Εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στην Ιατρική κ ε φ ά λ α ι ο 8

Συμβολή Βιοτεχνολογίας στην Ιατρική Διάγνωση ανάπτυξη ευαίσθητων τεχνικών που μπορούν να εντοπίσουν την ασθένεια στα αρχικά της στάδια, ανίχνευση μόλυνσης από παθογόνους οργανισμούς διαπίστωση ύπαρξης κληρονομικής ασθένειας. Πρόληψη ασθενειών ηπατίτιδα Β, πολιομυελίτιδα και φυματίωση εξελιγμένα, ασφαλή και οικονομικά προσιτά εμβόλια ανάπτυξη εμβολίων για πρόληψη ασθενειών (AIDS, μηνιγγίτιδα και καρκίνος) Αποτελεσματική θεραπεία κατανόηση βιοχημικών μηχανισμών και γενετικού υπόβαθρου ασθένειας φαρμακευτική αγωγή γονιδιακή θεραπεία

Τεχνικές που χρησιμοποιεί η Βιοτεχνολογία Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Τεχνική PCR Ανιχνευτές μορίων DNA Γονιδιακή θεραπεία (με εφαρμογή σε κυστική ίνωση, AIDS και καρκίνο) Εφαρμογή εργαλείων βελτίωση παραγωγή σε ευρεία κλίμακα ευαίσθητων διαγνωστικών ουσιών (μονοκλωνικά αντισώματα, αποτελεσματικά εμβόλια και φαρμακευτικά προϊόντα)

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Πριν την τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA, παραγωγή σε πολύ μικρές ποσότητες πολύ ακριβή με βιολογική δράση όχι πλήρως κατανοητή Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA ωθεί παραγωγή σε σημαντικές ποσότητες με έλεγχο της δράσης τους για ευρεία κατανάλωση Σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί γονίδια του ανθρώπου για πάνω από 300 φαρμακευτικές πρωτεΐνες Πρώτα μόρια που παρασκευάστηκαν ινσουλίνη, ιντερφερόνες και αυξητική ορμόνη.

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Φαρμακευτικές πρωτεΐνες με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Πρωτεΐνη Χρήση ή Θεραπεία σε α1 -αντιθρυψίνη εμφύσημα παράγοντας VIII αιμορροφιλία Α καλσιτονίνη οστεοπόρωση παράγοντας IX αιμορροφιλία Β χοριονική γοναδοτροπίνη γυναικεία στειρότητα αυξητική ορμόνη αχονδροπλασία ενδορφίνες, εγκεφαλίνες αναλγητικοί παράγοντες ινσουλίνη διαβήτη επιδερμικός αυξητικός παράγων τραύματα ιντερλευκίνες καρκίνο, ανοσοποιητικό Παράγων νέκρωσης όγκων αντικαρκινικός παράγων ερυθροποιητίνη αναιμία Ενεργοποιητής πλασμινογόνου (tPA) θρομβολυτικός παράγων Ιντερφερόνες α,β,γ αντιιικοί-αντικαρκινικοί παράγοντες

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Ινσουλίνη ορμόνη αποτελείται από 51 αμινοξέα παράγεται από ειδικά κύτταρα παγκρέατος ρυθμίζει το μεταβολισμό των υδατανθράκων ποσοστό της γλυκόζης στο αίμα η φαρμακευτική ινσουλίνη παραγόταν στο παρελθόν από εκχύλιση παγκρέατος χοίρων & βοοειδών με δαπανηρή & πολύπλοκη διαδικασία με διαφορές στη σύσταση από την ανθρώπινη & αλλεργικές αντιδράσεις σε αρρώστους Διαβήτης ασθένεια με χαρακτηριστικά έλλειψης ή μείωσης ινσουλίνης 60.000.000 ασθενείς παγκόσμια

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Ινσουλίνη αποτελείται από δύο μικρά πεπτίδια, Α και Β, που συγκρατούνται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. το γονίδιο της ινσουλίνης παράγει ένα πρόδρομο μόριο, την προϊνσουλίνη, το οποίο μετατρέπεται τελικά σε Ινσουλίνη

