ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟ ΟΞΥΓΟΝΟ (Biochemical Oxygen Demand, BOD) ΤΕΙ ΠΕΙΡΑΙΑ ΣΧΟΛΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΥΛΙΚΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟ ΟΞΥΓΟΝΟ (Biochemical Oxygen Demand, BOD) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ Γ. ΦΟΥΝΤΟΥΚΙΔΗΣ ΔΡ. ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΚΟΣ ΟΙΚΟΝΟΜΟΛΟΓΟΣ    Σχεδιασμός – Επιμέλεια: Δρ. Θεόδωρος Τριάντης

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Απόβλητα δημιουργούνται από κάθε δραστηριότητα του ανθρώπου. Είναι στερεά, υγρά και αέρια. Λύματα ή απόνερα είναι τα υγρά απόβλητα. Η χρήση των νερών από τον άνθρωπο οδηγεί στην επιβάρυνσή τους με διάφορες ουσίες με αποτέλεσμα να απαιτείται καθαρισμός τους πριν τη διάθεση τους στο περιβάλλον (αποδέκτες: θάλασσα, λίμνες, ποτάμια, ρέματα, κτλ.). Υπάρχουν τα βιομηχανικά, αστικά και τα αγροτικά λύματα. Όλα τα υγρά απόβλητα περιέχουν μικροοργανισμούς σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό ανάλογα με την προέλευσή τους. Επιπλέον, μπορεί να είναι επιβαρημένα με συγκεκριμένους ειδικούς χημικούς ρύπους (μέταλλα, τοξικά, οργανικές ουσίες, κτλ.). Οι μικροοργανισμοί των λυμάτων έχουν ανάγκη από οξυγόνο (αέρα) για να ζήσουν/αναπτυχθούν και να πεθάνουν. Εάν λείπει οξυγόνο ή είναι λίγο (χαμηλή συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, Dissolved Oxygen (DO)), «σαπίζουν» εκλύοντας χαρακτηριστική οσμή, επειδή επικρατούν αναερόβιες (αναγωγικές) διεργασίες. Στους «συνήθεις» βιολογικούς καθαρισμούς τα απόβλητα αερίζονται σε ελεγχόμενο χώρο και χρόνο και γενικά συνθήκες, οπότε οξειδώνονται σε σταθερά προϊόντα αέρια (CO2, νέα κύτταρα, νερό). Οργανικές ουσίες + Ο2 + μικροοργανισμοί → CO2 + H2O + νέα κύτταρα + σταθ. προϊόντα

ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟ ΟΞΥΓΟΝΟ Το βιοχημικά απαιτούμενο οξυγόνο (Biochemical Oxygen Demand, BOD) αναφέρεται στην βιοοξείδωση ενός λύματος και είναι η ποσότητα του οξυγόνου που απαιτείται να λάβουν οι αερόβιοι μικροοργανισμοί, για να αναπτυχθούν και να πεθάνουν, καταναλώνοντας τα θρεπτικά οργανικά συστατικά που περιέχονται σε ποσότητα λύματος ενός λίτρου, στους 20 οC. Το απαιτούμενο οξυγόνο μετριέται σε mg/l. Η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου (DO) στα λύματα (mg/l) συσχετίζεται άμεσα με το οργανικό τους φορτίο καθώς τα συστατικά που περιέχουν καταναλώνουν οξυγόνο για να σταθεροποιηθούν ενώ παράλληλα απαιτείται και για την πραγματοποίηση κάθε αερόβιας δράσης. Το BOD αποτελεί σημαντικό περιβαλλοντικό δείκτη και χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του επιπέδου ρύπανσης των αποδεκτών αλλά και του οργανικού ρυπαντικού φορτίου των αποβλήτων. Όσο μεγαλύτερο είναι το BOD τόσο επιβαρημένο είναι το απόβλητο και τόσο μεγαλύτερο πρόβλημα θα δημιουργήσει η απόρριψή του στο περιβάλλον χωρίς να προηγηθεί κατάλληλη επεξεργασία του.

ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ BOD ΜΕΘΟΔΟΣ Winkler ΜΕΘΟΔΟΣ Warburg ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΜΕΘΟΔΟΣ Winkler Αρχή της μεθόδου Στη βιολογική οξείδωση το οργανικό φορτίο οξειδώνεται, με κατανάλωση του διαλυμένου στο νερό οξυγόνου πρώτα από τα βακτήρια, που παράγουν διοξείδιο του άνθρακα και πολλαπλασιάζονται και στη συνέχεια από τα πρωτόζωα τα οποία καταναλώνουν τα βακτηριακά κύτταρα. Κατά τον προσδιορισμό του BOD λαμβάνει χώρα κυρίως η βακτηριακή οξείδωση. Τα πρωτόζωα δεν προλαβαίνουν να αναπτυχθούν, ούτε επαρκεί το διαλυμένο οξυγόνο γι αυτά. Η μέθοδος Winkler βασίζεται στον προσδιορισμό του BOD με μέτρηση του DO στην αρχή και στο τέλος πειράματος χρονικής διάρκειας 5 ημερών (BOD5) στους 20 οC, με χρήση ειδικών φιαλών (Winkler) 300 ml στις οποίες προστίθεται το δείγμα και τοποθετούνται σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας.

ΜΕΘΟΔΟΣ Winkler Υπολογισμός BOD Πριν τη μέτρηση πιθανόν να χρειάζεται αραίωση του δείγματος, ενώ εάν δεν υπάρχει επαρκής ποσότητα μικροοργανισμών στο δείγμα απαιτείται η προσθήκη επιπλέον «σποράς» δηλ. μικρής ποσότητας οικιακού λύματος. Το BOD5 όταν δεν απαιτείται σπορά και αραίωση δίνεται από την σχέση: BOD5 (mg/l) = (αρχικό DO5 mg/l - τελικό DO5 mg/l) Όταν απαιτείται αραίωση: BOD5 (mg/l)=(αρχικό DO5 mg/l - τελικό DO5 mg/l)/(Βαθμός αραίωσης) Εάν απαιτείται σπορά: BOD5 (mg/l)=(αρχικό DO5 mg/l - τελικό DO5 mg/l) - (BOD5 σποράς mg/l) x (ml σποράς / ml συνολικού μείγματος σποράς & αρχικού δείγματος)

ΜΕΘΟΔΟΣ Winkler Υπολογισμός BOD Το BOD5 όταν απαιτείται και σπορά και αραίωση δίνεται από τον τύπο: BOD5 (mg/l) = [(I-F) - (I’-F’) x (X/Y)] / D όπου: I: αρχικό DO5 (mg/l) με το δείγμα και τη σπορά και την αραίωση F: τελικό DO5 (mg/l) με το δείγμα και τη σπορά και την αραίωση I’: αρχικό DO5 (mg/l) με τη σπορά και την αραίωση F’: τελικό DO5 (mg/l) με τη σπορά και την αραίωση Χ: ml σποράς στη φιάλη του δείγματος Υ: ml στη φιάλη με τη σπορά D: Βαθμός αραίωσης

Μεταβολή του BOD συναρτήσει του χρόνου Για να είναι η μέτρηση σωστή, θα πρέπει η μεταβολή του BOD (mg/l) σε σχέση με το χρόνο να ακολουθεί την καμπύλη α του σχήματος. Στην περίπτωση αυτή το BOD σε χρόνο t μπορεί να προκύψει από τη σχέση: BODt = DOo (1-e-kt) Όπου t: η διάρκεια του πειράματος σε ημέρες DOo: η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου σε χρόνο μηδέν k: κινητική σταθερά που για αστικά λύματα μπορεί να είναι μεταξύ 0.1-0.6 1/ημέρα (20 οC) και μεταβάλλεται με τη θερμοκρασία σύμφωνα με τη σχέση (Arrhenius): kΤ = k20 (1.06)(Τ-20) Γενικά ισχύει: BOD∞ ~ BOD20 = BODU Όπου: BOD∞: Μέτρηση BOD σε «άπειρο» χρόνο BOD20: Μέτρηση BOD 20 ημερών BODU: Μέτρηση τελικού BOD Από την καμπύλη α του σχήματος φαίνεται ότι το BOD των 5 ημερών είναι περίπου το 70-80% του ολικού BOD που οφείλεται στην αποικοδόμηση του οργανικού άνθρακα. Η αναλογία αυτή ισχύει για μεγάλο αριθμό αποβλήτων και αυτός είναι ο λόγος που το BOD προσδιορίζεται σε διάρκεια πειράματος 5 ημερών (BOD5).

