδια από τα στελέχη Γ3- 5 Α -1 και Alf3α (εικ 16). Εικόνα 15 Εικόνα 16

15 Από αυτά τα tube που περιέχουν τα κονίδια παίρνουμε 100μl και τα βάζουμε στα 2 tube που είχαμε βάλει 900μl αποστειρωμένο νερό. Ύστερα μετράμε τα κονίδια στο αιματοκυτταρόμετρο για να ρυθμίσουμε 10 6 συγκέντρωση κονιδίων/ml (εικ 17,18). Εικόνα 17 Εικόνα 18

16 Ύστερα παίρναμε ποσότητα από τις συγκεντρώσεις κονιδίων που έχουμε φτιάξει και τις απλώνουμε με το spreader στα τρυβλία με το CCA και τα αιθέρια έλαια (εικ19,20). Τέλος αφήσαμε τα τρυβλία στο επωαστικό θάλαμο για να αναπτυχθεί ο μύκητας. Εικόνα 19 Εικόνα 20

17 Συνέχεια του πειράματος στην απαγωγό: Βγάλαμε τα τρυβλία από το θάλαμο (είχαν αποκτήσει πράσινο χρώμα καθώς είχε αναπτυχθεί το μυκήλιο). Από κάθε τρυβλίο κόψαμε 15 «δισκάκια» με τη βοήθεια φελλοτρυπητήρα διαμέτρου 9mm, τα οποία τοποθετήσαμε με τη βοήθεια νυστεριού σε falcon Έπειτα τοποθετήσαμε 7,5 ml χλωροφόρμιο σε κάθε ένα από τα συνολικά 32 falcon που προέκυψαν. Εν συνεχεία κάναμε vortex σε κάθε ένα από τα falcon επί 1 λεπτό. Τέλος αφήσαμε τα έτοιμα falcon στην απαγωγό για ένα βράδυ.

18 Εικόνες 21, 22 : τα τρυβλία μετά την κοπή Εικόνα 23 : τα 15 «δισκάκια» στα falcon Εικόνα 21 Εικόνα 22 Εικόνα 23

19 Προτελευταίο σταδιο στη φυγόκεντρο: Πήραμε τα falcon από την απαγωγό. Αφαιρέσαμε το μείγμα (χλωροφόρμιο + κονίδια) που υπήρχε εντώς, σε άλλα falcon αφού τα είχαμε ονομάσει. Ακολούθησε φυγοκέντριση του διαλύματος για 6 λεπτά στις 1000 στροφές(εικ.24) Τέλος, μεταφέραμε το υπερκείμενο σε γυάλινα βαζάκια και τα αφήσαμε στην απαγωγό για 2 μέχρι να εξατμιστεί το υγρό. Εικόνα 24

20 Προετοιμασία TLC plate. Με χάρακα και μολύβι ορίσαμε τις αποστάσεις του TLC plate που χρησιμοποιήσαμε, καθώς και τα σημεία που εγχύθηκαν οι ποσότητες από το κάθε βαζάκι. Σε κάθε βαζάκι προσθέσαμε 100 μl χλωροφόρμιο και στην συνέχεια το ανακινήσαμε με το vortex. Ύστερα μεταφέραμε 10μl διαλυματος από τα βαζάκια στις αντίστοιχες θέσεις στο TLC plate προσεκτικά. Αφού μεταφέραμε τις μικροποσότητες, τοποθετήσαμε το TLC plate μέσα σε γυάλινο δοχείο παρακολούθησης (εικ. 25), το οποίο περιείχε 96 ml αιθέρα, 3 ml μεθανόλη και 1ml αποστειρωμένο νερό.

21 Μετά από περίπου 1 ώρα η στάθμη έφτασε στην πάνω γραμμή και βγάλαμε το TLC plate από το δοχείο και το αφήσαμε να στεγνώσει σε απορροφητικό χαρτί. Τέλος, σε συνθήκες σκότους και με την χρήση UV λάμπας παρατηρήσαμε ότι η μέθοδος TLC δεν έδωσε αποτελέσματα. Αυτό πιθανόν οφείλεται σε διάφορους παράγοντες που είναι υπό διερεύνηση. Εικόνα 25

22 2) Άλλες εργασίες στις οποίες συμμετείχαμε: 1. Μόλυνση φυτών ντομάτας και μελιτζάνας με διαφορετικά στελέχοι του μύκητα Verticillium dahliae Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήσαμε ήταν το potato dextrose agar (PDA) και το Sucrose Sodium Nitrate (SSN).