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Κλωνοποίηση γονιδίου & παραγωγή Ινσουλίνης Μέθοδος παραγωγής ανθρώπινης ινσουλίνης σε βακτήρια παραγωγή του πρόδρομου μορίου της σε βακτηριακή καλλιέργεια μετατροπή της σε ινσουλίνη με ενζυμική κατεργασία Στάδια μεθόδου (κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης) Απομόνωση του συνολικού mRNA, από κύτταρα ανθρώπινου παγκρέατος Σύνθεση cDNA με τη βοήθεια αντίστροφης μεταγραφάσης Κατασκευή δίκλωνων μορίων DNA (DNA πολυμεράση) Ενσωμάτωση δίκλωνου DNA σε πλασμίδια (ανασυνδυασμός) Μετασχηματισμός βακτηρίων με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια Πολλαπλασιασμός (καλλιέργεια) βακτηρίων σε υγρό θρεπτικό υλικό Επιλογή των βακτηρίων που περιέχουν το γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί το πρόδρομο μόριο της ινσουλίνης Ανάπτυξη των βακτηρίων αυτών σε βιοαντιδραστήρα για παραγωγή του πρόδρομου μορίου της ινσουλίνης. Συλλογή & καθαρισμός προϊνσουλίνης Επίδραση με κατάλληλο ένζυμο, που αφαιρεί το ενδιάμεσο πεπτίδιο, και μετατροπή της σε ινσουλίνη Λήψη καθαρής ινσουλίνης (καθαρισμός)

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Ιντερφερόνες Αντιιικές πρωτεΐνες Παράγονται από κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιούς Επάγουν την παραγωγή άλλων πρωτεϊνών από τα γειτονικά υγιή κύτταρα, οι οποίες εμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των ιών σ' αυτά Είναι οικογένεια συγγενών πρωτεϊνών Ταξινομούνται σε τρεις ομάδες ανάλογα με τη χημική και βιολογική ενεργότητα τους : ιντερφερόνες α, β και γ Αντιιικοί και πιθανόν αντικαρκινικοί παράγοντες Παράγονται σε ελάχιστες ποσότητες στο σώμα και δεν ήταν ευρεία η χρήση τους στη θεραπεία ασθενειών Μετά την κλωνοποίηση ορισμένων γονιδίων ιντερφερονών, παράγονται σε μεγάλες ποσότητες, παρόμοια με την ινσουλίνη

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες από βακτήρια με μεθόδους Γενετικής Μηχανικής Ιντερφερόνες type I IFN-β1 IFN-α2 type II IFN-γ

Μονοκλωνικά αντισώματα Αντισώματα είναι πρωτεϊνικά μόρια παράγονται από τα Β-λεμφοκύτταρα του ανοσοποιητικού μας συστήματος παράγονται όταν ένα αντιγόνο (παθογόνος μικροοργανισμός, ιός ή ξένο υλικό) προσβάλει τον οργανισμό αντιδρούν με το αντιγόνο και το εξουδετερώνουν ένα αντίσωμα αναγνωρίζει μόνο συγκεκριμένη περιοχή του αντιγόνου (αντιγονικός καθοριστής) μικροοργανισμός (=μεγάλο αντιγόνο) : πολλοί αντιγονικοί καθοριστές άρα πολλά είδη αντισωμάτων εναντίον του κάθε είδος αντισώματος αναγνωρίζει έναν αντιγονικό καθοριστή παράγεται από μια ομάδα όμοιων Β-λεμφοκυττάρων (κλώνος) όσα παράγονται από ένα κλώνο λέγονται μονοκλωνικά

Μονοκλωνικά αντισώματα Αντισώματα

Μονοκλωνικά αντισώματα είναι πολύ σημαντικά στην Ιατρική διαγνωστικά για την ανίχνευση ασθενειών εξειδικευμένα φάρμακα εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών εναντίον καρκινικών κυττάρων σημαντικό να γίνει δυνατή η παραγωγή τους στο εργαστήριο σε μεγάλες ποσότητες όμως τα Β-λεμφοκύτταρα δεν επιβιώνουν για πολύ έξω από το σώμα & δεν μπορούν να διατηρηθούν σε κυτταροκαλλιέργειες την ιδιότητα αυτή την αποκτούν ύστερα από σύντηξη με καρκινικά κύτταρα τα υβριδικά κύτταρα που παράγονται ονομάζονται υβριδώματα παράγουν μεγάλες ποσότητες ενός μονοκλωνικού αντισώματος η τεχνική παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων αναπτύχθηκε το 1975

