The genomic era: Past, Present and Future Εμβιομηχανική και Βιοϊατρική Τεχνολογία Ακαδημαϊκό Έτος 2013-2014 The genomic era: Past, Present and Future Μέλη ομάδας: Βασιλόπουλος Βασίλειος Καναβάρης Βασίλειος Υπεύθυνος καθηγητής: Λ. Αλεξόπουλος

Ιστορική Αναδρομή (1) Λήξη του Β’ Παγκοσμίου Πολέμου: Χρήση ραδιοϊσοτόπων για την αποσαφήνιση της μεταβολικής διεργασίας (Roberts et al.) Καθιέρωση Ε. Coli ως οργανισμού – πρότυπο για βιολογικές μελέτες Αναγνώριση ενζύμων και διαδικασιών εμπλεκόμενων με την σύνθεση μεταβολιτών Γύρω στο 1950: Πλήρης ορισμός βιοσυνθετικών διεργασιών για την ανάπτυξη βιολογικών μακρομορίων (π.χ πρωτεϊνες) Ανακάλυψη μηχανισμών για την ρύθμιση του μεταβολισμού (π.χ μελέτη της δραστηριότητας των ενζύμων)

Ιστορική Αναδρομή (2) 1955: Περιγραφή της δομής της έλικας του DNA από τους Watson και Crick Ανακάλυψη μηχανισμών αντιγραφής του DNA και σύνθεσης πρωτεϊνών 1961: Θεμελίωση βασικών μηχανισμών γονιδιακής έκφρασης (Jacob – Monod) Ανακάλυψη ενζύμων ικανών να κόβουν και να συνδέουν DNA (Nathans και Smith)

Ιστορική Αναδρομή (3) 1972: Ανάπτυξη του πρώτου εργαστηριακού ζωικού ιού από τον Paul Berg στο Stanford U. 1972 – 1984: Ανάπτυξη μεθόδων αλυσωτής αντίδρασης πολυμερισμού (PCR – Polymerase Chain Reaction) Εμφάνιση μεθοδολογιών DNA Sequencing: Χρήση των τεχνολογιών PCR για την προσθήκη ποσοτήτων DNA σε αρχικές ποσότητες γενετικού υλικού

Ιστορική Αναδρομή (4) 1984 - 1986: Χαρτογράφηση γονιδιωμάτων διάφορων μικροβίων και βακτηριοφάγων Πρωτοβουλία για την υλοποίηση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος (Santa Fe του New Mexico) 1988 - 1989: Μελέτη με τίτλο «Χαρτογράφηση και Αποτύπωση του Ανθρώπινου Γονιδιώματος» Ίδρυση Εθνικού Κέντρου Ερευνών Ανθρώπινου Γονιδιώματος στην Αμερική

Ιστορική Αναδρομή (5) 1991: Ανάπτυξη μεθόδου για εύρεση γονιδίων χωρίς την απαίτηση μέτρησης ολόκληρου του γονιδιώματος (Craig Venter): Στήριξη στην έκφραση των γονιδίων μέσω του mRNA και κατασκευή συμπληρωματικού DNA (cDNA) 1991-1995: Απομόνωση πάνω από 170.000 τμημάτων cDNA και αναγνώριση περίπου των μισών γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος

Ιστορική Αναδρομή (6) 1998: Human Genome Program: Ανακοίνωση πλάνου για ολοκλήρωση της αποτύπωσης του ανθρώπινου DNA ως το 2003 Βασικοί στόχοι: α) Κάλυψη 90% του γονιδιώματος, β) Ελεύθερη πρόσβαση στις βάσεις δεδομένων από όλους 26 Ιουνίου 2000: Συνάντηση των Collins και Venter με τον πρόεδρο Clinton Ολοκλήρωση του προγράμματος 3 χρόνια πριν το αναμενόμενο – Δημοσίευση στο «Science and Nature» το 2001

Βασική μέθοδος DNA Sequencing Fragmentation: Σπάσιμο του γονιδιώματος σε δείγματα λίγων εκατοντάδων βάσεων Isolation: Προσεκτική λήψη των δειγμάτων ώστε να διατηρούν το σήμα τους Amplification: Ενίσχυση του σήματος για αύξηση της ακρίβειας των μετρήσεων Readout: Μετατροπή του σήματος των βάσεων σε μορφή που διαβάζεται από μηχανή (συνήθως σε οπτικό σήμα) π.χ Illumina Genome Analyzer – Hiseq Systems