23 Προετοιμασία για την μόλυνση Στρώνουμε σε αποστειρωμένα τρυβλία το θρεπτικό υπόστρωμα PDA και τα μολύνουμε με διαφορετικά στελέχη του μύκητα Verticillium dahliae. Μετά από 4 μέρες, αφού έχει αναπτυχθεί ο μύκητας,κόβουμε κομμάτια μυκηλίου και υποστρώματος και τα βάζουμε σε κωνικές με SSN (εικ26,27 ). Εικόνα 26 Εικόνα 27

24 Αφήνουμε τις κωνικές για άλλες 4 μέρες στο shaker για να αναπτυχθεί το μυκήλιο. Έπειτα διηθούμε τις καλλιέργειες των κωνικών με διηθητικό χαρτί ώστε να απομακρυνθεί το μυκήλιο του μύκητα (εικ 28). Εικόνα 28

25 Παίρνουμε 90 μl αποστειρωμένο νερό (Εικ 29) και 10μl απ’το διάλυμα του μύκητα και τα βάζουμε σε tube (εικ30,31). Εικόνα 29 Εικόνα 30 Εικόνα 31

26 Με την βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου και μικροσκοπίου (εικ32) δημιουργήσαμε αιώρημα συγκέντρωσης 10 7 κονίδια/ml (εικ 33 μετρητής ). Εικόνα 32 Εικόνα 33

27 Τέλος με σύριγγες παίρνουμε 10 ml από το διάλυμα που φτιάξαμε και τα εμβολιάζουμε γύρω από τις ρίζες τον φυτών (εικ34,35,36). Εικόνα 34 Εικόνα 35 Εικόνα 36

28 Εικόνες 37,38 : τα φυτά 3 βδομάδες μετά την μόλυνση. Εικόνα 38 Εικόνα 37

29 2. Απομόνωση RNA από το φυτό Arabidopsis thaliana, μέτρηση συγκέντρωσης RNA, αντίδραση αντίστρoφης μεταγραφάσης RT-PCR, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR, ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR. Απομόνωση RNA: Αλέθουμε τον 80-100mg ιστού που βρίσκεται σε tube παρουσία υγρού αζώτου, με ειδικό μικρό γουδοχέρι Προσθέτω 1ml Trizol και αναδεύουμε στο Vortex. Το αφήνουμε για 5 λεπτά σε πάγο.

30 Προσθέτουμε 20μl χλωροφόρμιο και αναδεύουμε στο vortex. Το αφήνουμε να επωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά τουλάχιστον. Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε νέο tube (1,5ml) και ακολουθεί εκχύλιση με ίσο όγκο φαινόλης:χλωροφόρμιου (1:1, V/v) και ανάδευση. Φυγοκεντρούμε 15 λεπτά στους 4˚C στα 13000 rpm. Μεταφέρουμε το υπερκείμενο σε νέο tube που περιέχει 500μl isopropanol και το αναδεύουμε.

31 Το αφήνουμε να επωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Ύστερα φυγοκεντρούμε για 10 λεπτά σε 4˚C στα 13000 rpm. Ξεπλένουμε μία φορά με αιθανόλη 70% Φυγοκέντρηση για 10 λεπτά 4˚C σε 13000rpm. Αφήνουμε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να στεγνώσει Επαναιώρηση σε 50μl RNAase free H2O.

32 Μέτρηση συγκέντρωσης RNA Η συγκέντωση ποσότητας RNA του δείγματος έγινε σε όργανο Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer. Ο μηδενισμός του οργάνου έγινε με 1μl απαλλαγμένο από ρυβονουκλεάσες νερό και στην συνέχεια έγινε μέτρηση του δείγματος με 1μl στο όργανο. Η συγκέντρωση υπολογίζεται ουσιαστικά από τον τύπο: [c]= O.D260 του δείγματος x 40μg(RNA) x συντελεστής αραίωσης Όπου O.D260 η απορρόφηση του δείγματος στα 260nm.

33 Εικ 39: Όρνανο Nanodrop Εικόνα: 40 διάγραμμα συγκέντρωσης.