Μονοκλωνικά αντισώματα Δημιουργία υβριδωμάτων επιλεγμένο αντιγόνο χορηγείται με ένεση σε ποντίκι (ανοσοποίηση ποντικού) προκαλεί ανοσολογική αντίδραση αρχίζει η παραγωγή αντισωμάτων από εξειδικευμένα Β-λεμφοκύτταρα ύστερα από δύο εβδομάδες αφαιρείται ο σπλήνας απομονώνονται τα Β-λεμφοκύτταρα συντήκονται με καρκινικά κύτταρα και παράγονται υβριδώματα τα υβριδώματα παράγουν μονοκλωνικά αντισώματα φυλάσσονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα στην κατάψυξη (-80 °C) παράγουν οποιαδήποτε στιγμή το συγκεκριμένο μονοκλωνικό αντίσωμα σε μεγάλες ποσότητες

Μονοκλωνικά αντισώματα Εφαρμογές μονοκλωνικών αντισωμάτων Ανοσοδιαγνωστικά αναγνωρίζουν ειδικά έναν αντιγονικό καθοριστή ανιχνεύουν στα υγρά του σώματος (αίμα, ούρα κ.ά.) ουσίες υπεύθυνες για ποικίλες ασθένειες ανιχνεύουν παθογόνους μικροοργανισμούς ανιχνεύουν τη διακύμανση της συγκέντρωσης προϊόντων του μεταβολισμού, η οποία μπορεί να προοιωνίζει πιθανότητα εμφάνισης ασθένειας Η τεχνική ανίχνευσης είναι γρήγορη, απλή, ευαίσθητη, ακριβής άρα διάγνωση ασθενειών στα αρχικά στάδια πριν από τα συμπτώματα Συνεισφορά στην αύξηση ευαισθησίας κλινικών δοκιμασιών τυποποίηση (προσδιορισμός) των ομάδων αίματος εξακρίβωση μιας πιθανής κύησης (έχουν κατασκευαστεί ειδικά ανοσοδιαγνωστικά τεστ, που περιέχουν μονοκλωνικά αντισώματα για ειδικές ορμόνες που παράγονται κατά την κύηση)

Μονοκλωνικά αντισώματα Εφαρμογές μονοκλωνικών αντισωμάτων Θεραπευτικά Θεραπεία του καρκίνου Τα καρκινικά κύτταρα έχουν στην εξωτερική επιφάνεια τους μεγάλη ποικιλία αντιγόνων που δεν υπάρχουν στα φυσιολογικά κύτταρα του οργανισμού, και ονομάζονται καρκινικά αντιγόνα Μπορούν να κατασκευαστούν μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον αυτών των αντιγόνων Τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι ειδικά μόνο σε καρκινικά κύτταρα και «γίνονται μεταφορείς» ισχυρών αντικαρκινικών φαρμάκων Όταν εισαχθούν στον οργανισμό, βρίσκουν και προσβάλλουν τους καρκίνους-στόχους. Τα αντικαρκινικά φάρμακα -συνδεδεμένα με τα αντισώματα – δρουν στα καρκινικά κύτταρα και τα καταστρέφουν Θεραπεία με αποφυγή της χειρουργικής επέμβασης και των δυσάρεστων επιπτώσεων της χημειοθεραπείας

Μονοκλωνικά αντισώματα Εφαρμογές μονοκλωνικών αντισωμάτων Επιλογή οργάνων συμβατών για μεταμόσχευση Τα κύτταρα των οργάνων έχουν στην επιφάνειά τους ειδικά αντιγόνα επιφανείας, που αναγνωρίζονται από ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα Με τα μονοκλωνικά αντισώματα γίνεται έλεγχος συμβατότητας των οργάνων δωρητών με τα αντίστοιχα των ασθενών-δεκτών Αποφεύγεται η απόρριψη και οι μεταμοσχεύσεις είναι επιτυχείς

