Molekulárny aspekt monogénnych ochorení Typy mutácií, zapríčiňujúcich monogénne ochorenia Mutácie v kódujúcich sekvenciách model: Hb varianty Mutácie v nekódujúcich sekvenciách model: talasémie Nomenklatúra lokusov, alel a mutácií Lokusová a alelová heterogenita monogénnych ochorení

Typy mutácií Triedenie mutácií s patogénnym efektom podľa zmeny na úrovni DNA podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu podľa dôsledkov na funkciu polypeptidu podľa miesta lokalizácie 1. podľa zmeny na úrovni DNA substitúcie tranzícia - purín > purín alebo pirimidín > pirimidín transverzia – purín pirimidín

najčastejšie tranzícia C > T (8,5 krát) CpG dinukleotid je mutačné „horúce miesto“ C > metylácia > metylcytozín > deaminácia > T ostatné: chyby pri replikácii a v oprave DNA delécie (rozsah 1 bp – desiatky Mb) delécie rozsahu 1 – niekoľko bp často vznikajú v repetitívnych sekvenciách (strand slippage) nehomologický crossing-over nehomologická výmena sesterských chromatíd duplikácie – v podstate sú opakom delécií aj spôsob vzniku duplikácia génu PMP22 – Charcot-Marie-Tooth sy. delécia génu PMP22 – myopatia HNPP

expanzie – zmnoženie krátkej sekvencie o niekoľko desiatok až stovák najčastejšie trinukleotidu (napr CAG pri Huntingtonovej chorei normálna variabilita: do 27 opakovaní premutácia (instabilita): 27 – 34 opakovaní variabilná penetrancia: 35 – 39 opakovaní mutácia (patológia). nad 39 opakovaní inzercie prerušenie génu inou DNA sekvenciou najčastejšie sú to transpozabilné elementy (nspr. L1 pri hemofílii A)

inverzie – otočenie úseku DNA v dôsledku intrachromozomálnej rekombinácie dôsledkom je prerušenie génu (50 % prípadov ťažkej HA je zapríčinených inverziou) fúzované (hybridné) gény vznik – nehomologický crossing-over - translokácia chromozómov t(9;22) > BCR/ABL > chronická myeloidná leukémia génová konverzia – je nerecipročný prenos sekvenčnej informácie z donorovej sekvencie na akceptorovú sekvenciu najčastejšie z nefunkčného pseudogénu na fukčný gén dôsledok – vyradenie funkčného génu napr SMN1 > SMN2 > spinálna svalová atrofia

UGC (cysteín) (degenerácia kódu) UGU (cysteín) UAU (tyrozín) 2. podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu substitúcie sa delia: nemé (silent): - nedochádza zámena aminokyseliny meniace zmysel (missense): zámena aminokyseliny nezmyselné (nonsense): vzniká STOP kodón UGC (cysteín) (degenerácia kódu) UGU (cysteín) UAU (tyrozín) UGA (STOP) všeobecne: STOP mutácie sú závažné závažnosť missenese mut. závisí od toho či postihujú funkčne dôležité domény aj silent mutácie môžu mať patologický dopad (aktivácia kriptického zostrihového miesta)

2. podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu - pokr. posunové mutácie (frame-shift) úpĺne zmenená sekvencia polypeptidu od bodu mutácie najčastejšie sa však vytvorí STOP kodón závažný dopad na funkciu na úrovni DNA sú to predovšetkým malé delécia a inzercie, ktoré nie sú násobkom 3 (kodónu) pridanie nových aminokyselín do polypeptidu inzercie násobku 3 bp expanzie: napr. „CAG“ kódujúci glutamín u Huntingtonovej chorei

3. podľa dôsledkov na funkciu polypeptidu. Z hladiska patológie dôležitý je vplyv na funkciu polypeptidu a nie zmena na úrovni DNA znížená až nulová funkcia (loss-of-function) nová (abnormálna) funkcia (gain-of-function) a) loss-of-function môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.) najčastejšie sú recesívne (nie je dôležité presné množstvo produktu, napr. enzýmy – 50 % akt. haploinsuficiencia – polovičná dávka nestačí dominantný negatívny efekt – nefunkčný polypeptid blokuje produkt normálnej alely všetky typy zmien na úrovni DNA môžu viesť k „loss-of-function“

a) loss-of-function – pokr. všeobecne: missense mut., duplikácie, delécia a inzercie neporuš. čítací rámec zachovajú urč. reziduálnu funkciu veľké prestavby (delécie, inzercie, inverzie), STOP mut. úplne eliminujú funkciu alely prevažná väčšina mutácií je tohto typu gain-of-function zmenený polypeptid získa novú funkciu môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.) väčšinou sú to špecifické zmeny na DNA úrovni (exp. CAG, hybridný gén) mutácia je charakteristická pre dané ochorenie (HD, CML) nový fenotyp je dominantný v tom istom géne sa môže vyskytnúť mut.“loss-of-function“ (delécia PMP22 u HNPP) aj „gain-of-function“ (duplikácia u CMT)

