11. Από την πρωτεωμική στη βιολογία συστημάτων 11. Από την πρωτεωμική στη βιολογία συστημάτων

Α. Πρωτεωμική

Η πρωτεϊνική σύσταση επηρεάζεται από: Το πρωτεΐνωμα είναι ενδιάμεσο ανάμεσα στο γονιδίωμα και τη βιοχημική ικανότητα του κυττάρου Κλειδί για την κατανόηση της λειτουργίας (αλλά και δυσλειτουργιών) του γονιδιώματος Η πρωτεϊνική σύσταση επηρεάζεται από: Διαθέσιμη ποσότητα mRNA Ταχύτητα μετάφρασης Τροποποιήσεις πρωτεϊνών Πρωτεωμική αφορά τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του πρωτεϊνώματος

1. Η ανάλυση του πρωτεϊνικού προφίλ Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Φασματοφωτομετρία μαζών

Διαχωρισμός πρωτεϊνών πρωτεϊνώματος Το πρωτεΐνωμα είναι πολύπλοκο: Ένα κύτταρο θηλαστικού περιέχει 10,000 – 20,000 πρωτεΐνες Βασική μέθοδος διαχωρισμού: πήκτωμα πολυακρυλαμίδης Ανάλογα με τη σύσταση του πηκτώματος και τις συνθήκες, ο διαχωρισμός βασίζεται σε διαφορετικές ιδιότητες των πρωτεϊνών

SDS: Sodium dodecyl sulphate To SDS μετουσιώνει τις πρωτεΐνες και προσδίδει αρνητικό φορτίο Υπό αυτές τις συνθήκες, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σύμφωνα με τη μάζα τους

Ισοηλεκτρική εστίαση Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα βαθμίδωσης pH, παρουσία ηλεκτρικού φορτίου Οι πρωτεΐνες μετακινούνται προς το ισοηλεκτρικό τους σημείο

Coomassie blue Silver staining Χρώση πρωτεϊνών Coomassie blue Silver staining

Δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση

Ταυτοποίηση πρωτεϊνών στο πρωτεΐνωμα Φασματοφωτομετρία μαζών Μάζα/Φορτίο ιοντισμένων μορφών που παράγονται όταν μόρια μιας ουσίας εκτίθενται σε πεδίο υψηλής ενέργειας Όμως, οι πρωτεΐνες, λόγω μεγάλου μεγέθους, δεν ιοντίζονται αποτελεσματικά

MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) Απομόνωση κηλίδας από 2D-PAGE Καθαρισμός Πέψη με πρωτεάση με ειδική αλληλουχία-στόχο π.χ. θρυψίνη (πέψη μετά από αργινίνη ή λυσίνη) Δημιουργία πεπτιδίων 5-75 αμινοξέων Ιοντισμός πεπτιδίων Καθορισμός λόγου Μ/Φ από χρόνο πτήσης στο φασματόμετρο μαζών

Ο υπολογιστής περιέχει βάση δεδομένων των προβλεπόμενων μοριακών μαζών για τα κλάσματα θρυψίνης κάθε πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα του εξεταζόμενου οργανισμού. Ο υπολογιστής συγκρίνει τη μάζα των πεπτιδίων με τη βάση δεδομένων και ταυτοποιεί την πιο πιθανή πρωτεΐνη από την οποία προέρχονται τα συγκεκριμένα πεπτίδια

Σύγκριση πρωτεϊνωμάτων Σήμανση δύο πρωτεϊνωμάτων με διαφορετικούς δείκτες ICAT: isotope coded affinity tag. Ραδιοσημασμένος δείκτης συγγένειας Δείκτης Η Δείκτης D

Οι κορυφές που προέρχονται από πεπτίδια που περιέχουν δευτέριο εικονίζονται κόκκινες Η εξεταζόμενη πρωτεΐνη είναι περίπου 1,5 φορές πιο άφθονη στο πρωτεΐνωμα που έχει σημανθεί με δευτέριο

2. Ταυτοποίηση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων «Δείξε μου το φίλο σου…» Η αλληλεπίδραση με πρωτεΐνη γνωστής λειτουργίας συχνά προσφέρει ενδείξεις για το ρόλο άγνωστης πρωτεΐνης Π.χ. η αλληλεπίδραση με πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας μπορεί να υποδηλώνει συμμετοχή σε διακυτταρική σηματοδότηση Χάρτες πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων

2.1. Phage display (έκθεση σε φάγους)

Χρήση βιβλιοθήκης phage display

2.2. Δοκιμή δύο υβριδίων

Υψηλής απόδοσης σαρώσεις δύο υβριδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή ενός χάρτη αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πρωτεϊνών του ανθρώπινου γονιδιώματος. Κλωνοποίηση όλων των ORFs σε δύο πλασμιδιακούς φορείς: βιβλιοθήκη "δολωμάτων", βιβλιοθήκη "θηραμάτων" Μετασχηματισμός κυττάρων ζυμομύκητα Σύζευξη, ώστε να βρεθούν στο ίδιο κύτταρο κάθε πλασμίδιο-δόλωμα με κάθε πλασμίδιο-θήραμα Σάρωση, για διαπίστωση έκφρασης γονιδίου αναφοράς Η πλήρης σάρωση και των 6000 γονιδίων θα απαιτούσε τον έλεγχο περισσότερων από 36 εκατ αποικιών για πιθανές αλληλεπιδράσεις Από τα αποτελέσματα πολλών μελετών έχουν δημιουργηθεί «χάρτες αλληλεπιδράσεων» (“interactomes”) για χιλιάδες πρωτεΐνες στο ζυμομύκητα, στο C. elegans, στον άνθρωπο και στον ποντικό.

2.3. Καθορισμός πρωτεϊνικών συμπλόκων Μέθοδοι χρωματογραφίας συγγένειας για τον καθαρισμό πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων Στην ΤΑΡ, το γονίδιο για την εξεταζόμενη πρωτεΐνη τροποποιείται ώστε όταν συντεθεί η πρωτεΐνη να έχει μια καρβοξυτελική προέκταση που να προσδένεται στην καλμοδουλίνη

Η χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιείται για τον καθαρισμό πρωτεϊνικών συμπλόκων στο πλαίσιο της ανάλυσης με φασματομετρία μάζας. Η χρήση της μεθόδου επέτρεψε να εντοπιστούν πολλά συστατικά της συσκευής πολυ-αδενυλίωσης του ζυμομύκητα. Το συγκεκριμένο πείραμα πρωτεομικής εκτός του ότι επιβεβαίωσε τον ήδη γνωστό ρόλο ορισμένων πρωτεϊνών στη διαδικασία της πολυαδενυλίωσης επέτρεψε επίσης την ανακάλυψη πολλών νέων, άγνωστων μέχρι τότε, συστατικών του συμπλόκου (μπλε χρώμα), εμπλουτίζοντας τις γνώσεις μας σχετικά με το μηχανισμό της πολυαδενυλίωσης.

Εκδοχές χαρτών αλληλεπιδράσεων Saccharomyces cerevisiae Κόκκινα σημεία: απαραίτητες πρωτεΐνες: αδρανοποιητικές μεταλλάξεις στα αντίστοιχα γονίδια είναι θανατογόνες Πράσινα σημεία: αδρανοποιητικές μεταλλάξεις δεν είναι θανατογόνες Πορτοκαλί σημεία: αδρανοποιητικές μεταλλάξεις οδηγούν σε βραδεία ανάπτυξη Κίτρινα σημεία: αδρανοποιητικές μεταλλάξεις άγνωστου φαινότυπου

Κάθε ελλειψοειδές είναι ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο Κάθε ελλειψοειδές είναι ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο Παρουσιάζονται συνδέσεις μόνο μεταξύ συμπλόκων που διαθέτουν τουλάχιστον μια κοινή πρωτεΐνη Τα σύμπλοκα ομαδοποιούνται χρωματικά: Κόκκινο: κυτταρικός κύκλος Πράσινο: σηματοδότηση Μπλε: μεταγραφή Ροζ: μεταφορά πρωτεϊνών Πορτοκαλί: μεταβολισμός RNA Γαλάζιο: βιογένεση μεμβρανών

Συστοιχίες πρωτεϊνών για τον εντοπισμό αλληλεπιδράσεων Υβριδική έκφραση όλων των ORFs ενός γονιδιώματος με μια ετικέτα (επίτοπο της GST) Καθαρισμός των πρωτεϊνών που φέρουν επίτοπο με χρωματογραφία Καθήλωση καθαρισμένων πρωτεϊνών σε γυάλινα πλακάκια Σήμανση και προσθήκη της υπό μελέτη πρωτεΐνης στη μικροσυστοιχία