Προβλήματα της μεθόδου Winkler Εάν κατά την ανάλυση BOD, στο δείγμα αποβλήτων υπάρχουν βακτήρια νιτροποίησης, τότε μετά από 7-8 ημέρες θα παρουσιασθεί απότομη αύξηση της τιμής του BOD που οφείλεται στη διεργασία της νιτροποίησης (καμπύλη β, Σχημ. 1). Στην περίπτωση αυτή το BOD που θα προσδιορίζεται δεν θα αντιστοιχεί στο οργανικό φορτίο του απόβλητου. Οι αντιδράσεις νιτροποίησης είναι: NH3 + O2 → NO2- + ενέργεια NO2- + O2 → NO3- + ενέργεια Μικρή συγκέντρωση των μικροοργανισμών στο δείγμα οδηγεί σε χρονική υστέρηση της αύξησης του BOD γεγονός που υποδηλώνει την ανάγκη προσθήκης κατάλληλης «σποράς» στο δείγμα (Σχημ. 2). Απότομη αύξηση του BOD δείχνει ότι το δείγμα έχει πολύ υψηλή τιμή BOD και απαιτείται αραίωση (Σχημ. 3). Είναι επομένως κατανοητό ότι απαιτείται παρακολούθηση της σχέσης BOD-χρόνου. Κάτι τέτοιο δεν το επιτρέπει η μέθοδος Winkler.

ΜΑΝΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Warburg Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος προσφέρει την δυνατότητα συνεχούς μέτρησης του BOD. Το δείγμα, με τη σπορά και την αραίωση εάν απαιτούνται, τοποθετείται μέσα σε σκουρόχρωμες φιάλες Warburg οι οποίες στη συνέχεια εισάγονται σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας υπό ανάδευση. Με την βιοοξείδωση καταναλώνεται οξυγόνο που βρίσκεται στον αέρα πάνω από την επιφάνεια του υγρού στο εσωτερικό της φιάλης με αποτέλεσμα να ελαττώνεται η μερική πίεσή του. Με κατάλληλη βαθμονόμηση της συσκευής, η ελάττωση της μερικής πίεσης του οξυγόνου μετατρέπεται απευθείας σε ένδειξη BOD (mg/l) η οποία απεικονίζεται σε ειδική οθόνη της συσκευής. Επειδή από τη διεργασία παράγεται και διοξείδιο του άνθρακα (CO2) αυτό δεσμεύεται από ΚΟΗ που βρίσκεται μέσα στο πώμα της φιάλης. Από το BOD5 που προκύπτει από μεμονωμένη μέτρηση μετά από 5 ημέρες ή/και από την καμπύλη υπολογίζεται το τελικό ή απώτατο BOD20 (των 20 ημερών) και τα οποίο είναι ίσο με το BOD σε άπειρο χρόνο (BOD∞).

ΜΑΝΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Warburg Θα πρέπει να έχει επίσης κανείς υπόψη του ότι ενδεχομένως να απαιτηθεί αραίωση του υπό εξέταση δείγματος με νερό, όταν το δείγμα αναμένεται να έχει πολύ υψηλή τιμή BOD. Επισημαίνεται ότι οι εμπορικές συσκευές συνήθως μετρούν BOD έως 250-300 ή 500 ppm (mg/l). Κατά τις αναλύσεις, ταυτόχρονα με το υπό εξέταση δείγμα μετρούμε και το BOD του νερού ή/και της σποράς και ο τελικός υπολογισμός του BOD του δείγματος γίνεται συγκριτικά με αυτό του νερού ή/και της σποράς. Το BOD5 υπολογίζεται για πέντε μέρες στους 20 oC χρησιμοποιώντας τον κατάλληλο τύπο, ανάλογα με την αραίωση και τη χρήση ή όχι σποράς. Πίνακας 1. Ενδεικτικές αραιώσεις δειγμάτων ανάλογα με τις αναμενόμενες τιμές BOD. Αναμενόμενο BOD (τάξη μεγέθους) % αποβλήτου στο αραιωμένο δείγμα 2000 - 5000 Έως 5 1000 - 3000 5- 15 400 - 1400 20 - 50 200 - 600 50 - 100 50 - 150 100

