ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΟΙΧΩΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ – ΧΡΩΣΕΙΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΟΙΧΩΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ – ΧΡΩΣΕΙΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Γαντά Σοφία Ειδικευόμενη Ιατρικής Βιοπαθολογίας Α.Ν.Θ. Θεαγένειο Συντονίστρια: Δρ. Χατζηδημητρίου Μαρία

Τα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί, συνήθως μονοκύτταροι μικροοργανισμοί Διακρίνονται με το οπτικό μικροσκόπιο (μέγεθος < 0.2 μm) Όταν καλλιεργούνται σε θρεπτικά υλικά σχηματίζουν μακροσκοπικά ορατές δομές, τις αποικίες

ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Σφαιρική μορφή (σταφυλόκοκκοι, στρεπτόκοκκοι, διπλόκοκκοι, τετραδικοί, σαρκίνες) Βακτηρίδια (σχήμα επίμηκες, <<δίκην ραβδίου>>) Δονάκια (σχήμα επίμηκες και κεκαμμένο, <<δίκην κόμματος>>) Σπειρύλια (σχήμα επίμηκες με κάμψεις περισσότερες από μία) Σπειροχαίτες (έχουν λεπτό επίμηκες ευκίνητο σώμα, περιεστραμμένο περί τον επιμήκη άξονά του)

ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

βακτηρια7.jpg

ΔΟΜΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Κυτταρικό τοίχωμα Κυτταρική μεμβράνη Κυτταρόπλασμα Βακτηριακό DNA Πλασμίδια Κοκκία Ριβοσώματα Κάποια βακτήρια μπορεί να φέρουν εξωτερικές δομές: Έλυτρο Μαστίγια και βλεφαρίδες

ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ Περικλείει το πρωτόπλασμα Εντοπίζεται εξωτερικά από την κυτταρική μεμβράνη Είναι δομή πάχους 10-25nm,ανθεκτική, άκαμπτη με μικρή ελαστικότητα, πορώδης Ελεύθερα διαπερατή σε μόρια μάζας < 10kDa και διαμέτρου < 1nm 9

Η σύνθεση του τοιχώματος διαφέρει σημαντικά στα διάφορα είδη βακτηρίων Βασικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος είναι η πεπτιδογλυκάνη Ετεροδιμερές που αποτελείται από μόρια Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης και Ν-ακετυλομουραμικού οξέος Συνεχές περίβλημα γύρω από το πρωτόπλασμα Το πάχος του στρώματος αυτού παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των βακτηρίων Η παρατήρηση των βακτηρίων επιτυγχάνεται καλύτερα μετά από ξήρανση, μονιμοποίηση στην αντικειμενοφόρο πλάκα και χρώση με διάφορες χρωστικές

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Βοηθά στη διατήρηση του σχήματος των μικροβίων Προστατεύει την κυτταρική μεμβράνη από την υψηλή ωσμωτική πίεση του πρωτοπλάσματος Παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαίρεση Περιέχει αντιγόνα που διεγείρουν την παραγωγή αντισωμάτων στον ξενιστή

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (+) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Πεπτιδογλυκάνη ή μουρεΐνη Πολυσακχαριδικός σκελετός Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη Ν-ακετυλομουραμικό οξύ 50% του κυτταρικού τοιχώματος Καταστρέφεται από τη λυσοζύμη 12

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (+) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Τειχοϊκά οξέα: πολυμερείς ενώσεις φωσφορικής ριβιτόλης και γλυκερόλης Βρίσκονται στο κυτταρικό τοίχωμα και στην κυτταρική μεμβράνη Αντιδρούν με ειδικά αντισώματα έναντι των μικροβίων Με βάση την ύπαρξή τους ή όχι, τα μικρόβια διαχωρίζονται σε Gram (+) και Gram (-) 13

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (+) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (-) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης Λιποπρωτεΐνες Εξωτερική μεμβράνη (πορίνες) Λιποπολυσακχαρίτες(LPS) Δεν υπάρχουν τειχοϊκά οξέα 15

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (-) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

Διαφορές τοιχώματος Gram (+) Gram (-) Αποτελούνται από λεπτότερο στρώμα πεπτιδογλυκάνης 5- 10% Δεν έχουν τειχοϊκά οξέα Εξωτερικά από την πεπτιδογλυκάνη υπάρχουν τρεις αλλεπάλληλες στιβάδες: α) λιποπρωτεΐνης, β) εξωτερικής μεμβράνης γ) λιποπολυσακχαριτών (LPS) Αποτελούνται 50%-90% από πεπτιδογλυκάνη Έχουν τειχοïκά οξέα Έχουν πολυσακχαρίτες .