Γονιδιακή θεραπεία Στόχοι «Διόρθωση» γενετικής βλάβης με εισαγωγή σε ασθενείς των φυσιολογικών αλληλόμορφων ενός μεταλλαγμένου γονιδίου Αλλαγή σε συγκεκριμένα σωματικά κύτταρα, συνεπώς δε μεταβιβάζεται στους απογόνους Περισσότερες από 4.000 ασθένειες οφείλονται σε γονιδιακές μεταλλάξεις και πολλές εμφανίζονται στις μεγάλες ηλικίες Οφείλονται μερικές σε ένα μόνο γονίδιο, άλλες σε αλληλεπίδραση δύο ή περισσότερων γονιδίων πολλές σε συνδυασμό γενετικών & περιβαλλοντικών παραγόντων (ακτινοβολία και χημικές ουσίες) Προκαλούν σχεδόν όλες δυσμορφίες 80% όλων διανοητική καθυστέρηση το ένα πέμπτο από αυτές θάνατο στην παιδική ηλικία Η μοριακή βάση των ασθενειών έως πρόσφατα ήταν άγνωστη

Γονιδιακή θεραπεία Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA μαζί με τις μεθόδους της παραδοσιακής Γενετικής (γενεαλογικά δένδρα) οδήγησε σε : εντοπισμό της θέσης στα χρωμοσώματα (χαρτογράφηση) πολλών μεταλλαγμένων γονιδίων, που προκαλούν τις αντίστοιχες ασθένειες ορισμένα μεταλλαγμένα γονίδια κλωνοποιήθηκαν συγκρίθηκαν με τα φυσιολογικά αλληλόμορφα τους, για να εξακριβωθεί το είδος των μεταλλάξεων προσδιορισμό κυττάρων που εμφανίζουν τη βλάβη από την ασθένεια Σήμερα έχουν χαρτογραφηθεί και κλωνοποιηθεί τα γονίδια των οποίων οι μεταλλάξεις είναι υπεύθυνες για ασθένειες όπως η κυστική ίνωση, η ασθένεια του Huntington και η μυϊκή δυστροφία Duchenne

Γονιδιακή θεραπεία Εφαρμογή για έλλειψη ADA Η γονιδιακή θεραπεία εφαρμόστηκε για πρώτη φορά το Σεπτέμβριο του 1990 σε ένα τετράχρονο κορίτσι που έπασχε από ανεπάρκεια του ανοσοποιητικού συστήματος

Εφαρμογή για έλλειψη ADA Γονιδιακή θεραπεία Εφαρμογή για έλλειψη ADA Έλλειψη του ενζύμου απαμινάση της αδενοσίνης (ADA), που παίρνει μέρος στον μεταβολισμό των πουρινών στα κύτταρα του μυελού των οστών Οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου που παράγει το ένζυμο αυτό Η ασθένεια εμφανίζει αυτοσωμικό υπολειπόμενο τύπο κληρονομικότητας Οι ασθενείς πάσχουν από χρόνιες μολύνσεις έχουν προδιάθεση για ανάπτυξη καρκίνου σε πολύ μικρή ηλικία πολλοί πεθαίνουν ύστερα από λίγους μήνες ζωής Γνωστή περίπτωση παιδιού που έζησε 9 χρόνια σε πλαστικό θάλαμο, για να εμποδιστεί η επαφή του με ιούς, επειδή το ανοσοποιητικό του σύστημα δεν μπορούσε να τους καταπολεμήσει

Γονιδιακή θεραπεία Εφαρμογή για έλλειψη ADA Διαδικασία Προβλήματα Λεμφοκύτταρα του παιδιού παραλαμβάνονται και πολλαπλασιάζονται σε κυτταροκαλλιέργειες Απομονώνεται και κλωνοποιείται το φυσιολογικό γονίδιο της απαμινάσης της αδενοσίνης Ενσωματώνεται σε έναν ιό-φορέα (ο οποίος έχει καταστεί αβλαβής) με τις τεχνικές του ανασυνδυασμένου DNA Ο γενετικά τροποποιημένος ιός εισάγεται στα λεμφοκύτταρα Τα γενετικά τροποποιημένα λεμφοκύτταρα εισάγονται με ενδοφλέβια ένεση στο παιδί και παράγουν το ένζυμο ADA Προβλήματα τα τροποποιημένα λεμφοκύτταρα δε ζουν για πάντα μέσα στον οργανισμό, δηλαδή η θεραπεία δεν είναι μόνιμη χρειάζεται συνεχής έγχυση τέτοιων κυττάρων τα άτομα μπορούν να ζουν φυσιολογικά, κάνοντας σε κανονικά χρονικά διαστήματα αυτή τη θεραπεία. Ο τύπος αυτός ονομάζεται ex vivo γονιδιακή θεραπεία, γιατί τα κύτταρα τροποποιούνται έξω από τον οργανισμό και εισάγονται πάλι σ' αυτόν

