ΓΗΡΑΝΣΗ – ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗ – ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ Δημήτριος Ι. Στραβοπόδης, M.Sc., Ph.D. Επίκουρος Καθηγητής, Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ Αθήνα, 2008

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Επιβίωση ατόμων (θεμελιώδης αρχή εξέλιξης) Αναπαραγωγή & μεγάλωμα νεογνών Διαδικασία γήρανσης (ageing) Αργή μείωση φυσιολογικών ρυθμών Προοδευτική απώλεια λειτουργικότητας οργανισμού Μειωμένη γονιμότητα Αυξημένη ευπάθεια στη πλειονότητα των ασθενειών Σημαντική θνησιμότητα ΠΑΡΑΤΗΡΕΙΤΑΙ ΣΕ: Όλα τα ζώα κατά την ενηλικίωση που αποκτούν ορισμένο μέγεθος Όλα τα μέλη ενός είδους, μετά την αναπαραγωγική ηλικία Όλα τα ζώα σε κατάσταση αιχμαλωσίας Τεχνητή κατάσταση λόγω βιοϊατρικής επανάστασης: ποτέ δεν θα έφταναν σε ηλικία γήρατος

ΒΙΟΓΕΡΟΝΤΟΛΟΓΙΑ Μελέτη μηχανισμών γήρανσης ΓΗΡΙΑΤΡΙΚΗ Μελέτη ασθενειών γήρατος: καρκίνος, καρδιαγγειακές νόσοι ΓΗΡΑΣ: Στοχαστική (ενδεχομένως) διαδικασία – σε αντίθεση με την ανάπτυξη Σημαντική ετερογένεια Ανακριβής προσδιορισμός χρονικής εξέλιξης φαινοτύπου γήρανσης Γενετικό υπόβαθρο Συσσώρευση επιγενετικών επιδράσεων περιβάλλοντος Συσσώρευση γενετικής αστάθειας Στρες ΜΟΝΟΔΙΑΣΤΑΤΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Νόσος Alzheimer ΤΜΗΜΑΤΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΠΡΩΪΜΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ

Εμφάνιση μεγάλου αριθμού μεταλλαγών Αύξηση αστάθειας γονιδιώματος Μεταβολές μεταβολισμού λιπών & σακχάρων ΣΥΝΔΡΟΜΟ Werner Ομοζυγωτία μιας μεταλλαγμένης ελικάσης της οικογένειας RecQ (Werner protein) Δράση εξωνουκλεάσης (5’-3’ & 3’-5’) Συμμετοχή σε: αντιγραφή, μεταγραφή, επιδιόρθωση & ανασυνδυασμό DNA Κύτταρα φορέων (ήδη από την 3η δεκαετία): Συσσώρευση σωματικών μεταλλαγών / Δερματική ατροφία Μειωμένη γονιμότητα / Τοπική ατροφία υποδόριων ιστών Μεταβολές στη φωνή / γκριζάρισμα μαλλιών 4η δεκαετία: καταρράκτης / αρτηριοσκλήρυνση / καρκίνος / οστεοπόρωση Τενοντίτιδες / διαβήτης τύπου ΙΙ / έμφραγμα μυοκαρδίου (47-48 ετών)

ΓΗΡΑΝΣΗ: Εξωκυττάριου περιβάλλοντος Μιτωτικών κυττάρων ινοβλάστες Δερματικοί Ινοβλάστες Ώριμοι Νευρώνες ΓΗΡΑΝΣΗ: Εξωκυττάριου περιβάλλοντος Μιτωτικών κυττάρων ινοβλάστες Μετα-μιτωτικών κυττάρων νευρώνες

ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ Αριθμός απογόνων Απόκριση στο οξειδωτικό στρες Απόκριση σε ορμονικά ερεθίσματα Ενεργότητα ογκο-κατασταλτικών γονιδίων Ενεργότητα γονιδίων μακροβιότητας Ενεργότητα τελομεράσης Μήκος (μείωση) τελομερών χρωμοσωμάτων Έκθεση σε οξύ στρες Χρόνια έκθεση σε στρες ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ Βιοψία δέρματος: Δερματικοί ινοβλάστες ~ 50 κύκλοι διαίρεσης (population doubling: PD) Βιώσιμη αναστολή κυτταρικού κύκλου Αριθμός κυτταρικών διαιρέσεων (άσχετη από τον ημερολογιακό χρόνο καλλιέργειας)

ANAΔΙΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΗ (ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗ) ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ: ΑΚΓ (Replicative Senescence) Μορφολογικές / Φυσιολογικές / Βιοχημικές / Μοριακές Αλλαγές Μεταβολικά ενεργά κύτταρα Αλλαγή κυτταρικού σχήματος από ατρακτοειδές σε πεπλατυσμένο Μόνιμη αναστολή κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 (Διακριτή από τη G0 φάση εφησύχανσης του κυτταρικού κύκλου [quiescent cells]) Μόνιμη απώλεια σύνθεσης DNA Μείωση μιτοχονδριακής λειτουργίας Αυξημένη οξείδωση Αλλαγές στη σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας Αντοχή στην επαγωγή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [απόπτωσης] Αλλοίωση του μεταγραφικού προφίλ έκφρασης διαφορετικών γονιδίων ΜΕΙΩΣΗ ΤΟΥ ΜΗΚΟΥΣ ΤΩΝ ΤΕΛΟΜΕΡΩΝ ΑΚΓ: ινοβλάστες / μεσοθηλιακά / Τ / Κερατινοκύτταρα / Επιθηλιακά / Γλοίας / Αμφιβληστροειδικού χρωμοφόρου επιθηλίου

