5.Μοριακές τεχνικές στη διάγνωση των λοιμώξεων Βασιλική Κουμάκη-Κωστάκη Λέκτορας Μικροβιολογίας Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ

Κλινικό περιστατικό 1 Ασθενής προερχόμενος από την Κίνα προσέρχεται στο εξωτερικό ιατρείο με τα εξής συμπτώματα Βήχα, αιματηρά πτύελα, κακουχία, εύκολη κόπωση, νυχτερινή εφίδρωση, πλευριτικός πόνος Υποψία φυματίωσης Μέθοδος διάγνωσης αναφοράς (Golden standard) καλλιέργεια σε υλικό Lowestein-Jenssen με χρόνο επώασης περίπου 21 μέρες. Τι εναλλακτική μέθοδο διάγνωσης προτείνεται?

Ευαισθησία (sensitivity)% % ατόμων με τη νόσο που βρίσκονται θετικά με τη συγκεκριμένη δοκιμή Αριθμός θετικών απαντήσεων σε 100 ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο ευαισθησία ψευδώς αρνητικά

Ειδικότητα (specificity)% % ατόμων χωρίς τη νόσο που βρίσκονται αρνητικά με τη συγκεκριμένη δοκιμή Αριθμός αρνητικών απαντήσεων σε 100 ασθενείς που δεν πάσχουν από τη νόσο ειδικότητα ψευδώς θετικά

Διαγνωστικές μέθοδοι μιας λοίμωξης Άμεση μικροσκόπηση Καλλιέργεια Ορολογικές δοκιμασίες Μοριακές τεχνικές

Εγγενείς αδυναμίες των μοριακών διαγνωστικών μεθόδων Δεν προσδιορίζουν αν το ανιχνεύσιμο μικροβιακό γενετικό υλικό προέρχεται από ζωντανά η νεκρά μικροβιακά κύτταρα (όταν ανιχνεύεται μικροβιακό DNA) Δεν προσδιορίζουν αν το μικρόβιο του οποίου το γενετικό υλικό ανιχνεύεται, είναι και το αίτιο της λοίμωξης

Αντίθετα Οι καλλιεργητικές μέθοδοι εξασφαλίζουν την βιωσιμότητα του μικροβιακού παράγοντα (αφού μόνο ζωντανά κύτταρα του μικροβίου που υπάρχουν στο κλινικό δείγμα είναι δυνατό να καλλιεργηθούν) Οι ορολογικές και ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι εξασφαλίζουν τη συμμετοχή του μικροβιακού παράγοντα στη λοίμωξη (αφού προσδιορίζονται ειδικά IgG ή/και IgM αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου μικροβιακού παράγοντα)

Ταυτοποίηση Η εργαστηριακή διάγνωση λοιμώξεων βασίζεται στην πιστοποίηση παρουσίας μικροβίων ή μεταβολικών προϊόντων τους στο σημείο της λοίμωξης ή στον οργανισμό γενικότερα Η τυποποίηση (ταυτοποίηση) των παθογόνων μικροοργανισμών επιτυγχάνεται με μεθόδους Α)Μικροβιολογικές Β) Μοριακές

Μικροβιολογικές μέθοδοι Στηρίζονται σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του μικροβίου, όπως Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Βιοχημικές ιδιότητες Παραγωγή ενζύμων Ευαισθησία στα αντιβιοτικά

Μοριακές μέθοδοι Στηρίζονται σε γονοτυπικά χαρακτηριστικά του μικροβίου Μικροβιακό DNA ή RNA στο κλινικό δείγμα Συγκεκριμένα γονίδια (π.χ. παραγωγής τοξίνης)

