Καθηγήτρια Μοριακής Γενετικής Γονιδιακή Θεραπεία: ΠΜΣ στις ΒΙΕ Μάθημα Ειδίκευσης 2006-2007 6-8/2 & 12/2/07 Αγλαϊα Αθανασιάδου Καθηγήτρια Μοριακής Γενετικής Ιατρική Πατρών

Η Γονιδιακή Θεραπεία έγινε πραγματικότητα στις 14 -9- 1990

Τι είναι η Γονιδιακή Θεραπεία ? Μία προσέγγιση Μοριακής Ιατρικής που περιλαμβάνει μεταφορά γονιδίων με στόχο την επίτευξη και διατήρηση του σωστού επιπέδου μίας λειτουργικής πρωτεϊνης, που ενέχεται σε μία ασθένεια, σε όλη τη ζωή του ατόμου

Θεραπευτική Προσέγγιση όπου το φάρμακο δεν είναι πρωτεϊνη ή άλλο σκεύασμα, αλλά ένα τμήμα γενετικού υλικού: ένα τμήμα DNA

Η ιδέα γεννήθηκε εδώ και μισό αιώνα περίπου, όταν έγινε κατανοητός όταν έγινε κατανοητός ο τρόπος που οι ιοί μολύνουν τα κύτταρα : στέλνοντας το γενετικό του υλικό μέσα στα κύτταρα-στόχο που μολύνουν

Πώς γίνεται η Γονιδιακή Θεραπεία? Α. Στρατηγικές & Στόχοι

Στρατηγικές ως προς τον στόχο Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo ως προς τον στόχο αρχικές προσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις Αναστολή της έκφρασης γονιδίου Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP

in vivo ex vivo Μεταφορά σε κύτταρα του Αιμοποιητικού Συστήματος

Στρατηγικές Ως προς την ασθένεια νεώτερες προσεγγίσεις Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo Ως προς την ασθένεια αρχικές προσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις Αναστολή της έκφρασης γονιδίου Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP

Ασθένειες που οφείλονται σε ελάττωση ή έλλειψη μιας πρωτείνης

Στρατηγικές Ως προς τον στόχο νεώτερες προσεγγίσεις Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo Ως προς τον στόχο αρχικέςπροσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις Αναστολή της έκφρασης γονιδίου Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP

2.Καρκίνος

Στρατηγικές Ως προς τον στόχο νεώτερες προσεγγίσεις Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo Ως προς τον στόχο αρχικέςπροσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις 3. Αναστολή της έκφρασης γονιδίου 4. Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP

3.RNAi: Καρκίνος

Στρατηγικές Ως προς τον στόχο νεώτερες προσεγγίσεις Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo Ως προς τον στόχο αρχικέςπροσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις 3. Αναστολή της έκφρασης γονιδίου 4. Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP (Genome editing)

X 4. Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP : κληρονομικές ασθένειες Γονίδιο–στόχος με μετάλλαξη X Μεταφορά Τεχνητού μορίου ZFP, το οποίο επάγει θραύση Δράση του διορθωτικού μηχανισμού του κυττάρου Διόρθωση με βάση τη σωστή αλληλουχία Αποκατάσταση !!

Πώς γίνεται η Γονιδιακή Θεραπεία? Β. Φορείς ή οχήματα

Ο ιδανικός φορέας πρέπει να εξασφαλίζει μεγάλη διαμολυσματική ικανότητα για διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα στόχευση στα κατάλληλα κύτταρα συνεχή και ρυθμιζόμενη έκφραση του διαγονιδίου

Ο ιδανικός φορέας πρέπει να μην προκαλεί ανοσολογική αντίδραση μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA λόγω ενσωμάτωσης και τέλος πρέπει: Να είναι δυνατή η μαζική παραγωγή του εύκολα και επαναλήψιμα

Φορείς γονιδιακής μεταφοράς ρετρο-ιϊκοί (RV) αδενο-ιϊκοί (AV) ιϊκοί φορείς adeno-associated (AAV) ηλεκτροδιάτρηση φυσικές μέθοδοι “gene-gun” microinjection μη ιϊκοί φορείς Πλασμίδια επισώματα κατιονικά λιπίδια χημικές μέθοδοι κατιονικά πεπτίδια κατιονικά πολυμερή

