Άσκηση 4 Πηγή ενέργειας για τη μυϊκή σύσπαση. Α: Γλυκογόνο Β: Τα φωσφογόνα και οι κινάσες τους Γ: Μέτρηση της δραστικότητας της γαλακτικής αφυδρογονάσης

Πηγή ενέργειας για τη μυϊκή σύσπαση

Α΄Μέτρηση του γλυκογόνου του μυός Κάματος, 3 λεπτά: 0.1-1 msec, 2-4 Hz, 5-10 V Επαναφορά, 30sec: 40msec, 1Hz, 5-10V

Α΄Μέτρηση του γλυκογόνου του μυός 1 Α΄Μέτρηση του γλυκογόνου του μυός 1. Τοποθετούμε τους δύο μύες σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν 2ml 30% (w/v) ΚΟΗ. (Μην ξεχάσετε να σημειώσετε πάνω στους σωλήνες ποιος είναι ο διεγερμένος και ποιος ο μη διεγερμένος μυς). 2. Τοποθετούμε τους σωλήνες σε υδατόλουτρο που βράζει και τους αφήνουμε εκεί, μέχρις ότου διαλυθεί ο ιστός (περίπου 20 λεπτά). Αφού ψύξουμε τους σωλήνες για 4-5 λεπτά σε πάγο, κατακρημνίζουμε το γλυκογόνο του εκχυλίσματος των μυών με προσθήκη 4ml 95% αλκοόλης στον κάθε σωλήνα. Θερμαίνουμε τους σωλήνες μέχρι να βράσουν (περίπου 5 λεπτά) και μετά τους ψύχουμε σε πάγο. 3. Φυγοκεντρούμε για 10 λεπτά στις 3000 στροφές/λεπτό και απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Αναστρέφουμε τους σωλήνες για να απομακρυνθεί το υπερκείμενο και από τα τοιχώματα των σωλήνων. Προσθέτουμε 1ml 1N H2SO4 στο ίζημα κάθε σωλήνα και το υδρολύουμε με θέρμανση στο υδατόλουτρο για 30 λεπτά ακριβώς. 4. Εξουδετερώνουμε τα υδρολύματα με 6Ν και 0,5 N NaOH (σημειώστε τους όγκους). Στα υδρολυμένα εκχυλίσματα των μυών, που προέκυψαν από την παραπάνω κατεργασία, προσδιορίζουμε τη συγκέντρωση της γλυκόζης με τη μέθοδο της οξειδάσης

Α΄Μέτρηση της γλυκόζης (του γλυκογόνου) Επαναδιάλυση του ιζήματος σε 1ml Η2Ο Διάσπαση του γλυκογόνου και ανίχνευση της γλυκόζης, παρουσία του αντιδραστηρίου της ανθρόνης (όπως στη άσκηση 5) Σωλήνες/ Διαλύματα (ml) 1 2 3 4 Η2Ο 0,05 Πρότυπο δμα γλυκόζης (2mg/ml) Μη διεγερμένος Διεγερμένος Ανθρόνη

Α΄Υπολογισμός του γλυκογόνου Από τη φωτομέτρηση, υπολογίστε τη γλυκόζη που υπάρχει στα 0.05ml και μετατρέψτε την σε γλυκογόνο, πολλαπλασιάζοντας με 0.9. Στη συνέχεια, υπολογίστε το γλυκογόνο στο συνολικό όγκο επαναδιάλυσης (1ml). Εφόσον στο 1ml έχει επαναδιαλυθεί το περιεχόμενο ολόκληρου του ιστού, βάρους 1gr, το αποτέλεσμα του τελευταίου υπολογισμού εκφράζεται σε μg γλυκογόνου/gr ιστού

Β΄ Μέτρηση της δραστικότητας των φωσφοκινασών MgATP + H2O → MgADP + Pi + H+

Μέτρηση της δραστικότητας των φωσφοκινασών Εκχύλισμα: Σ=σπονδυλωτό

Μέτρηση της δραστικότητας των φωσφοκινασών Εκχύλισμα: Α=ασπόνδυλο Επώαση, τερματισμός της αντίδρασης με προσθήκη TCA (0,1 ml) Vολ????= 1.5ml

Β’ Μέρος: Μέτρηση της δραστικότητας των φωσφοκινασών Διαλύματα (ml) α’1 α’2 α’3 α’4 α’5 α’6 α’7 Δείγμα 0,5 - Η2Ο 1,5 2,0 Ασκορβ. Οξύ (0,9%) 1,0 Μολυβδ. Αμμ. (2%) 3,5Ν Η2SΟ4 Μεταφορά με μια πιπέττα: «δείγμα» α1, α2,α4, α5, α6, α3 ODδείγμ= α3-α2-α1, α6-α4-α5 Αποτελέσματα Δείγμα β1’ β2’ β3’ β4’ β5’ β6’ β7’ OD 0,039 0,203 0,302 0,026 0,217 0,72 ODδείγμ= β3-β2-β1, β6-β4-β5

Β΄ Υπολογισμοί Υπολογισμοί με βάση τη πρότυπη καμπύλη φωσφορικών για την οποία χρησιμοποιείτε διάλυμα Κ2ΗΡΟ4 αρχικής συγκέντρωσης 1,25mM (γράφημα OD/μmoles) Από την ODδειγμ (που προέκυψε από την αφαίρεση των OD των μαρτύρων) και την πρότυπη προκύπτει η ποσότητα (μmoles) των φωσφορικών στον όγκο δείγματος που χρησιμοποιήθηκε στη φωτομέτρηση (0.5ml). Υπολογίστε την ποσότητα φωσφορικών στο συνολικό όγκο της αντίδρασης (1.5ml). Η ποσότητα αυτή έχει προέλθει από τη δραστικότητα ενζύμου που βρίσκεται σε 0.05ml εκχυλίσματος. Με βάση την προετοιμασία του εκχυλίσματος (1:10 w/v για το σπονδυλωτό και 1:20 w/v για το ασπόνδυλο), υπολογίστε την ποσότητα των φωσφορικών στον όγκο που αντιστοιχεί σε 1gr ιστού. Διαιρώντας με τον συνολικό χρόνο (20min), της αντίδρασης, έχετε το τελικό αποτέλεσμα : μmoles φωσφορικών /gr ιστού min

Γ΄Μέτρηση της δραστικότητας της γαλακτικής αφυδρογονάσης

Μέτρηση της δραστικότητας της γαλακτικής αφυδρογονάσης

Μέτρηση της δραστικότητας της γαλακτικής αφυδρογονάσης Θα εξεταστούν 2 (3) διαφορετικοί όγκοι ομογενοποιήματος καρδιάς και μηριαίου βατράχου. Οι αντιδράσεις θα πραγματοποιηθούν σε κυψελίδες φωτομέτρησης Υπολογισμοί με βάση το συντελεστή μοριακής απορρόφησης του NADH: 6.22×103 Μ-1 cm-1

Μέτρηση της δραστικότητας της γαλακτικής αφυδρογονάσης 2 ml Προσθήκη ομογενοποιήματος 50λ, 50λ, 100λ, 150λ στις κυψελίδες 1, 2, 3, 4 αντίστοιχα και καταγραφή της απορρόφησης κάθε ένα λεπτό για πέντε λεπτά.

Πίνακας καταγραφής της οπτικής πυκνότητας για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της γαλακτικής αφυδρογονάσης OD Κυψελίδα 1 2 3 4 Χωρίς ομογενοποίημα Με ομογενοποίημα 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’

Γ΄ Υπολογισμός δραστικότητας γαλακτικής αφυδρογονάσης ΔOD/min Vκυψελ. μmoles/g.min= --------- x -------- x αραίωση 6.22 Vδείγμ. Να κατασκευαστούν 2 γραφήματα, ένα για το ομογενοποίημα καρδιάς και ένα για τον μηριαίο. Σε κάθε γράφημα, πρέπει να αποτυπώνεται η αλλαγή της OD στη διάρκεια του πειράματος για κάθε κυψελίδα. Από το γράφημα, υπολογίστε τη μεταβολή της OD (ΔOD/min) για κάθε όγκο (ή κυψελίδα) αγνοώντας τα οριζόντια τμήματα που (ίσως) θα προκύψουν. (Η μεταβολή ΔOD/min και ο όγκος είναι ποσά ανάλογα, γεγονός που πρέπει να αποτυπωθεί σε ένα διακριτό γράφημα) Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τον τύπο, υπολογίστε τη δραστικότητα για κάθε όγκο –χωριστά- αλλάζοντας ανάλογα και τα μεγέθη «Vκυψελ.», «Vδείγμ.» Τέλος, ο μέσος όρος των τριών τιμών δραστικότητας (για κάθε ιστό) που προκύπτουν από τον προηγούμενο υπολογισμό είναι το τελικό αποτέλεσμα.