Izolovanje čiste kulture MO

Čista kultura: Poreklom od jedne ćelije Sve kolonije jednake veličine, boje, oblika Iste Gram reakcije

Gajenje mikroorganizama Inkubiranje u/na hranljivom medijumu Medijumi: tečni i čvrsti (hranljive podloge) Hranljive podloge: ploče (Petri šolja), kosi agar, duboki agar

DUBOKI AGAR KOSI AGAR

Čuvanje čiste kulture Nakon što smo izolovali neku kulturu MO neophodno je proveriti njene karakteristike, presejavanjem čime se potvrđuje morfologija kolonija, zatim ćemo je obojiti, ispitati biohemijske karakteristike, genetičke markere... Kada smo sigurni da smo izolovali čistu kulturu, čuvamo je ili na Petri šolji u frižideru (do 3 meseca), ili na niskim temperaturama, liofilizovanu...

Današnja vežba

DUBOKI AGAR KOSI AGAR Escherichia coli C600 Escherichia coli C600 (prekonoćna kultura) (prekonoćna kultura) Vaš simbol ☺☼♀♂♫♥ Vaš simbol ☺☼♀♂♫♥

Metoda išarane ploče (metoda iscrpljivanja) *Metoda zasnovana na tome da se broj nanešenih bakterija smanjuje sa svakim novim potezom eze, kako bi se nakon inkubacije izolovale pojedinačne kolonije.

IŠARANA PLOČA

Ne može se odrediti broj bakterija u uzorku!

Današnja vežba (metoda išarane ploče) Poklopac Dno Escherichia coli C600 (prekonocna kultura) Vaš simbol ☺☼♀♂♫♥

Metoda razređenja *Princip metode je da se broj MO u uzorku smanjuje pravljenjem serije razređenja kako bi se dobio prebrojiv broj kolonija/plaka po Petri šolji. 30 - 300 kolonija, 500 - 2000 plaka po Petri šolji pravljenje odgovarajućih razređenja ćelijskih suspenzija određuje se br. isključivo živih ćelija

Određivanje broja MO u kulturi DIREKTNA METODA→ prebrojavanje ćelija pod mikroskopom, brza, broje se i žive i mrtve ćelije INDIREKTNA METODA→ prebrojavanje kolonija ili plaka na Petri šolji, neophodna je inkubacija 24-72h, boje se samo žive ćelije N

Metoda razređenja broj ćelija/ml = broj kol.(plaka) / (r*V) r- razređenje V- zapremina uzorka (0,1 ml)

broj ćelija/ml = broj kol.(plaka) / (r*V) Metoda razređenja Broj ćelija/ml u prekonoćnoj kulturi = 109 Br.kolonija na P. šolji = 30-300 (100=102) V=0,1=10-1 broj ćelija/ml = broj kol.(plaka) / (r*V) 109 = 102/r*10-1 r = 102/ 109 *10-1 =10-6

PARNA RAZBLAŽENJA -2 -4 -6 10ml 10ml 100 100 0,1ml 0,1ml 10ml 10ml

PARNA RAZBLAŽENJA 0,01ml 0,01ml -2 -4 -6 1ml 1ml 1ml 1ml 100 1ml 100

NEPARNA RAZBLAŽENJA 0,1ml 1ml -5 -4 -2 10ml 10ml 100 10 10ml 10ml 9ml

NEPARNA RAZBLAŽENJA 0,01ml 0,1ml -2 -4 -5 1ml 1ml 1ml 1ml 100 0.9ml 10

UTRLJAVANJE 24h/37°C 0.1ml uzorka 100μl

Današnja vežba (metod razređenja)

1. 3. Escherichia coli C600 2. razblaženje -5 ,-6 -2 -4 -5 -6

4.

Metod išarane ploče samo iz -5 -6 Metod išarane ploče samo iz prekonoćne kulture! Metod razređenja samo -5, -6!