Vector Insert Ability to Titers Major advantages Major limitations Insert size (kb) Ability to integrate Titers (tu/ml)a Major advantages Major limitations MMLV Yes 106 Stable transfection of dividing cells Infects rapidly dividing cells best HIV-1-based lentivirus 106-107 Able to infect dividing and non-dividing cells Conversion to HIV-1 and possible recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response 30 107 Low toxicity and immunogenicity Hard to produce AAV 109 Stable transfection, low toxicity and immunogenicity Small insert size HSV 1011 Large transgene capacity, high titers HSV amplicon Large transgene capacity, low toxicity and immunogenicity Relatively low titers Vaccinia NA Large transgene capacity, cytoplasmic expression Limited to non-small pox vaccinated or immunocompetent individuals Vector Insert size (kb) Ability to integrate Titers (tu/ml)a Major advantages Major limitations MMLV Yes 106 Stable transfection of dividing cells Infects rapidly dividing cells best HIV-1-based lentivirus 106-107 Able to infect dividing and non-dividing cells Conversion to HIV-1 and possible recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response 30 107 Low toxicity and immunogenicity Hard to produce AAV 109 Stable transfection, low toxicity and immunogenicity Small insert size HSV 1011 Large transgene capacity, high titers HSV amplicon Large transgene capacity, low toxicity and immunogenicity Relatively low titers Vaccinia NA Large transgene capacity, cytoplasmic expression Limited to non-small pox vaccinated or immunocompetent individuals Vector Insert size (kb) Ability to integrate Titers (tu/ml)a Major advantages Major limitations MMLV Yes 106 Stable transfection of dividing cells Infects rapidly dividing cells best HIV-1-based lentivirus 106-107 Able to infect dividing and non-dividing cells Conversion to HIV-1 and possible recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response 30 107 Low toxicity and immunogenicity Hard to produce AAV 109 Stable transfection, low toxicity and immunogenicity Small insert size HSV 1011 Large transgene capacity, high titers HSV amplicon Large transgene capacity, low toxicity and immunogenicity Relatively low titers Vaccinia NA Large transgene capacity, cytoplasmic expression Limited to non-small pox vaccinated or immunocompetent individuals 8 8 8 10 10 10 7.5 Vector Insert Ability to Titers Major advantages Major limitations size (kb) integrate (tu/ml)a MMLV < 8 Yes 106 Stable transfection Infects rapidly of dividing cells dividing cells best HIV-1- <10 Yes 106-107 Able to infect Conversion to based dividing and HIV-1 and possible lentivirus non-dividing cells recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad <7.5 No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response Gutted Ad 30 No 107 Low toxicity and Hard to produce immunogenicity AAV <4.5 Yes 109 Stable transfection, Small insert size low toxicity and HSV <30 No 1011 Large transgene Transient expression, capacity, high titers triggers immune response Ad 30 30 30 50 50 50 25 25 25

Ιϊκοί φορείς : το μεγαλύτερο ποσοστό οχημάτων gene

Viral Vectors High efficiency of transduction Oncoretroviral Vectors : Murine Leukemia Virus in 60% of all approved clinical protocols BUT Low titers Only dividing cells Adenovirus Vectors : Human, infect all cells including nondividing Cells. Used extensively in Cystic Fibrosis, Does not integrade Low expression level Immune response Second Generation adenovirus vectors “gutless vectors”

Viral Vectors Συνέχεια Adeno-associated virusVectors : ssDNA, integration, on 19q13.3-qter 96% of parental AAV genome deleted BUT up to 4.5 kb insert. Herpes simplex virus Vectors (HSV): Lifelong latent infections in neurons, Nonintegrating Lentiviruses (complex retroviruses including HIV) : tranduce nondividing cells Safety ??

