Μέθοδος διάχυσης δίσκων αντιβιοτικών σε άγαρ Βασιλική Μάμαλη Βιοπαθολόγος, Επιμελήτρια Β΄ Μικροβιολογικού Τμήματος, Γενικού Νοσοκομείου Ελευσίνας << Θριάσιο >>

Bauer A.W., Kirby W.M.M., Sherris J.C. and Turck M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496

Αρχή μεθόδου διάχυσης αντιβιοτικού στο άγαρ Αρχή μεθόδου διάχυσης αντιβιοτικού στο άγαρ. Η συγκέντρωση του αντιβιοτικού μειώνεται όσο η απόσταση από το δισκίο αυξάνεται

Ερμηνεία βάσει πινάκων CLSI MIC Διάμετρος Ζώνης ευαίσθητο Μετρίως ευαίσθητο ανθεκτικό

Μέθοδος Kirby-Bauer Από τη θεωρία στη πράξη

Υλικά Kirby-Bauer Τρυβλία –θρεπτικό υλικό Απαραίτητα Θρεπτικός ζωμός (TSB-MHB) 0.9% NaCL Δίσκοι αντιβιοτικών Απαραίτητα Βαμβακοφόροι στυλεοί Κλίμακα McFarland 0.5 Τεχνικός εξοπλισμός Λαβίδα, διανεμητής Χάρακας, παχύμετρο, κάμερα Κινητός φωτισμός Vortex

Τρυβλία Διατηρούνται σε θερμοκρασία 2-8 ΟC Ομοιόμορφο πάχος θρεπτικού υλικού 4 mm Διατηρούνται σε θερμοκρασία 2-8 ΟC Χρησιμοποιούνται μέσα σε 7 ημ.-4 εβδομ. Πριν χρησιμοποιηθούν πρέπει να είναι στεγνά (κλίβανος Ο2 10-30 min) Ελέγχονται για στειρότητa

Καθοριστικός παράγων το πάχος του υλικού 4 mm Μεγάλες ζώνες Ζώνη αναστολής επιφάνεια 4 mm βάση Μεγάλες ζώνες <4 mm Μικρές ζώνες >4 mm

Θρεπτικό υλικό ▪ Μη απαιτητικά : MUELLER-HINTON άγαρ (στρεπτόκοκκοι, μηνιγγιτιδόκοκκος) Haemophilus test medium (αιμόφιλος) GC agar base + 1% supplement (γονόκοκκος)

Mueller-Hinton άγαρ Αποδεκτή επαναληψιμότητα Ικανοποιητική ανάπτυξη μη απαιτητικών βακτηρίων Χαμηλή περιεκτικότητα αναστολέων σουλφοναμίδης,τριμεθοπρίμης και τετρακυκλίνης Καλά μελετημένο

Αυξημένη συγκέντρωση θυμίνης ή θυμιδίνης : Mueller-Hinton άγαρ Αυξημένη συγκέντρωση θυμίνης ή θυμιδίνης : ψευδής αντοχή ή ασαφείς ζώνες αναστολής στις σουλφοναμίδες και τριμεθοπρίμη Έλεγχος παρτίδας Enterococcus faecalis ATCC® 29212 + SXT-TMP Enterococcus faecalis® ATCC 33186 Ικανοποιητικό υλικό =ζώνη αναστολής ≥ 20 mm

Mueller-Hinton άγαρ ▪Περίσσεια δισθενών κατιόντων μαγνησίου και ασβεστίου ελαττώνει τις ζώνες αναστολής σε αμινογλυκοσίδες και τετρακυκλίνη στην P.aeruginosa ▪Περίσσεια δισθενών κατιόντων ασβεστίου αυξάνει τις ζώνες αναστολής σε δαπτομυκίνη ▪Περίσσεια ιόντων ψευδαργύρου ελαττώνει τις ζώνες αναστολής σε καρβαπενέμες

pH: 7.2-7.4 σε θερμοκρασία δωματίου Mueller-Hinton άγαρ pH: 7.2-7.4 σε θερμοκρασία δωματίου pH‹7.2: αμινογλυκοσίδες,κινολόνες,μακρολίδες τετρακυκλίνες pH ›7.4: αμινογλυκοσίδες,κινολόνες,μακρολίδες Έλεγχος σε κάθε παρτίδα Κατά προτίμηση ηλεκτρόδιο επιφανείας

Προσοχή πάντα στην ημερομηνία λήξεως. Δίσκοι αντιβιοτικών διατηρούνται σε θερμοκρασία -14 έως 8 ΟC τα β-λακταμικά καταψύχονται 1-2 ώρες πριν χρησιμοποιηθούν φέρονται απαραίτητα σε θερμοκρασία δωματίου Προσοχή πάντα στην ημερομηνία λήξεως. αφυγραντικό