ΕΞΑΝΤΛΗΣΗ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ Μείωση μήκους τελομερών Απουσία ενεργότητας τελομεράσης σταθεροποίηση μήκους τελομερών ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ (ΚΓ: cellular senescence) Μη-επιδιορθώσιμη αλλοίωση DNA Μεταβολές στη δομή της χρωματίνης Ογκογόνα / μιτογόνα σήματα Υπερ-έκφραση ογκοκατασταλτικών γονιδίων Τελική διαφοροποίηση Χρόνιο / οξύ στρες Συσσώρευση βλαβών στο πυρηνικό / μιτοχονδριακό DNA ΚΓ ~ ΑΚΓ (στρες) [ΑΚΓ: μοντέλο γενετικής βάσης της γήρανσης] ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗ ΕΝΖΥΜΟΥ SA-β-γαλακτοσιδάση (pH: 6.0) / ΙΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ

ΚΓ: ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ Καθορισμός αριθμού κυτταρικών διαιρέσεων Επιθεώρηση ακεραιότητας χρωμοσωμάτων Μείωση μήκους τελομερών Ελάττωση ενεργότητας τελομεράσης ΕΞΩΓΕΝΗΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ Ανεξάρτητος μήκους τελομερών Ρύθμιση από «στρες» / εξωγενείς παράγοντες Επαγωγή ενεργότητας ογκοκατασταλτικών γονιδίων: p53, CdkIs ΚΓ: p53 – p21Cip1 & p16INK4a: αναστολή Rb-φωσφορυλίωση ΚΓ: οξειδωτκό στρες: ελεύθερες ρίζες – RΟS – μεταβολικά παράγωγα μοριακού Ο2 / Μιτοχόνδρια: κατανάλωση Ο2 / αντιμετώπιση ROS Αντιμετώπιση ROS (αντιοξειδωτικά συστήματα): ΚΑΤΑΛΑΣΗ

ΥΠΟΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ROS ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΙΚΗ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΚΗ ΔΙΣΜΟΥΤΑΣΗ (Superoxide Dismutase: SOD) SOD: κατάλυση υπεροξειδικών ανιόντων σε Η2Ο2 & τελική παραγωγή Η2Ο μέσω ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ & ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΙΚΗΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΥΠΟΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ROS Απομάκρυνση οξειδωμένων πρωτεϊνών μέσω: Πρωτεασώματος Eιδικών πρωτεασών του μιτοχονδρίου Κυτταροπλασματικών καλπαϊνών Λυσοσωμικών ενζύμων Πρόκληση κυτταρικού θανάτου – απόπτωσης

Κύτταρα τρωκτικών: ενεργή τελομεράση (ΚΓ: εξωγενής μηχανισμός)

ΤΕΛΟΜΕΡΑΣΗ – ΟΡΙΟ HAYFLICK Μείωση μήκους ανθρώπινων τελομερών: Αύξηση αριθμού κυτταρικών διαιρέσεων Αύξηση ηλικίας δότη ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΑΚΓ: μόνιμη αναστολή αύξησης Μη πλήρης αντιγραφή χρωμοσωμικών άκρων ΟΡΙΟ HAYFLICK (Leonard Hayflick) ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ (ΑΚΓ) Μετά από πεπερασμένο αριθμό κυτταρικών διαιρέσεων ΜΕΙΩΣΗ ΜΗΚΟΥΣ ΤΕΛΟΜΕΡΩΝ / ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΙΡΕΣΗ: Δομή ανθρώπινων χρωμοσωμάτων Απουσία ενεργότητας τελομεράσης Πρόβλημα αντιγραφής τελομερικών άκρων από τις συμβατικές πολυμεράσες Σωματικά κύτταρα: 4-7 Kb, Εμβρυϊκά κύτταρα: 15-20 Kb (μήκος τελομερούς)

Άκρα: τελομερή (εξειδικευμένες δομές) Χρωμοσώματα Γραμμικό DNA Άκρα: τελομερή (εξειδικευμένες δομές) [ΤΤΑGGG]n: σειριακή επανάληψη (χιλιάδες φορές) εξαμερούς ακολουθίας ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΕΛΟΜΕΡΟΥΣ TRF1 (τελομερικός παράγοντας πρόσδεσης 1) TRF2 (τελομερικός παράγοντας πρόσδεσης 2) TIN2 (TRF1 αλληλεπιδρούσα πυρηνική πρωτεΐνη 2) Tankyrase hRap Ku ετεροδιμερές Προστασία από: ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ / ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟ / ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗ ΣΥΝΤΗΞΗ / Υποστήριξη αντίληψης για ΜΗ-ΣΠΑΣΙΜΟ DNA (π.χ. Χ-, γ-ακτινοβολία): ΑΠΟΦΥΓΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΑΥΞΗΣΗΣ & ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΚΟΝΤΑ ΤΕΛΟΜΕΡΗ: ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΥΞΗΣΗΣ: Άγνωστος Μηχανισμός