Πίνακας 2. Τυπικές τιμές BOD για διάφορα απόβλητα. Πηγή αποβλήτου BOD5, 20 oC (mg/l) Ζαχαρουργίες 450-2000 Κονσερβοποιίες 300-4000 Οινοπνευματοποιίες 20000-45000 Τυροκομία 40000-60000 Χαρτοποιίες 500-3000 Ελαιουργεία Αστικά λύματα 250-450 Οι τιμές που αναφέρονται στον παραπάνω πίνακα είναι ενδεικτικές και στην πράξη δείγματα αποβλήτων μπορεί να έχουν τιμές διαφορετικές από αυτές.

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ BOD5 Η Μέθοδος Η εφαρμοζόμενη μέθοδος προσδιορισμού του BOD5 αποτελεί μια σύγχρονη εκδοχή της μεθόδου Winkler η οποία είναι μια ιωδομετρική μέθοδος, ενώ ο προσδιορισμός του τελικού σημείου (endpoint detection) γίνεται φωτομετρικά. Ο προσδιορισμός του BOD βασίζεται στις ακόλουθες αντιδράσεις οι οποίες λαμβάνουν χώρα μετά την επώαση του δείγματος στους 20 οC για διάστημα 5 ημερών. Mn2+ +2OH- → Mn(OH)2 (1) 2 Mn(OH)2 +1/2 O2 + H2O → 2 Mn(OH)3 (2) 2 Mn(OH)3 + 2I- + 6H+ → 2Mn2+ + I2 + 6H2O (3) I2 + I- ↔ I3- (4) Παρατηρήσεις Στην αντίδραση (2) το διαλυμένο οξυγόνο οξειδώνει το Mn(II) σε Mn(III) και όχι Mn(IV) λόγω της ύπαρξης του Mn(OH)2 σε περίσεια, ενώ η δεύσμευση του οξυγόνου είναι γρήγορη και ποσοτική. Στην αντίδραση (3) η οξίνιση του δείγματος σε τιμές pH μεταξύ 1 και 2.5 οδηγεί στην οξείδωση των ιόντων ιωδίου (Ι-) προς μοριακό Ι2 και αναγωγή των ιόντων Mn(IIΙ) σε Mn(II). Για pH> 2.5 η οξείδωση των ιόντων ιωδίου από το Mn(III) πιθανόν να μην είναι πλήρης. Στην αντίδραση (4) η ισορροπία είναι μετατοπισμένη προς τα δεξιά λόγω της χαμηλότερης τάσης ατμών του συμπλόκου Ι3- σε σχέση με το Ι2 και της περίσειας του Ι-. Απομάκρυνση του Ι2 από το σύστημα οδηγεί σε διάσπαση του Ι3-. Σύμφωνα με την στοιχειομετρία των αντιδράσεων ένα mole οξυγόνου είναι ισοδύναμο με δύο mole Ι3-.

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ BOD5 O προσδιορισμός του BOD προκύπτει με τον έμμεσο υπολογισμό της συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου στο δείγμα. Το διαλυμένο οξυγόνο υπολογίζεται με βάση την στοιχειομετρία των αντιδράσεων 1-4 (ένα mole οξυγόνου είναι ισοδύναμο με δύο mole Ι3-) και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του Ι3- με μέτρηση της απορρόφησης του διαλύματος στην περιοχή του υπεριώδους – ορατού φάσματος. Όλες οι χημικές ενώσεις απορροφούν ακτινοβολία κατάλληλου μήκους κύματος ανάλογα με την μοριακή τους δομή. Ένα χαρακτηριστικό φάσμα απορρόφησης του συμπλόκου (Ι3-) φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. Φάσμα απορρόφησης ενός δείγματος ελέγχου μετά την ολοκλήρωση των αντιδράσεων (1) – (4). Οι κορυφές στα 288 και 353 nm είναι χαρακτηριστικές του συμπλόκου (Ι3-) (ε288=4x104 και ε353=2.64x104, A.D. Awtrey, R.E. Connick, Journal of the American Chemical Society, 73(4) (1951) 1842-1843).