4. podľa miesta lokalizácie v kódujúcich sekvenciách v nekódujúcich sekvenciách b) mutácie v nekódujúcich sekvenciách s patogénnym dopadom mut. vedúce k nesprávnemu zostrihu priamo v zostrihových miestach (splice site m.) v donorovej sekv. (GT) > prepis intrónu do mRNA v akceptorovej sekv. (AG) > delécia prísl. exónu v intrónoch > aktivácia kriptického zostr. miesta aj nemá mutácia v exóne môže viesť k aktivácii kript. zostrihového miesta > strata/získanie kódujúcej sekvencie

mut. v regulačných sekvenciách na na 5’ konci v TATA-, CAAT-boxe, v iných oblastiach promótora, v enhanceroch – ovplyvňujú rýchlosť transkripcie > znížené množstvo produktu na 3’ konci mutácie poly(A) signálu – nestabilná mRNA

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man http://www. ncbi. nlm. nih

Nomenklatúra lokusov a alel Gény: skratka hlavnej funkcie alebo génového produktu (píšu sa kurzívou) HBA1 hemoglobín alfa, lokus 1 COL5A2 kolagén typ 5, alfa 2 polypeptid Pseudogény: symbol génu + „P“ (staršie označenie ψ) HBAP1 pseudogén globínového génu alfa 1 (alebo ψHBA1) ACTBP2 druhý pseudogén aktínového génu beta „Anonymné“ úseky DNA: symboly „D“ symboly: 1-22; X; Y – chromozóm N - na viacerých chromozómoch S - jednotková sekv. („single copy“) Z - repetítívna sekv. na jednom chromozóme F - repetítívna sekv. na viacerých chrom. („family“) - D14S63 - 63. identifikovaný úsek DNA na chromozóme 14 - DXS12 - 12. identifikovaný segment chromozómu X - DNF3 - 3. identifikovaná rodina repet. sekvencií na viacerých chromozómoch

Nomenklatúra mutácií Substitúcie aminokyselín: používajú sa jedno- alebo trojpísmenkové symboly X – znamená STOP kodón niekedy sa používa „p.“ , že sa jedná o polypeptid napr. p.R117H alebo Arg117His > substitúcia arginínu za histidín v pozícii 117 polypeptidu G542X > glycín v poz. 542 nahradený STOP kodónom Substitúcie nukleotidov: niekedy sa začína: „g.“ – pre genomickú sekvenciu „c.“ – pre cDNA A z iniciačného kodónu (ATG) je vždy +1 (báza pred ním je -1) číslovanie sa vzťahuje na „sense“ vlákno intróny sa označujú ako „IVS“ plus jeho číslo alebo pozíciou posledného nukleotidu v exóne plus („+“) pozícia subst. príklady: g.1162G >A – substitúcia guanínu za arginín v poz. 1162 genom. DNA g.621+1G >T alebo IVS4+1G >T – subst. guanínu za tymín v 1. pozícii intrónu 4

Nomenklatúra mutácií – pokr. delécie a inzercie: „del“ – skratka pre deléciu (staršie označenie „Δ“) „ins“ – skratka pre inzerciu delécia aminokyseliny: F508del (ΔF508) – delécia fenylalanínu v pozícii 508 delécia nukleotidu (nukleotidov) c.6232_6236del alebo 6232_6236delATAAG – delécia 5 nukleotidov (môžu byť špecifikované) počínajúc nt. 6232 z cDNA g.409_410insC – inzercia C medzi nt. 409 a 410 genómovej DNA „Základná www stránka: www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature

Globínové génové rodiny α a β kb Chromozóm 16 Chromozóm 11

Štruktúra globínových génov α-globínový gén chr. 16 β-globínový gén chr. 11

Expresia Hb génov v ontogenéze Hb molekula: Typy hemoglobínu embryonálny HbE = ζ2 ε2 fetálny HbF = α2 γ2 adultný typ A, HbA = α2 β2 adultný typ A2, HbA2 = α2δ2