Εφαρμογές της PCR στην κλινική μικροβιολογία Διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες ο αριθμός των μικροβίων είναι μικρός Μηνιγγίτιδα Χρονία λοίμωξη με Trypanosoma crusi Ανίχνευση λοιμογόνων παραγόντων που καλλιεργούνται δύσκολα ή καθόλου Μυκοβακτηρίδια Treponema pallidum Ehrilichia chaffeensis (αίτιο της ανθρώπινης ερλιχίωσης) Rochalimaea quintana (ρικέτσια, αίτιο της βακτηριακής αγγειωμάτωσης) Αντικατάσταση τεχνικών άμεσου ανοσοφθορισμού ή χρονοβόρων ορολογικών δοκιμασιών Borrelia burgdorferi (αίτιο της νόσου Lyme)

Εφαρμογές της PCR στην κλινική μικροβιολογία Ανίχνευση γονιδίων αντοχής στα αντιβιοτικά Εργαστηριακή διάγνωση ιογενών λοιμώξεων Μελέτη της φυσικής ιστορίας λοιμωδών νοσημάτων Όρια μεταγραφής και μετάφρασης του DNA που απαιτούνται για την κλινική εκδήλωση της λοίμωξης Τυποποίηση και ταξινόμηση μικροβίων με βάση γενετικούς δείκτες Αντικατάσταση κλασσικών μεθόδων εργαστηριακής διάγνωσης κατά περίπτωση

Ορισμοί DNA = δυο δεξιόστροφες αντιπαράλληλες πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες (διπλή έλικα) Η σύνδεση των δύο ελίκων γίνεται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ: A=T & C=G συμπληρωματικές βάσεις → κάθε έλικα του DNA είναι συμπληρωματική της άλλης Μετουσίωση του DNA = διαχωρισμός των δυο ελίκων με Φυσικούς (π.χ θερμοκρασία) Χημικούς ( π.χ NaOH)

Ορισμοί cDNA = μονόκλωνο DNA (συμπληρωματικό) Υβριδισμός του DNA = συνένωση των δυο συμπληρωματικών ελίκων Περιοριστική ενδονουκλεάση = ένζυμο που «κόβει» σε κομμάτια το δίκλωνο DNA αναγνωρίζοντας συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων π.χ. EcoR1 GAATTC CTTAAG Ανιχνευτής νουκλεϊνικού οξέος η ιχνηλάτης(probe) = ένα φυσικό ή τεχνητό κομμάτι δίκλωνου η μονόκλωνου DNA η RNA που έχει σημανθεί με ένζυμο, φθορίζουσα ουσία, αντιγονικό υπόστρωμα, ρασιοϊσότοπα, χημική ομάδα χημειοφωταύγειας Μέγεθος = 20-2500 bp Τεχνητός ανιχνευτής μεγέθους<50bp = “ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής”

Ορισμοί DNA πολυμεράση = ένζυμο που καταλύει την αντιγραφή του DNA Θερμοανθεκτική (Taq) διατηρεί τη βιολογική της δράση σε υψηλές (π.χ 72oC) θερμοκρασίες Η δράση τους εξαρτάται από τη συγκέντρωση ιόντων MgCI2 ή MnCI2 ή MgSO4 Εναρκτήριος ανιχνευτής- οδηγός νουκλεϊνικού οξέος ή εκκινητής (primer) = ένα μικρό κομμάτι RNA ή μονόκλωνου DNA (5΄→3΄) που ενώνεται με το “άκρο” της μητρικής DNA αλυσίδας και -παρουσία της DNA πολυμεράσης-αρχίζει τη σύνθεση της νέας, συμπληρωματικής αλυσίδας Ανάστροφη τρανσκριπτάση (RT) = ένζυμο που καταλύει την αντιγραφή του RNA σε cDNA (μονόκλωνο)

Βασικές τεχνικές Ειδική πέψη του DNA από περιοριστικές ενδονουκλεάσες (digestion) Κλωνοποίηση του DNA (cloning) = ένα ειδικό τμήμα του DNA ενσωματώνεται σε ένα ταχέως αντιγραφόμενο γενετικό συστατικό (πλασμίδιο ή ιό) με αποτέλεσμα τη σταθερή επαγωγή του σε κύτταρα βακτηρίων η μυκήτων Υβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων (hybridization) = καθιστά δυνατό να ταυτοποιηθούν ειδικές αλληλουχίες του DNA με μεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία λόγω της ικανότητας τους να προσδένονται σε συμπληρωματικές αλληλουχίες νουκλεϊκού οξέος Καθορισμός της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων ενός τμήματος DNA (sequencing)