Διαφορές τοιχώματος Gram (+) Gram (-)

Ο Δανός ιατρός Christian Gram στα τέλη του 19ου αιώνα επινόησε μια χρώση, βασισμένη στη διαφορά της σύστασης του τοιχώματος των βακτηρίων Τα βακτήρια με το παχύ στρώμα πεπτιδογλυκάνης και τα τειχοϊκά οξέα βάφονται θετικά κατά Gram Τα βακτήρια με το λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης βάφονται αρνητικά κατά Gram

ΧΡΩΣΗ GRAM- ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Κρυσταλλικό ιώδες Lugol Αλκοόλη 95o Φαινικούχος φουξίνη ,σαφρανίνη ή ουδέτερο ερυθρό 20

ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΟ ΙΩΔΕΣ Κρυσταλλικό ιώδες 2g Αλκοόλη 95% 20 ml 21

LUGOL I2 1 g KI 10 g Απεσταγμένο νερό 100 mL 22

ΦΑΙΝΙΚΟΥΧΟΣ ΦΟΥΞΙΝΗ Βασική φουξίνη 1 g Αλκοόλη 95o 10 mL Διαλύεται η βασική φουξίνη στην αλκοόλη και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό προστίθεται στο φαινικό οξύ 23

ΚΛΑΣΙΚΗ ΧΡΩΣΗ GRAM – ΤΕΧΝΙΚΗ Επίστρωση, ξήρανση, μονιμοποίηση Κρυσταλλικό ιώδες 1’ Ξέπλυμα με νερό Lugol 1’ Αποχρωματισμός με αλκοόλη 95o Ξέπλυμα με άφθονο νερό Φαινικούχος φουξίνη 1’ Πλύσιμο με νερό Στέγνωμα, μικροσκόπηση με καταδυτικό φακό 24

ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ GRAM Με την εφαρμογή της πρώτης χρωστικής (κρυσταλλικό ιώδες) χρωματίζονται όλα τα βακτήρια Μετά το ξέπλυμα, φεύγει η περίσσεια της χρωστικής Με το Lugol μονιμοποιείται η πρώτη χρωστική επάνω στα βακτήρια 25

ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ GRAM 26

Χρώση Gram

Gram(+) βακτήρια Gram(-) βακτήρια

ΚΛΑΣΙΚΗ ΧΡΩΣΗ GRAM – ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ 29

Gram(+) θετικά βακτήρια Κόκκοι Σταφυλόκοκκος Στρεπτόκοκκος Πνευμονιόκοκκος Βακτηρίδια (Ραβδοειδή) μη σπορογόνα Κορυνοβακτηρίδιο Λιστέρια Βακτηρίδια (Ραβδοειδή) σπορογόνα Βάκιλλος Κλωστηρίδιο

Gram(-) αρνητικά βακτήρια Κόκκοι Ναϊσσέρια Βακτηρίδια (Ραβδοειδή) μη σπορογόνα Εντεροβακτηριακά Εσχερίχια Σαλμονέλλα Σιγκέλλα Κλεμπσιέλλα Πρωτέας Υερσίνια Μη εντερικά Ψευδομονάδες Βρουκέλλες Παστερέλλες Φρανσισέλλες Αιμόφιλος Μπορντετέλλες Δονάκια Σπειροχαιτιακά

ΣΦΑΛΜΑΤΑ Μη σωστή εφαρμογή της τεχνικής Η αλκοόλη δεν θα πρέπει να μείνει για περισσότερο από 30 sec, διότι τότε θα διαλύσει και τα τειχοϊκά οξέα των Gram (+) βακτηρίων, οπότε αυτά θα βαφούν κόκκινα με τη δεύτερη χρωστική Τα μικρόβια θα πρέπει να προέρχονται από πρόσφατες καλλιέργειες Σε αντίθετη περίπτωση, τα Gram (+) μικρόβια μπορεί να βαφούν κόκκινα, λόγω εκφύλισης των τειχοϊκών οξέων του κυτταρικού τους τοιχώματος 33

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN Χρησιμοποιείται για τη μικροσκόπηση μυκοβακτηριδίων ακτινομυκήτων της Nocardia spp ενδοσπορίων των βακτηρίων κύστεων ορισμένων πρωτοζώων (Cryptosporidium spp) Ονομάζεται οξεάντοχη Επινοήθηκε το 1882 από τους Franz Ziehl και Friedrich Neelsen

Οξεαντοχή είναι φυσική ιδιότητα μερικών μικροοργανισμών που αναφέρεται στην ανθεκτικότητά τους να μην αποχρωματίζονται κατά τη διαδικασία της χρώσης κατόπιν επεξεργασίας με ισχυρά οξέα

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN - ΑΡΧΗ Στο τοίχωμα των βακτηρίων αυτών, στο εξωτερικό του στρώματος της πεπτιδογλυκάνης βρίσκονται συνδεδεμένα τα μυκολικά οξέα β-Υδροξυ λιπαρά οξέα υψηλού μοριακού βάρους συνδεδεμένα με υδατάνθρακες Αποτελούν φραγμό για τις υδατικές χρωστικές ουσίες Όταν χρωματιστούν εν θερμώ με βασική χρωστική σχηματίζουν ένωση που δεν αποχρωματίζεται με ισχυρά οξέα