Hemoglobinopatie: zmeny štruktúry alebo kvantity Hb reťazcov abnormálne hemoglobíny (zmena štruktúry) HbS: kosáčiková anémia beta-globínový gén Glu6Val HbC: Glu6Lys HbE: Glu26Lys HbD: Glu121Gln a niekoľko 100 ďalších príčinou je mutácia v kódujúcej sekvencii talasémie (väčšinou zmena intenzity syntézy) nulová tvorba Hb polypeptidu znížená tvorba Hb polypeptidu nevyvážená tvorba polypeptidov talasémie: alfa beta typy: „nula“ (α0 alebo β0) „plus“ (α+ alebo β+) príčinou je najčastejšie mutácia mimo kódujúcej sekvencie

Mutácia Glu6Val (E6V) v beta-globínovom géne a kosáčiková anémia Prvý dôkaz, že substitúcia nukleotidu vedie k substitúcii aminokyseliny v génovom produkte Normálne erytrocyty Kosáčikové erytrocyty (KE)

Mutácia Glu6Val (E6V) pleiotropia –jedna mutácia a viac fenotypových prejavov abnormálny Hb abnormálne erytrocyty (KE) rýchly rozpad KE zhlukovanie KE v cievach ukladanie KE v slezine anémia lokálne nedostatky v zásobovaní krvou celková slabosť zhorš. mentálne funkcie poškodenie srdca p. pľúc p. obličiek rozšírenie srdca zlyhanie srdca pneumónia zlyh. obličiek zväčš. slezina

Typy mutácií vedúcich k talasémii 1 Term. (skrátia Hb-reťazec) . . . 37 38 39 40 . . . pozícia AA . . .His Lys Tyr His . . normálny beta-reťazec . . CACAAGUAUCAC. . mRNA . . CACAAGUAA mRNA s mutáciou . . His Lys stop β0 -talasémia Term. (predĺžia reťazec) . . . . . . . .. . UAA (stop) C A G C Gln Lys Glu Ser + ďalšie AA C-S talasémia Hb Constant Spring

Typy mutácií vedúcich k talasémii 2 Frameshift . . . Ser Ile Thr Lys . . . normálny beta-reťazec . . AGU AUC AGU AAC . . mRNA del . . AGU AUC UAA stop . . Ser Ile koniec reťazca β0- talasémia Poruchy zostrihu (mutácie v akcept. a donor. signálnych sekv.) GT... ...AG beta-globínový gén .. . GTGGTTGGT.. ...GTGATTGGC.. β0 alebo β+ talasémie β0 β+

Typy mutácií vedúcich k talasémii 3 Vznik zostrihového signálu v intróne alebo v exóne GT.... TTGGTTC ..TTAG β-globínový gén v intróne: ..TTAGTTC.. nová akceptorová signál. sekvencia vystrihne sa ako intrón zostrih v intróne mRNA (obsahuje časť intrónu) β+ talasémia

Typy mutácií vedúcich k talasémii 4 Mutácie v 5´-signálnych sekvenciách (TATA box, CAAT box...) 5´. . . T A T A. . . . . .3 ´ . . TATG . . . zníženie intenzity transkripcie β+ talasémia Mutácie v poly-A signále (AATAAA) 5´. . . . AATAAA . . . 3´ norm. α- gén G nevznikne poly (A) znížená stabilita mRNA α+ talasémia

Typy mutácií vedúcich k talasémii 5 Delécie globínových génov (najmä u alfa-globínov) ζ ψζ ψα α2 α1 α-globínová rodina 5´. . ... 3´ Známe delécie (výber): αα -α3,7 -α4,2 - α5,2 --SEA --MED Stupeň závažnosti závisí od toho, koľko alfa-génov delécia vyradí a či je jedinec heterozygot alebo homozygot (4ά – zdravý, 3 ά – prenášač, 2 ά – mierna talasémia, 1 ά – stredne ťažká t., 0 ά – letálna talasémia

Typy mutácií vedúcich k talasémii 6 Mutácie v promotorovej oblasti: beta-globínový gén -116 -90 -75 „CAAT“ -30 „TATA“ I.exón 5´... CCTCACCCT . . CACACCCTA . . TTGGCCAATCT . ..GTATAAAAGT........... mutácie: T TG GGAG Dôsledok: rôzny stupeň redukcie množstva génového produktu →rôzne β+ talasémie Mutácie vo vzdialených sekvenciách („enhanceroch“): -16 kb . . . delécia ...... / / .......... βglobínová rodina bez mutácie Dôsledok: žiadna expresia génov! – chýba DCR – „dominant control region“ → β0 talasémia

Hemoglobinopatie: záver Veľká lokusová heterogenita Obrovská alelová heterogenita - často pri rovnakom fenotypovom (klinickom) prejave Väčšina mutácií s fenotypovým (klinickým) prejavom je priamo v géne alebo v jeho tesnej blízkosti (regulačné sekvencie): dôsledok pre génovú terapiu a transgenézu Model pre iné monogénne ochorenia