J. Gene Med.

Κύρια προβλήματα 2. Μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA Ωστόσο σε κλινικές δοκιμές με ιικά συστήματα 2. Μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA 2002 : Ανάπτυξη λευχαιμίας σε δύο παιδιά με X-SCID κατά την κλινική δοκιμή με Ad ιικό σύστημα Λόγω ενσωμάτωσης δίπλα και μέσα στο ογκογονίδιο LMO2 Ωστόσο With X-SCID study , “gene therapy” rises to a level of rigorous clinical research with quantifiable risk/benefit ratio, a new epoch for human genetics Theodore Friedman ESGT Nov.2004

κλινικής δοκιμής με Ad ιικό σύστημα. Κύρια προβλήματα σε κλινικές δοκιμές με ιικά συστήματα Ανοσολογική αντίδραση η τοξικότητα 1999 : Ο θάνατος του Jess Gelsinger κατά την διάρκεια κλινικής δοκιμής με Ad ιικό σύστημα. Έπασχε από : OTC deficiency, Ανεπάρκεια της τρανσκαρβαμυλάσης της ορνιθίνης Πέθανε από : «multiple-organ-system failure» Dr. Harold Varmus, the director of the ΝΙΗ : "Gene therapy is not yet therapy."

Υβριδικοί Ιικοί φορείς Σχεδιασμός Replication deficient Replication conditioned “gutted” and hybrid vectors με απαλοιφή των μη-απαραίτητων η τοξικών γονιδίων ή με ενσωμάτωση στοιχείων που ενισχύουν την γονιδιακή μεταφορά in vivo. 4. Χρήση ιστοειδικών υποκινητών για την ρύθμιση της έκφρασης του διαγονιδίου

Τρέχουσα έρευνα για την αντιμετώπιση των προβλημάτων των ιικών φορέων Οι νεώτερης γενιάς ιϊκοί φορείς έχουν τις ελάχιστες δυνατές ιϊκές πρωτεϊνες και φέρουν τροποποιήσεις στις LTR Γίνεται εκτεταμένη ανάλυση του γονιδιώματος μετά την ενσωμάτωση προκειμένου να προσδιοριστούν οι ειδικές θέσεις ενσωμάτωσης για κάθε ιϊκό σύστημα, εφ’όσον υπάρχουν 3. Αναπτύσσονται μη ιϊκά συστήματα μεταφοράς γονιδίων

Μη Ιικοί φορείς Τεχνητά χρωμοσώματα Επισωματικοί φορείς

S/MAR- based HAC EBV-based

pEPI-2, a chromosome-based vector S/MAR: Scaffold/matrix attachment region Lipps and Co., Nucleic Acids Res, 1999

Κλινικές δοκιμές

J. Gene Med.

J. Gene Med.

J. Gene Med.

J. Gene Med.

Παρόλα αυτά η ΓΘ δεν είναι ακόμα θεραπεία: δεν συνταγογραφείται πουθενά στον κόσμο Είναι έρευνα, πολλά υποσχόμενη!

Δεν είναι αποδεκτή η επέμβαση στα γαμετικά/σωματικά κύτταρα του ανθρώπου Η ΓΘ Γαμετικών κυττάρων θεωρείται ότι Έχει υπερβολική επιστημονική αβεβαιότητα ως προς τα μακροχρόνια αποτελέσματα Δημιουργεί το πειρασμό αλλαγής «κοινωνικών» χαρακτηριστικών Αφορά έρευνα σε έμβρυα- που δεν είναι δυνατόν να δώσουν συγκατάθεση 4. Αφορά στην αλλαγή γενετικού υλικού μελλοντικών ανθρώπων χωρίς την συγκατάθεση τους 5. Αφορά παρέμβαση στη γονιδιακή δεξαμενή του Ανθρώπου με απρόβλεπτες συνέπειες.

Είναι αποδεκτή η επέμβαση στα γαμετικά/σωματικά κύτταρα του ανθρώπου; Κοινωνικοί, επιστημονικοί , θρησκευτικοί και ιατρικοί φορείς συμφωνούν κατ’αρχήν στο ότι η ΓΘ σωματικών κυττάρων είναι αποδεκτή

J. Gene Med.

Σήμερα είναι φανερό πως Παρά τα επιστημονικά ερωτήματα και ηθικά διλλήματα που ακολουθούν τη Γονιδιακή Θεραπεία το πεδίο θα εξακολουθήσει να αναπτύσσεται Και υπάρχει η βάσιμη διαίσθηση ότι θα αλλάξει την Ιατρική πιο γρήγορα από οποιοδήποτε προηγούμενο ιατρικό επίτευγμα