34 Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφασης Η αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης- πολυμεράσης (Reverse Transcriptase Polymerace Chain Reaction RT- PCR) χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεγάλης κλίμακας παραγωγής μορίων DNA συμπληρωματικών προς τμήματα RNA. Διαδικασία: 2 mg RNA σε 8,5 μl τελικό όγκο με προσθήκη διπλά απιονοσμένου και αποστειρωμένου νερού επωάστηκε σε μηχάνημα PCR στους 70˚C για 5 λεπτά.

35 Στην συνέχεια προστέθηκαν τα ακόλουθα: RNA+H2O8,5μl 2 mM dNTP2μl2μl 30 μM oligo dT2μl2μl RNAase inhibitor (40 U/μl)0,5μl Superscript II (50 U/μl)1μl1μl 5x buffer4μl4μl 100 mMDTT2μl2μl Ο τελικός όγκος ήταν 20 μl και επωάστηκε στο μηχάνημα PCR για 90 λέπτα στους 42˚C, και ακολούθησε απενεργοποίηση του ενζύμου στους 70˚C για 10 λεπτά.

36 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκε για την in vitro πολλαπλασιασμό των PR γονιδίων. Η PCR πραγματοποιείται με την χρήση 2 ολογονουκλεοτιδίων, τους εκκινητές primers, που σχεδιάζονται έτσι ώστε να είναι συμπληρωματικοί προς τα 2 άκρα της προς πολλαπλασιασμού αλληλουχίας.

37 Τα αντιδραστήρια προστέθηκαν ως εξής για την πραγματοποίηση της αντίδραση: CDNA1μl1μl 10x Buffer2μl2μl dNTPs2μl2μl Primer 11μl1μl Primer 21μl1μl H2O12,7μl Taq0,3μl Ο τελικός της αντίδρασης ήταν 20μl και το tube τοποθετήθηκε στο μηχάνημα PCR.

38 Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR Η ηλεκτροφόρηση επιπτρέπει τον διαχωρισμό μορίων νουκλεϊκών οξέων ανάλογα με το μέγεθος τους. Βασίζεται στην διαφορετική ευκολία με την οποία περνούν μόρια διαφορετικού μεγέθους από ένα πίγμα, η δικτωτή-μικροπορώδης υφή του οποίου επιτρέπει στα μικρότερα μόρια να την διατρέχουν πιο εύκολα. Η κίνηση των αρνητικά φορτισμένων μορίων νουκλεϊκών οξέων διατηρείται χάρη στην εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου που διατρέχει το πήγμα. Το πήγμα βρίσκεται μέσα σε κατάλληλο ιοντικό ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων ΤΑΕ(1x).

39 Κατά την ηλεκτροφόρηση μόρια RNA ίδιου μεγέθους μετακινούνται υπο τις ίδιες συνθήκες και ύστερα από το ίδιο χρονικό διάστημα κατά ίση απόσταση. Έτσι με την χρήση δεικτών μεγέθους, του ladder, δηλαδή μορίων γνωστού μεγέθους δίπλα στα υπό μελέτη μόρια είναι εφικτός ο προσδιορισμός του μεγέθους των υπό μελέτη μορίων. Μετά την αντίδραση της PCR στα δείγματα προστέθηκαν 2,5μl διαλύματος φόρτωσης (6x loading blue buffer) και 1kb δείκτη μοριακών βαρών (ladder).

40 Ύστερα πήραμε ποσότητα 10μl και την φορτώσαμε σε πήγμα που περιείχε 0,8% αγαρόζη σε 1x ρυθμιστικό διάλυμα TAE. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα με εφαρμογή τάσης 100 volt στα άκρα της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Μετά την ηλεκτροφόρηση εμβαπτίσαμε το πήγμα σε υδατικό διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου συγκέντρωσης 1μg/ml για 20-30 λεπτά. Τέλος παρατηρήσαμε το πήγμα σε τράπεζα ακτινοβολίας UV.

41 Εικόνες 41,42,43:προσθήκη ΤΑΕ,εισαγωγή δειγμάτων στο πήγμα, πήγμα στην τράπεζα UV. Εικόνα 41 Εικόνα 42 Εικόνα 43

42 ΤΕΛΟΣ