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ BOD5 Νόμος Lambert – Beer Η σχέση που συνδέει την απορρόφηση (Α) με την συγκέντρωση (C) μιας ένωσης στο διάλυμα είναι γνωστή ως νόμος Lambert – Beer και είναι η ακόλουθη: Α = -log (I/Io) = ε × c × l Όπου Α: η απορρόφηση του διαλύματος σε συγκεκριμένο μήκος κύματος ε: ο συντελεστής μοριακής απορροφητικότητας της ένωσης στο αντίστοιχο μήκος κύματος (Μ-1 cm-1), ο οποίος έχει χαρακτηριστική τιμή για κάθε ένωση και σε κάθε μήκος κύματος c: η συγκέντρωση του διαλύματος (Μ) l: η οπτική διαδρομή της δέσμης ακτινοβολίας (cm) Io: η ένταση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας Ι: η ένταση της εξερχόμενης ακτινοβολίας Όπως έχει ήδη αναφερθεί ο φωτομετρικός προσδιορισμός του BOD αποτελεί μια σύγχρονη εκδοχή της μεθόδου Winkler. Η παραδοσιακή έκδοση της μεθόδου περιελάμβανε τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του (Ι3-) μέσω της τιτλοδότησης με πρότυπο διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου και χρήση δείκτη αμύλου. I3- + 2S2O32- → 3I- + S4O62- (5) Στην περίπτωση αυτή το ισοδύναμο σημείο εκτός από την χρήση του δείκτη αμύλου μπορεί να προσδιορισθεί και φωτομετρικά ή αμπερομετρικά. Η χρήση αυτών των τεχνικών οδηγεί σε βελτίωση τόσο της ακρίβειας όσο και της ευαισθησίας της μεθόδου.

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ BOD5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η εκτέλεση του πειραματικού μέρους περιλαμβάνει δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο γίνεται η προετοιμασία και η παρασκευή των δειγμάτων τα οποία επωάζονται στους 20 ± 1 οC για 5 ημέρες ενώ στο δεύτερο στάδιο γίνεται ο φωτομετρικός προσδιορισμός του BOD. ΟΡΓΑΝΑ – ΣΚΕΥΗ Πλαστικό δοχείο όγκου 1 L με καπάκι το οποίο φέρει στο κέντρο κατάλληλη οπή Αντλία αέρα Κατάλληλο πλαστικό σωλήνα στο ένα άκρο του οποίου προσαρμόζεται ειδικό φίλτρο Θερμοστατούμενος θάλαμος στους 20 ± 1 οC Γυάλινα ποτήρια, σιφώνια, ογκομετρικές φιάλες Δύο γυάλινα φιαλίδια με πώμα για την παρασκευή των δειγμάτων (reaction vessels) Δοκιμαστικοί σωλήνες (Nanocolor, test 8-25, BSB5-RKT, BOD5-TT) οι οποίοι περιέχουν σε στερεά μορφή κατάλληλη ποσότητα της ένωσης N-allylthiourea (αντιδραστήριο BOD5-TT R0) ώστε να περεμοδίζεται η διεργασία της νιτροποίησης του δείγματος (οξείδωση του οργανικού αζώτου) Ειδικό Φωτόμετρο με ενσωματωμένη μέθοδο για τον αυτόματο υπολογισμό του BOD

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ BOD5 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Απιονισμένο νερό Αντιδραστήριο BOD5-TT R1 (διάλυμα MnCl2) Αντιδραστήριο BOD5-TT R2 (αλκαλικό (NaOH, 25%) διάλυμα ιωδιούχου καλίου (ΚΙ)) Αντιδραστήριο BOD5-TT R3 (υδατικό διάλυμα H2SO4 63%) D(+)-Glucose (Μ.Β. 180.16 g/mol) L-Glutamic acid (Μ.Β. 147.13 g/mol) Kit που περιέχει τους δοκιμαστικούς σωλήνες καθώς και τα διαλύματα των αντιδραστηρίων R1, R2, R3