Fragmentation – Isolation Κόψιμο δείγματος DNA σε τμήματα περίπου 400 ζευγών βάσεων Προσκόλληση ολιγονουκλεοτιδίων (μικρού μήκους νουκλεϊκά οξέα) στα άκρα – «λαβές» για κάθε δείγμα Εισαγωγή του δείγματος σε κύτταρο ροής με «τάπητα» από ολιγονουκλεοτίδια Παγίδευση του δείγματος στο κύτταρο ροής λόγω συνδέσεων των προσαρμογέων από ολιγονουκλεοτίδια Προσκόλληση κάθε αλυσίδας DNA σε συγκεκριμένη θέση ώστε να επιτευχθεί isolation

Amplification Χρήση της αλυσωτής αντίδρασης πολυμερισμού (PCR) για ενίσχυση του σήματος Εξέλιξη κάθε τμήματος DNA σε cluster από χιλιάδες ταυτόσημα αντίγραφα της συγκεκριμένης αλυσίδας Δημιουργία εκατομμυρίων ανεξάρτητων ομάδων στο κύτταρο ροής

Readout Σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας από «χρωματισμένα» νουκλεοτίδια A,T,G,C Απεικόνιση του κυττάρου μετά την ενσωμάτωση κάθε νουκλεοτιδίου Διαφορετικός χρωματισμός κάθε cluster ανάλογα με το νουκλεοτίδιο που ενσωματώθηκε Επανάληψη του κύκλου readout – κάθε νουκλεοτίδιο που προστίθεται διαθέτει «τερματικό»

DNA Sequencing cost

Next Generation Sequencing-NGS (1) Παραγωγή τεράστιων ποσοτήτων δεδομένων σε λίγο χρόνο: Επέκταση δυνατοτήτων: Αύξηση του αριθμού των αντιδράσεων ανά δείγμα DNA Δημιουργία εκατοντάδων Gb (gigabases) δεδομένων με ένα και μόνο τρέξιμο 1000 φορές περισσότερα δεδομένα σε σχέση με την απλή διαδικασία DNA Sequencing Μέτρηση 5 ανθρώπινων γονιδιωμάτων σε μια βδομάδα με λιγότερο από 5000$.

Next Generation Sequencing-NGS (2) Multiplexing: Δυνατότητα μέτρησης πολλών δειγμάτων σε ένα πείραμα με χρήση barcodes Εκτίμηση της δραστηριότητας του RNA με μεγαλύτερη ακρίβεια Ρυθμιζόμενη ανάλυση: Ρύθμιση overlap (αριθμός αναγνώσεων για την μέτρηση κάθε βάσης) ανάλογα με τις ανάγκες σε ακρίβεια

Next Generation Sequencing-NGS (3) Whole-Genome Sequencing: Παροχή δυνατότητας μέτρησης ολόκληρου του γονιδιώματος ενός οργανισμού σε ελάχιστο χρονικό διάστημα (εφαρμογή σε μεγάλης κλίμακας γονιδιώματα, όπως τα ανθρώπινα, αλλά και σε μικρά γονιδιώματα βακτηρίων και ιών) Targeted Sequencing: Μέτρηση μόνο συγκεκριμένων περιοχών στο γονιδίωμα Ωφέλεια σε κόστος και χρόνο Δυνατότητα ταυτοποίησης γενετικής διαφοροποίησης Δυνατότητα ανίχνευσης γενετικών μεταβλητών που χάνονται με την παραδοσιακή μέθοδο DNA Sequencing

NGS μέθοδοι Polony Sequencing Illumina Sequencing SOLID Sequencing DNA nanoball sequencing Helioscope single molecule sequencing Nanopore DNA sequencing

Τύποι γονιδιωματικών ομάδων δεδομένων (1) Sequence Variation Data: Γενετικές διαφοροποιήσεις όπως εκδηλώνονται στην αλληλουχία αμινοξέων των πρωτεϊνών Προσεγγίσεις για την ταξινόμηση των γενετικών διαφοροποιήσεων: SNP Genotyping Arrays: Χρήση συγκεκριμένης αλληλουχίας βάσεων (SNP array) Resequencing: Σύγκριση με «πρότυπο» γονιδίωμα