Γονιδιακή θεραπεία in vivo ex vivo

Γονιδιακή θεραπεία Εφαρμογή για κυστική ίνωση Ο Anderson και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν «έξυπνους» φορείς, οι οποίοι προσβάλλουν τα κύτταρα του ιστού που πάσχει Τα φυσιολογικά γονίδια ενσωματώνονται σε μόρια-φορείς Αυτά εισάγονται κατευθείαν στον οργανισμό Το είδος αυτό της γονιδιακής θεραπείας ονομάζεται in vivo και εφαρμόστηκε για τη θεραπεία της κυστικής ίνωσης το 1993

Γονιδιακή θεραπεία Προβλήματα γονιδιακής θεραπείας δεν έχουν ακόμη ξεπεραστεί προβλήματα όπως αυτά που αφορούν τη χρήση των φορέων ως φορείς χρησιμοποιούνται ιοί οι οποίοι αν και καθίστανται αβλαβείς, έχουν μικρή πιθανότητα να προκαλέσουν παρενέργειες και σε ορισμένες περιπτώσεις καρκίνο η ανάπτυξη πιο κατάλληλων φορέων είναι ο επόμενος στόχος για τη βελτίωση των μεθόδων της γονιδιακής θεραπείας

Το πρόγραμμα του ανθρώπινου γονιδιώματος Στόχος η χαρτογράφηση, δηλαδή ο εντοπισμός της θέσης των γονιδίων στα χρωμοσώματα, και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων του DNA στο ανθρώπινο γονιδίωμα Η ανάλυση του ανθρώπινου γονιδιώματος θα συμβάλει Στη μελέτη της οργάνωσης και λειτουργίας του ανθρώπινου γονιδιώματος προσδιορίστηκαν το σύνολο των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων αυτών οι περιοχές του γονιδιώματος με άγνωστη λειτουργία ο αριθμός των γονιδίων που είχε αρχικά εκτιμηθεί σε 100.000, ενώ σήμερα εκτιμάται ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες είναι λιγότερα από 40.000

Το πρόγραμμα του ανθρώπινου γονιδιώματος Στην ανάπτυξη μεθοδολογίας για τη διάγνωση και τη θεραπεία των ασθενειών με τον προσδιορισμό της θέσης και της αλληλουχίας των μεταλλαγμένων γονιδίων που σχετίζονται με ασθένειες Στη μελέτη της εξέλιξης του ανθρώπινου γονιδιώματος σε εξέλιξη προγράμματα προσδιορισμού της αλληλουχίας άλλων ειδών (πρόβατο, σκύλος, αγελάδα, διάφορα έντομα, γαιοσκώληκας, και πολλοί μικροοργανισμοί) θα συμβάλουν στην αποκάλυψη των εξελικτικών σχέσεων που υπάρχουν μεταξύ των ειδών Στη μαζική παραγωγή προϊόντων, με τις μεθόδους που χρησιμοποιεί η Βιοτεχνολογία, μετά την απομόνωση των γονιδίων χρήσιμα στη φαρμακοβιομηχανία στη βιομηχανία στη γεωργία την κτηνοτροφία

Το πρόγραμμα του ανθρώπινου γονιδιώματος Εφαρμογές προγράμματος του ανθρώπινου γονιδιώματος

Το πρόγραμμα του ανθρώπινου γονιδιώματος Χαρτογράφηση γονιδίων που σχετίζονται με γενετικές ασθένειες στο χρωμόσωμα 21 και το χρωμόσωμα Χ