Κιρκάδιοι Ρυθμοί στα ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια John S. O’Neill and Akhilesh B. Reddy * Department of Clinical Neurosciences, University of Cambridge Metabolic Research Laboratories, Institute of Metabolic Science, University of Cambridge, Addenbrooke’s Hospital, Cambridge CB2 0QQ, United Kingdom

Τι είναι οι κιρκάδιοι ρυθμοί ? Καταρχάς, αποτελούν μια θεμελιώδη ιδιότητα των ζώντων κυττάρων. Οργανισμοί απο τα κυανοβακτήρια ως τον άνθρωπο παρουσιάζουν ρυθμούς στη συμπεριφορά και στην ψυχολογία που συνεχίζουν να υφίστανται για μια χρονική περίοδο περίπου εικωσιτεσσάρων(24) ωρών. Γι αυτό ονομάζονται και περιεικοσιτετράωροι.

Χαρακτηριστικά των κιρκάδιων ρυθμών Οι ρυθμοί αυτοί καθοδηγούνται από βιολογικά ρολόγια με 2 βασικά χαρακτηριστικά: – Πρώτον, η χρονική αυτή περίοδος των 24 ωρών δεν επηρεάζεται από τη θερμοκρασία. Δηλαδή, τα βιολογικά ρολόγια δεν δουλεύουν με αργότερους ρυθμούς σε χαμηλότερες θερμοκρασίες αλλά ούτε και με πιο γρήγορους σε υψηλότερες. – Δεύτερον, μπορούν να συγχρονίζουν ερεθίσματα σχετικά με το χρόνο όπως το φως, η θερμοκρασία ή το πρόγραμμα σίτισης και έτσι ο καθορισμός της εσωτερικής ώρας επιτρέπει και την πρόβλεψη της εξωτερικής (ηλιακής) ώρας.

Peroxiredoxins (PRX) Αποτελούν μια υψηλά διατηρημένη οικογένεια αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών που βοηθούν στη ρύθμιση των ενδοκυτταρικών επιπέδων του υπεροξειδίου.

Fig. 1: Reaction cycle of 2- Cys peroxiredoxins. By peroxide reduction a disulfide bond is formed between the two conserved cysteine residues of 2-Cys peroxiredoxins (orange). Reductive regeneration takes place by small thiol proteins (green) like thioredoxins.

Οι peroxiredoxins παρουσιάζουν κιρκάδιους οξειδοαναγωγικούς ρυθμούς Υποθέτουμε πως η οξείδωση των PRX μπορεί να αποτελεί έναν νέο μη- μεταγραφικό ρυθμικό δείκτη. Γι αυτό χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια τα οποία δεν διαθέτουν πυρήνα.

Δείγματα από 3 υγιή ηλικιακά ίσα άτομα. Παρατηρούμε πως εμφανίζουν 24ωρο ρολόι στα ερυθρά τους αιμοσφαίρια. Λαμβάνουμε δείγματα ανά 4 ώρες. Στην a. Τα δείγματα βρισκονται σε σταθερές συνθήκες στους 37 ο C και σε απόλυτο σκοτάδι. Στην b. Τα παρατηρούμε σε θερμοκρασίες υψηλές (37 ο C) και σε χαμηλότερες (32 ο C).

Συμπέρασμα Τα παραπάνω αποτελέσματα προσδιορίζουν τους οξειδoαναγωγικούς ρυθμούς των PRX εύρωστους κιρκάδιους ρυθμούς σε κύτταρα που δεν έχουν την δυνατότητα παραγωγής RNA.

Μήπως άλλα εμπήρυνα κύτταρα που κυκλοφορούν στο αίμα σχετίζονται με την ύπαρξη κιρκάδιων ρυθμών στα ερυθρά αιμοσφαίρια? Έγιναν πειράματα παρουσία και απουσία μεταγραφικών και μεταφραστικών αναστολέων οι οποίοι μπορούν να έχουν επίδραση μόνο εάν τα εμπήρυνα κύτταρα συνεισφέρουν στα υπό παρατήρηση κύτταρα. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το α-ελαϊκό και το κυκλοεξιμίδιο. Συμπέρασμα: παρατηρήθηκαν ακόμη πιο εύρωστοι κιρκάδιοι ρυθμοί στα ερυθρά αιμοσφαίρια επομένως οι ρυθμοί προκύπτουν μόνο από τα ίδιο τα ερυθρά αιμοσφαίρια και οι άλλοι κυτταρικοί τύποι δεν συνεισφέρουν στις μεταβολές που παρατηρούμε in vitro.

Από τα διαγράμματα: Δεν παρατηρείται στατιστικά σημαντική μεταβολή στους κιρκάδιους ρυθμούς οξείδωσης της PRX μεταξύ των κυττάρων μαρτύρων και των κυττάρων στα οποία χορηγούνται οι αναστολείς. ( α-ελαϊκό και κυκλοεξιμίδιο.