Τμήμα μικροσυστοιχίας που περιέχει 6566 πρωτεΐνες από κύτταρα ζυμομύκητα Οι μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με μία σημασμένη υπό μελέτη πρωτεΐνη ή με ένα μικρό μόριο. Κοινό μοτίβο 14 πρωτεϊνών που αλληλεπιδρά με την καλμοδουλίνη

Ποσοτική μέτρηση πρωτεϊνών στα κύτταρα Protein microarrays. Σωματικά υγρά ασθενών θα μπορούσαν να μελετηθούν ως προς την ύπαρξη αντισωμάτων για ειδικά αντιγόνα. Μικροσυστοιχίες χιλιάδων διαφορετικών αντιγόνων προετοιμάζονται σε ειδικά επιστρωμένα πλακίδια με νιτροκυτταρίνη. Οι μικροσυστοιχίες επωάζονται με τα σωματικά υγρά και στη συνέχεια επεξεργάζονται με ένα δευτερογενές φθορίζον αντίσωμα (Cy3, Cy5) για την οπτικοποίηση της αντίδρασης αντισώματος-αντιγόνου. Τα πλακίδια σαρώνονται σε ένα υψηλής ευαισθησίας συνεστιακό σαρωτή (confocal-scanner) που καταγράφει τα σήματα φθορισμού που παράγονται από τα δευτερογενή αντισώματα. Antibody microarrays. Εδώ, αντί για αντιγόνα στα πλακίδια τοποθετούνται αντισώματα. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάζονται με σωματικά υγρά ασθενών ώστε να προσδεθούν τα αντίστοιχα αντιγόνα. Για τη χρησιμοποίηση ενός confocal laser scanner, οι πρωτεΐνες θα πρέπει να σημανθούν με φθορίζουσα χρωστική (Cy3, Cy5) πριν την επώαση με τα σωματικά υγρά.

Β. Μεταβολωμική

Προσδιορισμός βιοχημικού προφίλ Acronym Method Principle PyMS Pyrolysis mass spectrometry Thermal degradation into volatiles, separation according to mass-charge ratio, analysis by mass spectrometry FT-IR Fourier transform-infrared spectrometry Measures absorbance of energy at specific wavelengths by highly polar bonds (C-N, N-H, C=O etc), which provides a fingreprint of the presence of chemical groups DRS Dispersive Raman spectrometry Detection of vibrational, rotational and other low-frequency modes of a system NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy Detection of full range metabolites with direct NMR of cellular extracts or cellular suspensions GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Analysis and quantitation of organic volatiles and semi-volatile compounds LC-ESI-MS Liquid chromatrography electron spin ionization mass spectrometry Analysis and quantitation of highly polar, least volatile, or thermally unstable compounds MDA Multivariate data analysis Chemometrics, artificial neural networks, genetic algorithms

Γ. Βιολογία συστημάτων Systems biology

Από ένα απλό βιολογικό σύστημα…

Κατάλληλες σχετικές ποσότητες ενζύμων στον κατάλληλο χρόνο Ταχύτητα σύνθεσης πρωτεϊνών Σωστή πτύχωση των πρωτεϊνών σε λειτουργικά ένζυμα Ταχύτητα αποδόμησης ενζυμικών μορίων Εντόπιση στο κύτταρο Παρουσία απαραίτητων ποσοτήτων μεταβολιτών που δρουν ως υπόστρωμα Συμπαράγοντες στη σύνθεση της τρυπτοφάνης ΜΟΝΟ 5 ΑΠO ΤΑ 4405 ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΗΣ E. COLI!!

… σε ένα πιο σύνθετο 51 γονίδια οργανωμένα σε 12 οπερόνια

Σήμερα Συνδυασμός δεδομένων: Γονιδιωματικής Τρανσκριπτοματικής Πρωτεωμικής Μεταβολωμικής

uric acid 5-hydroxyisourate

Το μέλλον της γονιδιωματικής

Από "Ανασυνδυασμένο DNA" Από «Γονιδιώματα» Κεφάλαιο 6.2-6.3 Από "Ανασυνδυασμένο DNA" Σελίδες 472-476