Τύποι γονιδιωματικών ομάδων δεδομένων (2) Transcriptomic Data: Δεδομένα που σχετίζονται με την μετατροπή του DNA σε RNA Αναγνώριση: α) πρόωροι ή μεταγενέστεροι τερματισμοί της αλληλουχίας αμινοξέων, β) συγχώνευση γονιδίων, γ) τάξεις RNA που δεν μετατρέπονται σε πρωτεϊνες Epigenomic data: Πληροφορίες σχετικά με τις επιγενετικές τροποποιήσεις (αλλαγές στο DNA που επηρεάζουν την δομή των πρωτεϊνών) Interactome data: Μελέτη αλληλεπίδρασης DNA- πρωτεϊνών, RNA- πρωτεϊνών, πρωτεϊνών- πρωτεϊνών.

Προγράμματα συνεργασίας Προγράμματα ανάλυσης και συνδυασμού δεδομένων: Roadmap Epigenomics Project ENCODE Project Cancer Genome Atlas Προγράμματα δημιουργίας επι-γονιδιωματικών χαρτών (τόσο για τον άνθρωπο όσο και για άλλους οργανισμούς) – αποτύπωσης ρυθμιστικών για τον μεταβολισμό στοιχείων: Roadmap Epigenome Consortium ENCODE Consortium (χαρτογράφηση πρωτεϊνικών τροποποιήσεων) ModENCODE Consortium (για Drosophila και σκουλήκια) ENCODE project (για ποντίκια) Online εργαλεία για συνδυαστική ανάλυση: Galaxy, DAVID κλπ.

Προβλήματα στην εφαρμογή των genomics Για τον επιστήμονα: Καταιγισμός δεδομένων Ελλιπή εργαλεία συνδυαστικής ανάλυσης Δυσχέρεια στην ανίχνευση γονιδιωματικών δεδομένων καλής ποιότητας (χρήση Genome Browsers όπως ο Entrez Genome για αυτόν τον λόγο) Βιο-πληροφοριακά (bio-informative) εμπόδια: Προβλήματα στην διαχείριση των αποτελεσμάτων μεθόδων NGS

Μελλοντικές προοπτικές (1) Βελτίωση της ακρίβειας των διαγνώσεων: Βελτίωση αξιοπιστίας μετρήσεων ακόμα και από πολύ μικρό δείγμα DNA Δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για ασθένειες από δείγματα FFPE (αποθηκευμένα σε βιβλιοθήκες τμήματα DNA ιστών) τα οποία σήμερα υφίστανται σημαντική αλλοίωση, λόγω προετοιμασίας, χρωματισμού και αποθήκευσης Μείωση της ευαισθησίας του δείγματος σε θόρυβο: Εισαγωγή θορύβου λόγω π.χ του εδάφους, του θαλασσινού νερού ή του ανθρώπινου εντέρου

Μελλοντικές προοπτικές (2) Περαιτέρω μείωση του κόστους: Το κόστος ανάλυσης ενός γονιδιώματος σε λίγα χρόνια αναμένεται να γίνει ίσο με το σημερινό κόστος ανάλυσης ενός μόνο γονιδίου Ανάπτυξη γονιδιακών φαρμάκων με συνεισφορά: στην φαρμακευτική μέσω μείωσης των χρόνων έρευνας και έγκρισης νέων φαρμάκων στην γεωργία στην διάγνωση και θεραπεία ασθενειών όπως ο καρκίνος

Προκλήσεις Τεχνικές προκλήσεις: Μείωση του χρόνου προετοιμασίας του δείγματος για εισαγωγή στην εκάστοτε μηχανή Μεταφορά των αποτελεσμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης από τοπικούς υπολογιστές σε cloud Μη τεχνικές προκλήσεις – Ηθικά διλήμματα: Θα έπρεπε ασφαλιστικές εταιρίες να έχουν πρόσβαση σε γονιδιωματικές πληροφορίες; Τι επίδραση θα έχει η διάγνωση ότι ένα άτομο είναι πολύ πιθανό να εμφανίσει κάποια ασθένεια στο μέλλον στο ίδιο το άτομο και στην οικογένειά του; Germline Therapy (εισαγωγή συγκεκριμένων γενετικών χαρακτηριστικών π.χ σε αυγά) – Ποιος αποφασίζει ποια γενετικά χαρακτηριστικά είναι επιθυμητά και ποια όχι;

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ

Σας ευχαριστούμε!