DNA – polymér zložený z opakujúcich sa jednotiek NUKLEOTID Základná stavebná jednotka DNA

Nukleotid: Dusíková báza – purín (adenín a guanín) – pyrimidín(cytozín a tymín – v DNA, uracil (namiesto tymínu – v RNA)   Cukor - (päťuhlíkový cukor) v DNA - 2 deoxyribóza v RNA - ribóza 3. Fosfátový zvyšok - H3PO4

Dusíková báza V DNA sú : A, T, G a C V RNA sú : A, U, G a C

Cukor v RNA – D ribóza v DNA - 2 deoxy D ribóza

KOMPLEMENTARITA BÁZ

KOMPLEMENTARITA BÁZ

Reťazce DNA sú antiparalelné Polarita voľné 5’-PO42- 3’-OH konce Antiparalelizmus DNA 5´-koniec 3´-koniec 3´-koniec 5´-koniec :::::: =deoxyribóza =fosfodieste- rová väzba malý žliabok veľký

D N A Kódujúce vlákno (sense strand) 5´ 3´ 5´ 3´ Komplementárne vlákno (template strand)

Dvojzávitnica DNA

Pravo a ľavo - točivá DNA

B Z

Rôzne formy DNA

Úlohy DNA Schopnosť zachovať genetickú informáciu Odovzdať genetickú informáciu potomstvu (dcérske bunky) Vytvárať kópie – replikácia Schopnosť mutovať – evolúcia Realizuje sa genetická informácia - proteosyntéza

REPLIKÁCIA DNA Zdvojenie DNA Prenos genetickej informácie z rodičovských organizmov na potomstvo Vzhľadom na dĺžku DNA v bunke trvá niekoľko hodín ( živočíšna DNA sa zreplikuje asi za 8 hod s 2 chybami) Uskutočňuje na približne 400 miestach v jadre naraz

Semikonzervatívna = semidiskontinuálna materské reťazce dcérske reťazce ku každému z pôvodných vlákien DNA sa nasyntetizuje nové vlákno

Tvorba nového reťazca podľa pravidiel komplementarity C-G A-T

Fázy replikácie Iniciácia - začatie Elongácia - predlžovanie Terminácia - ukončenie

Topoizomeráza

helikázy – rozpletenie reťazcov

ssb proteíny – udržujú DNA v jednovláknovom stave 3' 5' dsDNA-binding proteins ssDNA- binding protein(s)

Iniciácia, začína v bode ORI U človeka je asi 100 000 miest dna A, B, C proteíny

Replikačná vidlica

Smer pohybu v replikačnej bubline

DNA polymeráza hlavný enzým zodpovedný za predlžovanie reťazca DNA chybovosť 1 / 107

Polymeráza má aj exonukleázovú aktivitu

DIMÉR Katalytické jadro polymerázy α + ε + θ β svorka- posúva sa za katalytickým jadrom a drží pohromade materský a dcérsky reťazec (sama sa nenapojí) γ komplex - nakladá β svorky na DNA v mieste, kde sú RNA primery

Orientácia DNA reťazcov vedúce vlákno oneskorené (zaostávajúce)vlákno

Primozóm = dna A,B,C proteíny + RNA primáza (tvorí primer) komplex 6 proteínov potrebných pre syntézu primeru (3-6 nukleotidov) na 5´konci DNA vlákna Primáza - robí chyby, nemá exonukleázovú aktivitu (nevadí)

DNA ligáza – spájanie reťazcov

Iniciácia RNA primer

Elongácia DNA Polymeráza III

Iniciácia a funkčné elementy potrebné pre začatie replikácie eukaryotickej DNA ORC ORC - origin recognition complex ORC

Prebieha v telomérach, za pomoci TELOMERÁZY Doreplikovanie medzery = dokončenie syntézy dcérskych reťazcov Prebieha v telomérach, za pomoci TELOMERÁZY

GÉN základná funkčná genetická jednotka Gén predstavuje kompletnú sekvenciu nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA), ktorá nesie informáciu pre syntézu určitého produktu (funkčnej RNA alebo proteínu). 1. Gén pre funkčnú RNA – DNA úseky - kódujú primárnu štruktúru rRNA a tRNA 2. Gén ako regulačná oblasť – úsek DNA alebo RNA (u RNA vírusov) – plní regulačnú funkciu. – rozpoznávaný špecif. proteínom – napojenie signalizuje zahájenie alebo zastavenie transkripcie – gén nemá produkt 3. Štruktúrny gén - úsek DNA – obsahuje informáciu o  primárnej štruktúre proteínu

Centrálna dogma molekulovej biológie transkripcia translácia DNA ⇨ RNA ⇨ protein   Watson a Crick 1959

Pozmenenie centrálnej dogmy molekulovej biológie Temin a Baltimore 1973 Reverzná transkriptáza

TRANSKRIPCIA Prepis genetickej informácie z DNA do mRNA Prebieha v jadre

Prokaryoty majú len jeden druh RNA-polymerázy, ktorá katalyzuje syntézu RNA zo všetkých génov. Eukaryoty naopak používajú viacero typov RNA-polymeráz, ktoré zabezpečujú transkripciu z rôznych génových skupín.

Iniciácia Promótor rozpozná σ-faktor proteínová podjednotka RNA-polymerázy polymeráza začne odvíjať DNA - TATA box

Elongácia Transkripcia začína štartovacím kodónom ATG označuje sa +1. Pozícia na sekvencii DNA, ktorý sa nachádza pred týmto nukleotidom, má záporné číslovanie, 0 neexistuje Vytvára sa dočasný hybrid DNA - RNA RNA sa oddeľuje od DNA

terminácia rho nezávislá rho závislá

Iniciácia transkripcie eukaryotických génov RNA polymeráza II potrebuje transkripčné faktory (evolučne konzervované), aby dokázala nasadnúť na promótor

Iniciácia transkripcie

hnRNA ⇨mRNA Vytvorenie čiapočky (cap) Posttranskripčná úprava pred 5' UTR oblasť pripojí 5'-5' väzbou guanozín chráni molekulu z tejto strany uľahčuje jej naviazanie na ribozóm.

2. Vyštiepenie intrónov (splicing) Enzymaticky sa vystrihnú kópie intrónov a ligázou sa pospájajú exóny.

Splicing eukaryotického génu

Malé RNA človeka Druh malej RNA výskyt funkcia syntetizujúci enzým U1 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U2 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U4 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U5 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U6 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza III U7 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II histónovej hnRNA U11 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U12 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II 7SK snRNA jadro neznáma RNA polymeráza III 8-2 snRNA jadro úprava pre-tRNA RNA polymeráza III U3 snoRNA jadierko úprava pre-tRNA RNA polymeráza II U8 snoRNA jadierko úprava pre-rRNA RNA polymeráza II U13 snoRNA jadierko neznáma RNA polymeráza II 7SI scRNA cytoplazma translokácia proteínov RNA polymeráza III

3. Tvorba chvostíka ( 3' koniec) poly(A)polymeráza za 3' UTR nasyntetizuje 250 adenínov medzi každý 10 adenín sa včlení bielkovina mRNA pre históny nemá polyA chvost Funkcia: stabilizácia ochrana 3´ pred účinkom degradačných enzýmov

TRANSLÁCIA Preklad genetickej informácie z mRNA do poradia AK Prebieha v cytoplazme na ribozómoch

16 S rRNA

rRNA sa syntetizuje v jadierku - RNA polymeráza I. NOR – oblasť organizácie jadierka Gény pre rRNA – akrocentr. chromoz. D a G v oblasti satelitov Prekurzorová rRNA 45 S + metylácia + bielkoviny = stabilita 45 S ⇨ 28S , 18 S a 5,8 S rRNA Prechádzajú cez jadrové póry (20nm) 5,8 S 5 min 28 S 30 min

5S rRNA - RNA polymeráza III. Small RNA genes 5S rRNA - RNA polymeráza III.

akceptorové rameno (bez slučky) - na jeho koniec sa viaže aminokyselina antikodónové rameno s antikodónovou slučkou - týmto koncom tRNA rozoznáva genetický kód zapísaný v mRNA pseudouridínové rameno s TΨC-slučkou - obsahuje modifikovaný uracil - pseudouracil dihydrouridínové rameno s D-slučkou- obsahuje modifikovaný uracil - dihydrouracil variabilná slučka - môže byť krátka alebo dlhá neovplyvňuje biologickú funkciu tRNA

typ polymerázy výskyt funkcia RNA-polymeráza I jadierko transkribuje gény pre rRNA RNA-polymeráza II jadro transkribuje štruktúrne gény a gény pre niektoré malé RNA RNA-polymeráza III jadro transkribuje gény pre tRNA, 5S-rRNA a niektoré malé RNA

Fázy translácie Aktivácia aminokyselín – AK+tRNA Iniciácia Elongácia Terminácia

prediniciačný komplex Met tRNA translačný komplex ternárny komplex prediniciačný komplex iniciačný komplex

Miesta na ribozóme A – aminokyselinové AK + tRNA P – peptidové peptidyltransferáza E - odchod bielkovín R - odchod tRNA

Terminácia Prok. termináciu riadia terminačné faktory RF1 až RF3. U eukar je uvoľňovací faktor eRF rozpozná jeden zo STOP kodónov a uvoľní polypeptidový reťazec

Prokaryotická Eukaryotická proteosyntéza Jadrová membrána Neprítomná Prítomná Promótor GACA box (-35) TATA box (Pribnowov box) (-10) GC-box (-90) CAAT-box (-80) TATA-box (Hognessov box) (-35) RNA polymeráza Jedna I. – III. Translácia iniciovaná Shine-Dalgarnov box 5’ cap Prvý kodón fMet Met Polycistronická (viac génov) Monocistronická (jeden gén) Gén 1 Gén 2 Gén 3 dlhá mRNA Gén mRNA

Spôsoby získavania biologického materiálu venepunkcia biopsia nekropsia stery filtrácia

SKLADOVANIE BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU USKLADNENIE - krátkodobé (chladničky a mrazničky) suspenzné bakteriálne kultúry, bakt. na platni, tkanivové kultúry, vysušená DNA ZÁLOHOVANIE - zlyhanie analýzy (mrazničky – 20 oC) tkanivá, rozpustená DNA , enzýmy ARCHIVÁCIA (hĺbkové mrazničky – 80 oC, paraf. bločky tekutý dusík – 160 oC ) - súdne lekárstvo - retrospektívna analýza - nové diagnostické metódy

HOMOGENIZÁCIA 1. mechanická 2. fyzikálna 3. chemická ‑ trecie misky ‑ homogenizátor ‑ pretlačenie cez otvor 2. fyzikálna  ‑ ultrasonikácia ‑ zmrazovanie a rozmrazovanie ‑ hypotonizácia 3. chemická   ‑ detergenty ‑ enzymatické natrávenie

GAATTC CTTAAG Restrikčné enzýmy Restrikčné endonukleázy, restriktázy Rozpoznávajú PALINDRÓM GAATTC CTTAAG 5’  3’ 3’  5’ štiepia špecificky 2 vláknovú DNA

Štiepenie DNA restrikčnými enzýmami TUPÉ KONCE LEPIVÉ KONCE

Gél po ukončení elektroforézy Gélová elektroforéza Rýchlosť pohybu molekúl závisí od: Rozmerov molekúl DNA Zmes DNA molekúl rozličných veľkostí Zdroj prúdu Gél Sklené platne Dlhšie molekuly Kratšie Gél po ukončení elektroforézy

Rýchlosť pohybu molekúl závisí od: Koncentrácie gélu Konformácie DNA Veľkosti elektrického napätia Zloženia roztokov Teploty

Elektroforetická kontrola dobre vyizolovanej DNA

po dokončení elfo sa veľkosti fragmentov DNA stanovujú pomocou fragmentov známej dĺžky - veľkostných štandardov

METÓDY MOLEKULOVEJ BIOLÓGIE A ICH VYUŽITIE PCR VNTR Sekvenovanie RFLP Fingerprint FISH

Polymerázová reťazová reakcia PCR skúmavky Teplotný cyklovač Na uskutočnenie PCR je treba mať: PCR skúmavky Teplotný cyklovač Reakčná zmes templátová DNA PCR primery dNTP Taq polymeráza (150 nukl./s) reakčný roztok

C Y K L U S 1. Denaturácia teplom ( 94-96ºC) 2. Naviazanie primerov (50-65ºC) 3. Syntéza DNA ( 70-72ºC) 4. Postup sa opakuje po 30 cykloch vzniká viac ako milión kópií

VNTR - (variabilný počet tandemových opakovaní) pomocou PCR ATTGGA- motív 14 9 4 dĺžka úseku DNA „alela“ príslušného VNTR systému

Alely sa prenášajú z rodičov na deti (1 alela od otca a 1 od matky)

STR - Short Tandem Repeat Používa sa od 90 tych rokov vo foréznej medicíne. Metóda využíva variabilitu pri opakovaní krátkých sekvencií nukleotidov v určitých úsekoch DNA. Metóda STR polymorfizmov Aby bola dosiahnutá vysoká rozlišovacia schopnosť, je vyšetrovaných viacej STR polymorfizmov zároveň.

Sekvenovanie DNA - určenie presného poradia nukleotidov v DNA 1. Sangerova metóda (r. 1975) 2. Maxamova-Gilbertova metóda (r. 1977) 3. Automatické sekvenátory (r. 1995)

Sangerova metóda sekvenovania Princípom - klasická PCR Ale! - pri syntéze dôjde k náhodnému zastaveniu dideoxyribonukleozidtrifosfáty – ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP nemôže naviazať ďalší deoxyribonukleotid vznikajú tak nedokončené úseky s rôznou dĺžkou - oddelenie pomocou elektroforézy

Fluorescenčná in situ hybridizácia

Typy sond pre FISH: 1. Centromerické

2. Génové (lokusovo špecifické)

3. Celochromozómové („paintingové“)

typy polymorfizmu DNA bodový polymorfizmus hypervariabilné oblasti DNA   typy polymorfizmu DNA - majú odlišný molekulový základ bodový polymorfizmus (RFLP, Sekvenovanie) hypervariabilné oblasti DNA (RFLP, Fingerprint, VNTR, STR)

Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

1. izolácia DNA

2. štiepenie DNA jedným restrikčným enzýmom

3. Rozdelenie DNA fragmentov v elektroforéze Fragmenty v géli sú stále dvojvláknové

4. Denaturácia DNA fragmentov Chemická denaturácia - pH 12 5. Neutralizácia Fragmenty zostanú jednovláknové 6. Southernov blotting Prenos fragmentov DNA z gélu na membránu (nylonová, nitrocelulózová) – kapilárna elevácia

6. Southernov blotting

7. Fixácia DNA v membráne 8. Príprava sondy Vákuová sušička 2 hod. pri 80 oC 8. Príprava sondy Jednovláknový úsek DNA - rádioaktívne značená

9. Hybridizácia DNA zo spermií lososa

10. Autorádiografia a vyvolanie RTG filmu 11. Vyhodnotenie výsledkov

Kosáčiková anémia 146 AK v β-globínovom reťazci hemoglobínu substitučná mutácia – zámena adenínu za tymín v 6. AK: A : CCT GAG GAG Pro Glu Glu S : CCT GTG GAG Pro Val Glu

Kosáčiková anémia metódou RFLP A S

Fingerprint Prof. Alec Jeffreys - 1984

Prípad 1 Prípad 2 1 2 3 5 6 7 8 9 1 2 3 4

Možnosti využitia Diagnostika genetických (monogénnych aj multifaktoriálnych) a nádorových ochorení Génová terapia (genetických a nádorových ochorení) Cielená liečba („molekulárna farmakológia“) Štúdium biologických funkcií na molekulárnej úrovni (diferenciácia, starnutie ...) Evolúcia človeka a pôvod ľudských populácií Podstatný krok - poznanie biológie nášho druhu!