Κιρκάδιοι ρυθμοί και εξάρτηση από τη θερμοκρασία Πραγματοποιήθηκαν πειράματα στους 37 ο C και στους 32 ο C. Και παρατηρήθηκαν παρόμοιες μεταβολές στις περοξιρεδοξίνες στις δυο αυτές διαφορετικές θερμοκρασίες. Πειράματα έγιναν και στους 42 ο C αλλά παρατηρήθηκε αιμόλυση ύστερα από 2 μέρες και τα πειράματα in vitro σ αυτή τη θερμοκρασία ήταν απαγορευτικά. Σύμφωνα με τα ευρήματα κιρκάδιοι ρυθμοί παρατηρούνται στα ερυθρά αιμοσφαίρια και είναι ανεξάρτητοι από τη θερμοκρασία υποδηλώνοντας την παρουσία «ρολογιού» σ αυτά τα απύρηνα κύτταρα.

Δεν παρατηρούνται σημαντικές μεταβολές στους ρυθμούς των κυττάρων στις θερμοκρασίες 32 ο C και 37 ο C. Επομένως οι κιρκάδιες ταλαντώσεις είναι ανεξάρτητες από τη θερμοκρασία.

Peroxiredoxins Οι peroxiredoxins είναι υψηλά διατηρημένες στα μεγάλα φυλογενετικά βασίλεια (ευκαρυωτικά, αρχαία και βακτήρια). Στα θηλαστικά υπάρχουν 6 PRX paralogues τα οποία διαφέρουν στην κυτταρική τους θέση και στους αντιοξειδωτικούς τους μηχανισμούς τους.( PRX1-PRX6) Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην PRX2 εξαιτίας της μεγάλης της έκφρασης στα ερυθρά αιμοσφαίρια και της αντίστροφης έκφρασης που παρουσιάζει σε οξειδωτικές και αναγωγικές συνθήκες.

Παρατηρούμε πως η PRX-SO 2/3 και η PRX2 εμφανίζουν αρκετές ομοιότητες όπως φαίνεται με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσ ης.

Κιρκάδιοι ρυθμοί στην αντίστροφη οξείδωση της αιμοσφαιρίνης Η αιμοσφαιρίνη απαντάται σε τετραμερική και διμερική μορφη. Η ίδια η αιμοσφαιρινη αποτελεί πηγή υπεροξειδίου μέσα στο κύτταρο εξαιτίας της αυτό-οξείδωσής της. Η διμερική μορφή αυτό- οξειδώνεται περισσότερο από την τετραμερική με αποτέλεσμα την παραγωγή MetHb.

ANOVA: 37 ο, απόλυτο σκοτάδι  κιρκάδιοι ρυθμοί στην οξείδωση της αιμοσφαιρίνης

Κιρκάδιοι ρυθμοί και στις μεταβολικές διεργασίες των ερυθρών αιμοσφαιρίων Οι ρυθμοί που διέπουν τα μεταβολικά μονοπάτια των ερυθρών αιμοσφαιρίων σχετίζονται με τους ρυθμούς των PRX και της οξείδωσης της αιμοσφαιρίνης. Δηλαδή η παραγωγή NADH και NADPH ακολουθεί μια ρυθμικότητα μέσα στα ερυθρά αιμοσφαίρια.

ANOVA: Δεν υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις συγκεντρώσεις NADH/NADPH

Ρυθμοί PRX στα κύτταρα που διαθέτουν πυρήνα Στα κύτταρα που διαθέτουν πυρήνα, οι ρυθμοί των peroxiredoxins επηρεάζονται σαφώς από τις ανατροφοδοτικές θηλιές της μεταγραφής και της μετάφρασης. Αυτό υπονοεί άμεση σύζευξη ανάμεσα στους ρυθμούς πυρήνα και κυτταροπλάσματος.

Συμπεράσματα και νέες απορίες… Αποδείχτηκε πως τα ερυθρά αιμοσφαίρια εμφανίζουν κιρκάδιους ρυθμούς που δεν εξαρτώνται από τη θερμοκρασία. Επιπλέον, ότι εμφανίζουν κιρκάδιους ρυθμούς σε διάφορους κυτταροπλασματικούς οξειδοαναγωγικούς παράγοντες. Το ερώτημα είναι εάν θα αποτελούν έναν κιρκάδιο δείκτη που θα διέπει τα φυλογενετικα βασίλεια. Αυτό είναι σημαντικό διοτι πολλοί οργανισμοί μοντέλα δεν φαίνεται να εκφράζουν «clock genes» αλλά εμφανίζουν κιρκάδιους ρυθμούς.