Κυτταρικό τοίχωμα Μυκοβακτηριδίων

ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Δείγματα ( πτύελα, βρογχικά, ούρα, Ε.Ν.Υ. και άλλα βιολογικά υγρά) Μέθοδος Petroff (πτύελα) Διάλυμα Α NaOH 4% Διάλυμα Β Πενικιλίνη + θειικό οξύ Τεχνική Μετάγγιση 3-4 ml κάθε δείγματος σε σωληνάριο Προσθήκη διαλύματος Α σε διπλάσια ποσότητα Ανακίνηση με Vortex Ρευστοποίηση του δείγματος Φυγοκέντρηση σε 3000 στρ για 20min Απόρριψη υπερκειμένου σε δοχείο με λυζοφορμίνη Επαναδιύληση του ιζήματος με 10 ml διαλύματος Β Καλή ανάδευση ιζήματος (Vortex),επίστρωση παρασκευασμάτων και εμβολιασμός θρεπτικών υλικών

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Φαινικούχος φουξίνη Οξινισμένη αλκοόλη 95o 3% Κυανό του μεθυλενίου

ΦΑΙΝΙΚΟΥΧΟΣ ΦΟΥΞΙΝΗ Βασική φουξίνη 1 g Αλκοόλη 95o 10 mL Διαλύεται η βασική φουξίνη στην αλκοόλη και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό προστίθεται στο φαινικό οξύ

ΟΞΙΝΙΣΜΕΝΗ ΑΛΚΟΟΛΗ 95o 3% Αλκοόλη 95o 97 mL HCl 3 mL

ΚΥΑΝΟ ΤΟΥ ΜΕΘΥΛΕΝΙΟΥ Μητρικό διάλυμα: Διάλυμα χρήσης: Κυανό του μεθυλενίου 1 g Αλκοόλη 10 mL Διάλυμα χρήσης: Μητρικό διάλυμα 30 mL KOH 10% 1 mL Απεσταγμένο νερό 100 mL Το KOH προστίθεται στο νερό (ΠΟΤΕ ΤΟ ΑΝΤΙΘΕΤΟ!!!) και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό προστίθεται στο μητρικό διάλυμα

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΤΕΧΝΙΚΗ Φαινικούχος φουξίνη σε ολόκληρη την πλάκα πάνω από φλόγα, μέχρι να βγουν ατμοί (όχι φυσσαλίδες) Αναμονή 2-3 min μετά την έκλυση των ατμών Να μην ξεραθεί η χρωστική επάνω στο παρασκεύασμα

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΤΕΧΝΙΚΗ Πλύσιμο με νερό Αποχρωματισμός με οξινισμένη αλκοόλη για 1-2 min Πλύσιμο με άφθονο νερό Κυανό του μεθυλενίου για 1-3 min Ξήρανση, μικροσκόπηση (τουλάχιστον 300 πεδία)

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΕΡΜΗΝΕΙΑ Η φαινικούχος φουξίνη βάφει όλα τα μικρόβια κόκκινα Η θερμότητα χρησιμοποιείται για να βοηθήσει τη χρωστική να εισέλθει στο κυτταρόπλασμα των μυκοβακτηριδίων Με την οξινισμένη αλκοόλη, αποχρωματίζονται όλα τα μικρόβια, εκτός από τα οξεάντοχα βακτηρίδια (οξεάντοχη χρώση) Με το κυανό του μεθυλενίου βάφονται μπλε τα υπόλοιπα μικρόβια που βρίσκονται στα υλικά

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΕΡΜΗΝΕΙΑ Το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης περιέχει μυκολικά οξέα στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτταρόπλασμα Τα οξέα αυτά εμποδίζουν τον αποχρωματισμό του από την οξινισμένη αλκοόλη, επειδή συνδέονται σταθερά με τη φαινικούχο φουξίνη

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Χρώση ZIEHL-NIELSEN ΑΜΕΣΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ

ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ

ΆΛΛΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ Αρνητική χρώση Χρώση σινικής μελάνης Χρωματίζεται το περιβάλλον, ενώ το μικρόβιο μένει αχρωμάτιστο Παίρνουμε πληροφορίες μόνο για το μέγεθος και το σχήμα των βακτηρίων

ΧΡΩΣΗ ΣΙΝΙΚΗΣ ΜΕΛΑΝΗΣ Σε αντικειμενοφόρο πλάκα, επιστρώνεται το παθολογικό υλικό, ξηραίνεται και μονιμοποιείται Προστίθεται μία σταγόνα σινικής μελάνης με τη βοήθεια καλυπτρίδας και ξηραίνεται στον αέρα Μικροσκοπείται με καταδυτικό φακό και μία σταγόνα κεδρέλαιο

ΧΡΩΣΗ ΣΙΝΙΚΗΣ ΜΕΛΑΝΗΣ – ΕΛΥΤΡΟ

ΧΡΩΣΗ ΣΙΝΙΚΗΣ ΜΕΛΑΝΗΣ – ΜΥΚΗΤΕΣ

Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας