Ασκηση 3 Ηλεκτροφόρηση DNA

Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μορίων νουκλεικών οξέων ή πρωτεινών που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος, το ηλεκτρικό φορτίο ή άλλες φυσικές ιδιότητες.

Η ηλεκτροφόρηση DNA διαχωρίζει μακρομόρια με βάση την ταχύτητα με την οποία κινούνται μέσα σε πήκτωμα πολυμερούς στο οποίο εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο

Η ηλεκτροφόρηση DNA γίνεται σε πήκτωμα αγαρόζης Ζυγιση αγαρόζης πχ 1 g για παρασκευή 1% gel σε 100 ml ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης

Διάλυση της αγαρόζης με θέρμανση (φούρνος μικροκυμάτων) Σχηματισμός πηκτώματος (gel) σε ειδικό καλούπι στην συσκευή ηλεκτροφόρησης

Τοποθέτηση «χτενιού» (comb) για την δημιουργία εσωχών στο πήκτωμα (πηγαδάκια ή wells) όπου θα γίνει προσθήκη των δειγμάτων

Διάλυμα φόρτωσης DNA (loading buffer): ένα διάλυμα με χρωστικές που προστίθεται στα δείγματα DNA για να τους προσδώσει χρώμα (συνήθως μπλε από την χρωστική bromophenol blue) για την παρακολούθηση της μετακίνησης των δειγμάτων και γλυκερόλη για μεγαλύτερο ιξώδες (για να παραμένουν τα δείγματα στον πάτο της εσοχής) Η χρωστική διευκολύνει την τοποθέτηση δείγματος («φόρτωση») στα πηγαδάκια του πηκτώματος

Η απόσταση που διανύει ένα μόριο DNA είναι αντιστρόφως ανάλογη προς το μήκος του. Το μίγμα των ηλεκτροφορούμενων μορίων DNA διαχωρίζεται σε ζώνες που η καθεμία περιέχει ισομήκη μόρια DNA.

Κάθε δείγμα (μίγμα μορίων DNA) τοποθετείται σε χωριστή θέση κοντά στο ένα άκρο της πλάκας του πηκτώματος Το πήκτωμα τοποθετείται σε πλαστική βάση και βυθίζεται στο υδατικό διάλυμα μίας δεξαμενής που σε κάθε άκρο της φέρει ηλεκτρόδια Όταν κλείσει το κύκλωμα , τα αρνητικά φορτισμένα μόρια DNA κινούνται προς το θετικό ηλεκτρόδιο Τα μόρια μικρότερου μήκους κινούνται ταχύτερα από τα μόρια μεγαλύτερου μήκους. Έτσι τα κλάσματα DNA διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος τους Η ηλεκτροφόρηση ορίζεται για συγκεκριμένο χρόνο πχ 1 ώρα Στο τέλος τα μόρια DNA διαχωρίζονται και καταλαμβάνουν συγκεκριμένες θέσεις στο πήκτωμα (ζώνες) που εμφανίζονται έπειτα από έκθεση σε UV ακτινοβολία

Συσκευή ηλεκτροφόρησης και σχηματισμός ζωνών DNA διαφορετικού μεγέθους Συσκευή ηλεκτροφόρησης και σχηματισμός ζωνών DNA διαφορετικού μεγέθους. Στην στήλη S (standard) έχει φορτωθεί και έχει «τρέξει» ένα μίγμα μορίων DNA γνωστού μεγέθους σε Kb (κλίμακα DNA) ως πρότυπο.

BIOΛOΓIA TΩN MIKPOOPΓANIΣMΩN – ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

Εμφάνιση ζωνών DNA σε UV ακτινοβολία

Ηλεκτροφόρηση γονιδιωματικού DNA που εκχυλίστηκε από αίμα (η πρώτη στήλη είναι ο μάρτυρας)

Με την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα κατά την ανάλυση θραυσμάτων περιορισμού μπορούμε να διαχωρίσουμε μόρια DNA από γονιδιωματικό DNΑ

Παράδειγμα γενετικής ανάλυσης με ηλεκτροφόρηση DNA Η διάγνωση της μυικής δυστροφίας Duchenne περιλαμβάνει τον έλεγχο ελλειμμάτων και διπλασιασμών DNA με PCR Χρησιμοποιούνται εκκινητές (primers) που ενισχύουν διαφορετικές περιοχές του γονιδίου σε μία μόνο αντίδραση Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των προιόντων PCR ώστε να εντοπιστούν ζώνες μη φυσιολογικού μήκους ή ζώνες που απουσιάζουν

H πρώτη στήλη είναι μία κλίμακα DNA (marker) Στο δεύτερο δείγμα (Ν) φαίνονται τα εννέα προιόντα (ζώνες DNA) που προκύπτουν από την PCR σε άτομο ελέγχου Από τον ασθενή 1(δείγμα P1) λείπουν οι ζώνες e και f γεγονός που υποδηλώνει ένα έλλειμμα που περιλαμβάνει τα εξόνια 45 ως 48. Από τον ασθενή 2 (δείγμα Ρ2) λείπουν οι ζώνες f και h γεγονός που υποδηλώνει ένα έλλειμμα που περιλαμβάνει τα εξόνια 48 ως 51. Από τον ασθενή 3 (δείγμα Ρ3) λείπει η ζώνη d γεγονός που υποδηλώνει ένα έλλειμμα που περιλαμβάνει τo εξόνιo 44. Εικόνα 12.21, σελ. 438 από το βιβλίο «Ιατρική Γενετική»