Εργαστηριακές εφαρμογές των τεχνικών ανασυνδυασμού και κλωνοποίησης του DNA Ανίχνευση και προσδιορισμός γονιδίων που ενέχονται σε νεοπλασματικές και κληρονομικές ασθένειες π.χ. χρόνια μυελογενής λευχαιμία, κυστική ίνωση Προγεννητικός έλεγχος και διάγνωση κληρονομικών παθήσεων π.χ. φαινυλκετονουρία Προσδιορισμός της γενετικής προδιάθεσης για ασθένειες π.χ. σακχαρώδης διαβήτης, αθηροσκλήρωση Ακριβής διάγνωση και σταδιοποίηση νεοπλασματικών καταστάσεων Πρόγνωση της εξέλιξης και θεραπευτικός έλεγχος στους καρκινοπαθείς Διάγνωση λοιμώξεων Προσδιορισμός της ευαισθησίας ή της αντοχής σε χημειοθεραπευτικά π.χ. νεοπλασματικές ασθένειες, λοιμώξεις έλεγχος ιστοσυμβατότητας πριν τις μεταμοσχεύσεις Έλεγχος πατρότητας Ιατροδικαστικοί προσδιορισμοί

Εργαστηριακές εφαρμογές των τεχνικών ανασυνδυασμού και κλωνοποίησης του DNA στη διάγνωση των λοιμώξεων Οι μοριακές διαγνωστικές μέθοδοι διακρίνονται σε Μη πολλαπλασιαστικές (συμβατικές) του μικροβιακού γενετικού υλικού ανιχνεύεται το DNA ή το RNA του μικροβίου με τη βοήθεια σημασμένων ανιχνευτών Πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού ανιχνεύεται το DNA ή το RNA του μικροβίου, αφού πρώτα αντιγραφεί in vitro σε vx106 αντίγραφα Ποιοτικές (end-point) Ποσοτικές (κυρίως με τη χρήση σεσημασμένων ιχνηλατών (probes) του DNA

Ι. Μέθοδοι μη πολλαπλασιαστικές (συμβατικές) του μικροβιακού γενετικού υλικού

Υβριδισμός σταθερής φάσης Αρχή: Παραλαβή DNA ή RNA από μικροβιακά κύτταρα → («κοπή» του DNA σε πολλαπλά, μικρά κομμάτια με τη βοήθεια περιοριστικών ενδονουκλεασών) → (διαχωρισμός τμημάτων κατά τάξη μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης) → (κατεργασία πηκτής με NaOH για μετουσίωση του DNA) ακινητοποίηση (καθήλωση) τμημάτων DNA ή RNA σε στερεό υπόστρωμα (φίλτρο nylon ή νιτροκυτταρίνη) → υβριδισμός με σεσημασμένο DNA - ανιχνευτή απομάκρυνση (με πλύσιμο) μονόκλωνων DNA ανίχνευση των σεσημασμένων διμερών κατά περίπτωση σήμανσης

Υβριδισμός σταθερής φάσης Τρόποι σήμανσης και τελικής ανίχνευσης του DNA - ανιχνευτή (probe) : Με ραδιενεργά ισότοπα (P32)→αυτοραδιογραφία ή μετρητής β ή γ ακτινοβολίας Με βιοτίνη → αβιδίνη+υπεροξειδάση → διαμινοβενζιδίνη → χρώμα (φωτομέτρηση) Με διγοξιγενίνη → Ab + αλκαλική φωσφατάση → άλας τετραζολίου, ινδοξυ-φωσφορικό → χρώμα (φωτομέτρηση) Με φθοριοχρώματα

Southern blot Αν πρόκειται για DNA Southern Blot Αν πρόκειται για RNA Northern Blot

Παραλλαγές βασικής μεθόδου Υβριδισμός αποτυπωμένης κουκκίδας (dotblot) ή κηλίδας (spotblot) Υβριδισμός βακτηριακών αποικιών (colony hybridization) Υβριδισμός sandwich

Υβριδισμός αποτυπωμένης κουκκίδας (dotblot) ή κηλίδας (spotblot) μέθοδος: Λύση κυττάρων → μετουσίωση DNA → μεταφορά και ακινητοποίηση σε φίλτρο nylon → υβριδισμός → ανίχνευση των σεσημασμένων διμερών κατά περίπτωση σήμανσης χρήση: Δοκιμασία screening και τυποποίηση HPV ίων

Υβριδισμός βακτηριακών αποικιών (colony hybridization) Ο υβριδισμός γίνεται κατευθείαν σε αποικίες βακτηρίων μέθοδος: Λύση μικροβίων → μετουσίωση DNA → μεταφορά και ακινητοποίηση σε φίλτρο nylon → υβριδισμός → ανίχνευση των σεσημασμένων διμερών κατά περίπτωση σήμανσης πλεονέκτημα: Ταυτόχρονη εξέταση πολλών DNA

Υβριδισμός sandwich μέθοδος: Χρησιμοποιούνται δυο διαφορετικοί DNA - ανιχνευτές, που συνδέονται σε διαφορετικά τμήματα του DNA-στόχου: Ένας βρίσκεται προσκολλημένος στο φίλτρο nylon Ένας (σεσημασμένος) χρησιμεύει σαν «προσδιοριστής» Πλεονέκτημα : μεγαλύτερη ευαισθησία

Υβριδισμός υγρής φάσης αρχή: Το DNA - στόχος και ο σεσημασμένος DNA - ανιχνευτής αφήνονται να αντιδράσουν σε υδατικό διάλυμα → υβριδισμός → απομάκρυνση των μονόκλωνων DNA-ανιχνευτών είτε με πέψη (S1 νουκλεάση ή υδρολύει μονόκλωνα DNA) είτε με ειδική απορρόφηση του δίκλωνου (υβριδισμένου) DNA από στήλες υδροξυαπατίτη → μέτρηση του σήματος υβριδισμού Ποσοτική μέθοδος Γρήγορη μέθοδος Ο DNA-ανιχνευτής πρέπει να είναι μικρό μονόκλωνο DNA, που δεν αυτοϋβριδίζεται εφαρμογή: ποσοτικός προσδιορισμός του DNA του ιού ηπατίτιδας B (HBV) στον ορό με τη χρήση 125I-σεσημασμένου DNA-ανιχνευτή → χρόνιοι φορείς υπό αντιιϊκή αγωγή → εκτίμηση θεραπευτικού αποτελέσματος

Υβριδισμός in situ (ISH) αρχή: ο υβριδισμός γίνεται απευθείας στο βιολογικό υλικό (μολυσμένος ιστός) προϋπόθεση: προσέγγιση του γενετικού υλικού του μικροβίου χωρίς καταστροφή της ανατομικής μορφολογίας των ιστών πλεονεκτήματα: σε συνάρτηση με τη κυτταρολογική εικόνα των ιστών και τη κλινική εικόνα του ασθενούς: Το μικρόβιο - στόχος συμμετέχει στη λοίμωξη Διασπορά και ποσότητα του μικροβίου-στόχου

ΙΙ. Μέθοδοι Πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η PCR επέτρεψε την παραγωγή ενός πολύ μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας συγκεκριμένης και προκαθορισμένης αλληλουχίας DNA Η PCR χρησιμοποιεί τις θεμελιώδεις βιοχημικές αρχές της αντιγραφής του DNA και αποτελεί μέθοδο in vitro πολλαπλασιασμού μιας προκαθορισμένης και γνωστής αλληλουχίας DNA Η μέθοδος βασίζεται στην ενζυματική επιμήκυνση «εκκινητών» (primers) που υβριδίζονται σε αντίστοιχα σημεία του υπό ανίχνευση DNA και επιμηκύνονται με τη βοήθεια της DNA πολυμεράσης, χρησιμοποιώντας σα «μήτρα» την υπό μελέτη αλληλουχία Στη πράξη μετά από 30 έως 35 θερμικούς κύκλους ,η αλληλουχία που περικλείεται από τους δυο «εκκινητές», έχει πολλαπλασιαστεί περίπου 106 φορές Μειονέκτημα εργαστηριακής εφαρμογής: Επιμολύνσεις από εξωγενές, ομόλογο DNA

PCR In-house μέθοδοι Εμπορικά Kit

Παραλλαγές PCR Nested PCR Multiplex PCR RT-PCR (πολλαπλασιασμός του RNA) RT-PCR πραγματικού χρόνου (Real-time PCR)

Nested PCR αρχή: Χρησιμοποιούνται δυο ζεύγη primers → το 2ο πολλαπλασιάζει τμήμα του DNA που προέρχεται από πολλαπλασιασμό του DNA - στόχου από το 1ο ζεύγος πλεονέκτημα: Αυξάνεται η ευαισθησία της PCR → πολλαπλασιάζεται ήδη πολλαπλασιασμένο τμήμα DNA

Multiplex PCR αρχή: χρησιμοποιούνται δυο ή και παραπάνω ζεύγη primers για να πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα (στην ίδια αντίδραση) δυο ή παραπάνω ανεξάρτητα τμήματα DNA - στόχων του ίδιου ή διαφορετικού γενετικού υλικού παραλλαγή: Ποσοτική ή συναγωνιστική PCR: συγκρίνεται το προϊόν μιας PCR που ξεκινά από άγνωστη ποσότητα DNA - στόχου με το προϊόν της PCR που ξεκινά από γνωστή ποσότητα DNA - στόχου

RT-PCR (πολλαπλασιασμός του RNA) αρχή: 1η αντίδραση: RNA θ=37oC → cDNΑ (ένζυμο: ανάστροφη τρανσκριπτάση, RT) 2η αντίδραση: cDNA → μήτρα για PCR Σήμερα χρησιμοποιείται το ανασυνδυασμένο θερμοανθεκτικό ένζυμο Tth pol το οποίο σε θερμοκρασίες 55-75οC έχει: Δράση ανάστροφης πολυμεράσης παρουσία MnCI2 Δράση πολυμεράσης παρουσία MgCI2

RT-PCR πραγματικού χρόνου ( Real-time PCR) αρχή: Χρησιμοποιείται απαρχής ένας φθοριοσεσημασμένος ιχνηλάτης (probe) DNA ο οποίος όταν συνδεθεί με δίκλωνο DNA εκπέμπει φθορίζουσα ακτινοβολία (μετράται σε ειδικό μηχάνημα) σε ποσότητα ανάλογη του παραγομένου προϊόντος της PCR πλεονέκτημα: Ποσοτική μέθοδος ευκολόχρηστη, φθηνή και ευαίσθητη

Μικροσυστοιχίες DNA Το DNA chip αποτελείται από DNA ανιχνευτές. χρωστική και προστίθεται στο τσιπ. Ο υβριδισμός του ανιχνευτή με το DNA του δείγματος ανιχνεύεται από το φθορισμό.

16S RNA Εκχύλιση DNA από το βιολογικό δείγμα ή αποικία PCR με εκκινητές που στοχεύουν στο 16S rRNA Άμεση αλληλούχιση του προϊόντος Σύγκριση της αλληλουχίας με γνωστές αλληλουχίες που βρίσκονται σε βάσεις δεδομένων για την ταυτοποίηση του μικροβίου Ιδιαίτερα χρήσιμη τεχνολογία σε «στείρες» καλλιέργειες και σε περιπτώσεις που η ταυτοποίηση ενός μικροβίου δεν είναι αξιόπιστη