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Αερισμός του νερού αραίωσης Για την παρασκευή των διαλυμάτων και την αραίωση του δείγματος απαιτείται η χρήση οξυγονωμένου νερού ώστε να είναι κορεσμένο σε οξυγόμο. Η οξυγόνωση επιτυγχάνεται με τον αερισμό του νερού σύμφωνα με την παρακάτω διαδικασία (βλέπε σχήμα): • Γεμίζουμε το πλαστικό δοχείο με απιονισμένο νερό • Εισάγουμε τον πλαστικό σωλήνα στο δοχείο, κλείνουμε το πώμα και συνδέουμε το σωλήνα με την αντλία (προσοχή!! Η αντλία θα πρέπει να βρίσκεται ψηλότερα από το επίπεδο του νερού στο δοχείο διαφορετικά πιθανή ροή του νερού προς την αντλία μπορεί να οδηγήσει στην καταστροφή της) • Οξυγονώνουμε το νερό για διάστημα 1 ώρας Διάταξη για τον αερισμό του νερού

Εμβολιασμός του νερού αραίωσης με μικροοργανισμούς ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Το απιονισμένο νερό θα πρέπει να παραμείνει εκτεθιμένο στον αέρα για διάστημα τουλάχιστον δύο ημερών ώστε να εμπλουτισθεί με μικροοργανισμούς. Το νερό δέν θα πρέπει να περιέχει χλώριο, χαλκό ή χλωραμίνη σε ποσότητες μεγαλύτερες από 0.01 mg/L. Το pH του νερού θα πρέπει να είναι μεταξύ 6 και 8. Σε διαφορετική περίπτωση θα πρέπει να διορθώνεται κατάλληλα με χρήση NaOH 0.1N ή HCl 0.1N. Το ίδιο ισχύει και για το δείγμα. Εάν κατά την διόρθωση του pH σχηματισθεί ίζημα αυτό θα πρέπει να απομακρύνεται με φιλτράρισμα. Μετά τον αερισμό του νερού για 1 ώρα η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 8 mg/l. Εμβολιασμός του νερού αραίωσης με μικροοργανισμούς Εάν το δείγμα δεν περιέχει αρκετούς και κατάλληλους μικροοργανισμούς τότε απαιτείται ο εμβολιασμός του νερού αραίωσης. Αυτό μπορεί να γίνει με προσθήκη μικρής ποσότητας επιφανειακού νερού το οποίο περιέχει αστικά λύματα. Ειδικότερα, σε 1 L οξυγονωμένου νερού προστίθενται 10 ml επιφανειακού νερού αμέσως πριν την χρήση του. Περιπτώσεις δειγμάτων όπου απαιτείται η χρήση εμβολιασμένου νερού αραίωσης: • Βιομηχανικά απόβλητα, βιολογικώς ανενεργά • Επιφανειακά νερά τα οποία δεν περιέχουν αστικά λύματα • Κατεψυγμένα δείγματα • Δείγματα πρότυπων ουσιών

Διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων Δείγμα ελέγχου (τυφλό) Η παρασκευή του δείγματος ελέγχου γίνεται ως εξής: Με σιφώνιο μεταφέρουμε 20 ml νερού αραίωσης σε κατάλληλο γυάλινο δοχείο (reaction vessel), κλείνουμε το πώμα και ανακινούμε έντονα για 30 δευτερόλεπτα ώστε να εμπλουτισθεί το νερό με οξυγόνο Ανοίγουμε ένα δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το αντιδραστήριο BOD5-TT R0 (N-allylthiourea) και τον γεμίζουμε με το νερό αραίωσης μέχρι το χείλος προσέχοντας να μην υπάρχουν στο εσωτερικό φυσαλλίδες αέρα Κλείνουμε τον δοκιμαστικό σωλήνα με κατάλληλο βιδωτό πώμα έτσι ώστε να μην υπάρχουν φυσαλλίδες στο εσωτερικό, σημαίνουμε με αυτοκόλλητη ετικέτα το δοκιμαστικό σωλήνα ως δείγμα ελέγχου και τον τοποθετούμε σε ειδικό θάλαμο ο οποίος θερμοστατείται στους 20 ± 1 οC για 5 ημέρες

Διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων Δείγμα πρότυπων ουσιών (sample) Η παρασκευή του δείγματος πρότυπων ουσιών γίνεται ως εξής: Ζυγίζουμε 12.5 mg D(+)-Glucose και 12.5 mg L-Glutamic acid και τα διαλύουμε, υπό ανάδευση, σε 500 ml νερού αραίωσης. Με σιφώνιο μεταφέρουμε 4 ml του ανωτέρω διαλύματος και 16 ml νερού αραίωσης σε κατάλληλο γυάλινο δοχείο (reaction vessel), κλείνουμε το πώμα και ανακινούμε έντονα για 30 δευτερόλεπτα ώστε να εμπλουτισθεί το δείγμα με οξυγόνο. Ανοίγουμε ένα δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το αντιδραστήριο BOD5-TT R0 και τον γεμίζουμε με το δείγμα μέχρι το χείλος προσέχωντας να μην υπάρχουν στο εσωτερικό φυσαλλίδες αέρα. Κλείνουμε τον δοκιμαστικό σωλήνα με κατάλληλο βιδωτό πώμα έτσι ώστε να μην υπάρχουν φυσαλλίδες στο εσωτερικό, σημαίνουμε με αυτοκόλλητη ετικέτα το δοκιμαστικό σωλήνα ως δείγμα και τον τοποθετούμε σε ειδικό θάλαμο ο οποίος θερμοστατείται στους 20 ± 1 οC για 5 ημέρες.

Διαδικασία μέτρησης του BOD5 Μετά την επώαση των δειγμάτων στους 20 ± 1 οC για 5 ημέρες η μέτρηση του BOD5 γίνεται ως ακολούθως: Ανοίγουμε τους δοκιμαστικούς σωλήνες με το δείγμα και το δείγμα ελέγχου. Προσθέτουμε σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 2 σταγόνες από τα διαλύματα R1 και R2. Κλείνουμε τους δύο δοκιμαστικούς σωλήνες και περιμένουμε για 5 λεπτά. Προσθέτουμε σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 5 σταγόνες διαλύματος R3 και ανακινούμε ώστε να διαλυθεί τυχόν ίζημα που υπάρχει στο διάλυμα. Ακολουθεί ο φωτομετρικός προσδιορισμός του BOD5 με χρήση του φωτομέτρου PF-11. Το φωτόμετρο διαθέτει ενσωματωμένη μέθοδο η χρήση της οποίας παρέχει την δυνατότητα της απευθείας μέτρησης του BOD5 για το δείγμα. Τα βήματα που πρέπει να ακολουθηθούν περιγράφονται στη συνέχεια.

Διαδικασία μέτρησης του BOD5 Ανοίγουμε το όργανο πιέζοντας το πλήκτρο 1. Ο επιλογέας οπτικού φίλτρου (2) θα πρέπει να είναι στη θέση 2. Τοποθετούμε τον δοκιμαστικό σωλήνα του δείγματος ελέγχου (control sample) στην θέση 3. Πατώντας το πλήκτρο 4 εναλλάσουμε τις αποθηκευμένες μεθόδους στο όργανο μέχρι να εμφανισθεί στην οθόνη η μέθοδος 8-25 BOD5-TT Πατώντας το πλήκτρο 5 (Null zero) την επιλέγουμε. Πιέζοντας ξανά το πλήκτρο 5 μετράμε το δείγμα ελέγχου Τοποθετούμε στη θέση 3 τον δοκιμαστικό σωλήνα του δείγματος το οποίο μετράμε πιέζοντας το πλήκτρο 6 (Μ) Στην οθόνη του οργάνου διαβάζουμε την τιμή του BOD για το δείγμα μας Η τιμή του BOD για το αρχικό διάλυμα προκύπτει πολλαπλασιάζοντας την ένδειξη του οργάνου με τον συντελεστή αραίωσης.