Διαδικασία Kirby-Bauer Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) Ενοφθαλμισμός θρεπτικού υλικού Τοποθέτηση αντιβιοτικών Επώαση Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Άμεσο εναιώρημα αποικίας Εναιώρημα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) 4-5 αποικίες, μεμονωμένες, παρόμοιας μορφολογίας Άμεσο εναιώρημα αποικίας 24ώρο καλλιέργημα από μη εκλεκτικό υλικό Εναιώρημα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης 1-2 ημερών από εκλεκτικό ή μη υλικό

Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) Άμεσο εναιώρημα αποικίας Όλα τα βακτήρια Αποκλειστικά και πάντα: Staphylococcus spp. Haemophilus spp. Streptococcus spp. N.meningitidis N.gonorrhoeae Εναιώρημα λογαριθμικής φάσης Εναλλακτικός τρόπος Μη απαιτητικά Εξαιρείται ο σταφυλόκοκκος

Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) Θολερότητα 0.5 κλίμακας McFarland ( 1-2 Χ 108 CFU/ml E.coli ATCC® 25922 ) ή με φωτόμετρο 0.5McF E.coli ATCC 25922

Απορρόφηση στα 625 nm =0.08-0.13 με κυβέττα 1 cm Κλίμακα McFarland 0.5 0.5 ml 0.048 mol/L BaCL2 + 99.5 ml 0.18 mol/LH2S04 (1.175% w/v BaCL2 •2H20) (1% v/v) Διαρκής ανάδευση Απορρόφηση στα 625 nm =0.08-0.13 με κυβέττα 1 cm Διατηρείται στο σκοτάδι Αναδεύεται σε vortex πριν τη χρήση Ελέγχεται κάθε μήνα

Inoculum size effect Inoculum 0.5 McF Αραιό inoculum

Ενοφθαλμισμός υλικού

Τοποθέτηση αντιβιοτικών Λαβίδα ή διανεμητής Απόσταση=24 mm (ή κατά περίπτωση) 16 δίσκοι/τρυβλία 120Χ120 mm 12 δίσκοι/τρυβλία 150 mm 5 δίσκοι/τρυβλία 100 mm Δεν μετακινούμε δισκίο που έχει τοποθετηθεί

Τοποθέτηση αντιβιοτικών αιμόφιλος, γονόκοκκος

Επιλογή αντιβιοτικών Προτεινόμενα από την επιτροπή CLSI Ανάλογα με το είδος του μικροβίου Ανάλογα με τη θέση της λοίμωξης

Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας Gram αρνητικών (Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά Πιπερακιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Τικαρκιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Αμοξυκιλλίνη+κλαβ. ή αμπικιλλίνη+σουλμπ. Πιπερακιλλίνη+ταζομπακτάμη Τικαρκιλλίνη+κλαβουλανικό Κεφοξιτίνη Κεφοταξίμη ή κεφτριαξόνη Κεφταζιδίμη Κεφεπίμη Αζτρεονάμη Ιμιπενέμη ή μεροπενέμη Ερταπενέμη Σιπροφλοξασίνη ή λεβοφλοξασίνη Κο-τριμοξαζόλη Αμικασίνη Νετιλμικίνη Τομπραμυκίνη Τετρακυκλίνη Χλωραμφαινικόλη (Α) Έλεγχος και αναφορά Αμπικιλλίνη Κεφαζολίνη Κεφουροξίμη Γενταμικίνη (Ο) Επιπλέον για τα ούρα Ναλιδιξικό οξύ Νορφλοξασίνη ή οφλοξασίνη Νιτροφουράνια Κο-τριμοξαζόλη

Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας σταφυλοκόκκων (Α) Έλεγχος και αναφορά Κεφοξιτίνη (30μg) ή Oxacillin (1 μg) Πενικιλλίνη (10 u) Ερυθρομυκίνη (15μg) Κλινδαμυκίνη (2μg) Φουσιδικό οξύ (10μg) Σουλφαμεθοξαζόλη-Τριμεθοπρίμη (1,25/23,75μg) (Ο) Επιπλέον για τα ούρα Νορφλοξασίνη (10μg) Νιτροφουραντοΐνη (300μg) (Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά Γενταμικίνη (10μg) Καναμυκίνη (30μg) Νετιλμικίνη (30μg) [Τομπραμυκίνη] (10μg) Βανκομυκίνη (30μg) Τεϊκοπλανίνη (30μg) Σιπροφλοξασίνη (5μg) Ριφαμπικίνη (5μg) Τετρακυκλίνη (30μg) Λινεζολίδη (30μg) Κινοπριστίνη/Δαλφοπριστίνη (15μg)

Συνθήκες επώασης Συνθήκες οξυγόνου, 35 OC Για τα μη απαιτητικά 35°Ο2 Συνθήκες οξυγόνου, 35 OC Για τα μη απαιτητικά Συνθήκες 5% CO2, 35 ΟC : Haemophilus influenzae H.parainfluenzae S. pneumoniae, Streptococcus spp. Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae 35°C CO2

Χρόνος επώασης 16-18 ώρες 20-24 ώρες Streptococcus spp. N. gonorrhoeae / N. meningitidis Acinetobacter spp B. cepacia S. maltophilia 24 ώρες σταφυλόκοκκος (οξακιλλίνη ) εντερόκοκκος/σταφυλόκοκκος (βανκομυκίνη) στελέχη P.aeruginosa κυστικής ίνωσης

Διαδικασία Kirby-Bauer Επίστρωση 0.5 McF 30 min < 15 min 4°C 1-2ώρες 5-15min 15 min 35°Ο2 35°C CO2

Ανάγνωση αποτελεσμάτων Μέτρηση διαμέτρων •Χάρακας ή παχύμετρο βανκομυκίνη) ή κάμερα

Ανάγνωση αποτελεσμάτων •Προσπίπτων φωτισμός Πίσω πλευρά τρυβλίου Επιφάνεια αιματούχου υλικού

Οξακιλλίνη (σταφυλόκοκκος) Βανκομυκίνη (σταφυλόκοκκος, Ανάγνωση αποτελεσμάτων •Διελαύνων φωτισμός Οξακιλλίνη (σταφυλόκοκκος) Βανκομυκίνη (σταφυλόκοκκος, εντερόκοκκος)

Ερπυσμός σε Proteus spp. Ανάγνωση αποτελεσμάτων Μεμονωμένες αποικίες μέσα στη ζώνη αναστολής Μικτό καλλιέργημα ή Ανθεκτικοί μεταλλάκτες Ψιλή ανάπτυξη σε TMP-SXT Αγνοείστε εάν ≤ 20% Ερπυσμός σε Proteus spp. Αγνοείστε τον

Ερπυσμός Proteus spp.

Αναφορά αποτελεσμάτων Σταφυλόκοκκοι ανθεκτικοί σε οξακιλλίνη ή κεφοξιτίνη Ανθεκτικοί σε όλα τα β-λακταμικά Ανθεκτικά σε Πενικιλλίνες, Κεφαλοσπορίνες, Αζτρεονάμη Εξαιρείται η κεφοξιτίνη E.coli, K. pneumoniae K. oxytoca, P.mirabilis που παράγουν ESBLs

Αναφορά αποτελεσμάτων Κεφαλοσπορίνες 1ης-2ης Κεφαμυκίνες Αμινογλυκοσίδες Salmonella spp., Shigella spp. Κεφαλοσπορίνες, Κλινδαμυκίνη, TMP-SXT, Αμινογλυκοσίδες Enterococcus spp.

Πλεονεκτήματα Kirby-Bauer Είναι τεχνικά απλή. Έχει μεγάλη επαναληψιμότητα. Είναι σχετικά φθηνή. Δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό. Προσφέρει μεγάλη ευελιξία στην επιλογή αντιβιοτικών. Τα αποτελέσματά της (ευαίσθητο, μετρίως ευαίσθητο, ανθεκτικό) είναι ευρέως κατανοητά από τους γιατρούς όλων των ειδικοτήτων. Δύναται να αναδείξει μηχανισμούς αντοχής.

Ευρέως φάσματος β-λακταμάσες ESBLs ATM AMC CAZ

Δίκην «φελλού σαμπάνιας ή κλειδαρότρυπας» Amoxicillin + Clavulanic acid Ceftazidime Aztreonam ESBL NON-ESBL

Επαγώγιμη αντοχή στη κλινδαμυκίνη Ε CM

Περιορισμοί Kirby-Bauer Είναι προτυποποιημένη μόνο για ορισμένα βακτήρια Enterobacteriaceae P. aeruginosa Acinetobacter spp. Burkholderia cepacia (2006) Stenotrophomonas maltophilia (2006) Staphylococcus spp. Enterococcus spp. H.influenzae and H. parainfluenzae N. gonorrhoeae S.pneumoniae Streptococcus spp. other than S. pneumoniae Vibrio cholerae N. meningitidis (2006) Απαιτείται αυστηρή εφαρμογή του πρωτοκόλλου Ενίοτε απαιτείται MIC

Πότε απαιτείται MIC Μηνιγγίτιδα,ενδοκαρδίτιδα,οστεομυελίτιδα Staphylococcus spp. (βανκομυκίνη ≤14 mm) Enterococcus spp (βανκομυκίνη 15-16mm, γενταμυκίνη 120 μg 7-9mm) Viridans Streptococci (λοιμώξεις από στείρες περιοχές)* S. Pneumoniae (οξακιλλίνη 1 μg ≤19 mm λοιμώξεις ΕΝΥ* ) Ν.meningitidis (αμπικιλλίνη,πενικιλλίνη)* Όσα χαρακτηρίζονται ως «μη ευαίσθητα»

Αξιολόγηση Kirby-Bauer Ωφέλιμος στόχος Θεραπεία ασθενούς Επιδημιολογική επιτήρηση

Διαρκής ενημέρωση (CLSI) Τεστ ευαισθησίας (AST) (antimicrobial susceptibility testing) Διαρκής ενημέρωση (CLSI) Έλεγχος ποιότητας ( quality control ) αξιοπιστία ακρίβεια επαναληψιμότητα

Ρόλος Βιοπαθολόγου